Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler og toksiske metabolitterIndholdsfortegnelse1 Introduktion 2 Beskrivelse af de økologiske habitater hvortil mikrobiologiske
bekæmpelsesorganismer kan applikeres og spredes 3 Mikrobiologisk bekæmpelse af plantepatogener 4 Naturligt forekommende mikroorganismers toksinproduktion i
planteproduktionen 5 Biologiske bekæmpelsesorganismers produktion af sekundære
metabolitter in vivo 6 Trichoderma harzianum´s økologi 7 Dokumentation baseret på litteratur og behov for yderligere
dokumentation baseret på eksperimentelt arbejde ForordMiljøstyrelsen, Klima- og Bioteknologikontoret, behandler ansøgninger om godkendelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler (jf. Miljøministeriets bekendtgørelse nr. 768 af 23.august 1994) og ønsker at udvide eksisterende viden om midlernes miljø- og sundhedsmæssige effekt. Miljøstyrelsen har kendskab til, at mange af mikroorganismerne i disse midler er i stand til at producere toksiske sekundære metabolitter (Lübeck, 1994), men ringe viden om de forhold hvorunder mikroorganismerne producerer stofferne samt stoffernes stabilitet og persistens. Denne rapport, der er udarbejdet på baggrund af et litteraturstudium, forventes at kunne være med til at danne grundlag for Miljøstyrelsens risikovurdering og acceptkriterier af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, der anvendes i spiselige afgrøder. Rapporten er udarbejdet af Forskningsadjunkt, cand. agro. Ph.D. Birgit Jensen, Institut for Plantebiologi, Sektion for Plantepatologi, Den Kongelige Veterinær- og Landbohøjskole i perioden 01.06.97-15.11.97. Projektet har været fulgt af en styringsgruppe med følgende medlemmer: Holger Pedersen, Miljøstyrelsen (formand) Jens Frisvad, Danmarks Tekniske Universitet Dan Funck Jensen, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole Birgit Jensen, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole SammendragBaggrund og afgrænsning Mange af de mikroorganismer, der anvendes i mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, producerer en række forskellige toksiske, sekundære metabolitter in vitro. Man har dog ringe viden om, under hvilke forhold og i hvilke mængder sådanne metabolitter eventuelt produceres under naturlige forhold in vivo. Tilstedeværelse af metabolitter som restkoncentrationer i/på planteprodukter må dog i høj grad antages at afhænge af anvendelsesmåden for plantebeskyttelsesmidlet samt af den producerende organismes økologi. Denne rapport tager derfor udgangspunkt i viden om den producerende organismes sprednings-, overlevelses- og etableringsevne i rodzone, fyllosfære og på efterhøstprodukter, idet det antages, at der kun produceres metabolitter, når organismen er aktiv. I Danmark må der på nuværende tidspunkt markedsføres 18 mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Ingen af disse midler er endnu godkendte, men er omfattet af overgangsordningen. Rapporten vil primært omhandle mikrobiologiske bekæmpelsesorganismer (MBO'er), der anvendes til bekæmpelse af sygdomme fremkaldt af plantepatogene mikroorganismer. Trichoderma harzianum, der indgår i flere af de markedsførte produkter, anvendes som eksempel i rapporten. Formål Formålet med projektet er at belyse, under hvilke miljøbetingelser der er risiko for at mikroorganismers metabolitproduktion kan udgøre en sundhedsmæssig risiko i spiselige afgrøder i forbindelse med udbringning af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Dette er tilstræbt ved at klarlægge den aktive organismes spredningsmuligheder, etablerings- og overlevelseevne i afgrøden i relation til anvendelsesmåden af midlet og økologiske parametre i henholdsvis jord/rodzone, fyllosfære og på afgrøder efter høst. Desuden vil forekomsten af naturlige populationer af toksinproducerende mikroorganismer blive belyst dels for at eksemplificere, hvorledes økologiske parametre påvirker disse organismers produktionen af sekundære metabolitter, og dels for at kunne vurdere den sundhedsmæssige risiko ved at indtage toksiner fra mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler set i relation til risikoen ved at indtage toksiner fra den naturligt forekommende mikrobiota. Naturligt forekommende mikrobiota Mikroorganismer forekommer naturligt på alle ferske planteprodukter til konsum så som frugt, grønsager og cerealier. Sammensætningen af den naturlige mikrobiota er bla. afhængig af dyrkningsforholdene, produkttype og lagerforhold. Blandt svampene er især arter indenfor for slægterne Cladosporium, Alternaria, Epicoccum, Aspergillus, Penicillium og Fusarium rigt repræsenteret. Blandt gærsvampene er det især Cryptococcus spp., Sporobolomyces spp. og Aureobasidium pullulans, der isoleres og indenfor bakterierne dominerer slægter som Pseudomonas, Xanthomonas, Chromobacterium og Klebsiella. Økologiske habitater De økologiske nicher som MBO'er applikeres direkte til, eller som organismen kan spredes til efter den primære applikation, nemlig jord/rodzone, fyllosfære og lagrede høstprodukter, giver meget forskel- ligartede muligheder for mikrobiel vækst. Jorden/rhizosfæren er karakteriseret af en meget divers og kvantitativt stor, naturligt forekommende saprofytisk mikroflora, hvor der konkurreres intensivt om nicher med tilgængelig næring, så som planterester og rodeksudater. Fyllosfæren er et meget dynamisk habitat, der generelt er karakteriseret af drastiske fluktuationer i temperatur og fugtighed, der kræver stor tilpasningsevne af mikroorganismerne. Tilgængelige næringskilder for saprofytisk vækst er dog stærkt begrænsede og ændres successivt i løbet af vækstsæsonen. Efterhøstmiljøet er mere stabilt og defineret med hensyn til klimaparametre og substrat. Frugt og grønsager lagres generelt bedst ved høj luftfugtighed og en lav temperatur, hvilket er afgørende for opretholdelse af kvaliteten generelt og for at hæmme udviklingen af efterhøst patogener. Cerealier lagres bedst med lavt vandindhold (ca. 13%), der ofte opnåes ved nedtørring. Under sådanne forhold vil vandaktiviteten i kernerne være så lav, at vækst af mikroorganismer er stærkt begrænset. Biologisk bekæmpelse Mikrobiologisk bekæmpelse af plantepatogener defineres i forbindelse med nærværende rapport som: "Kontrolleret applikation af gavnlige mikroorganismer (antagonister), der kan hæmme patogener og sygdomsudvikling". Mange af de mikroorganismer, der søges anvendt til biologisk bekæmpelse er naturligt forekommende organismer, isoleret fra f.eks jord, rhizosfære, fyllosfære og frugter. Mekanismer involveret i biologisk bekæmpelse deles ofte op i fire hovedgrupper: Antibiosis, konkurrence, mykoparasitisme og induceret resistens. Antagonistens virkemåde vil dog som oftest være et samspil mellem flere mekanismer, og grænserne mellem mekanismerne er ikke klart adskilte. Et generelt erkendt problem ved biologisk bekæmpelse er uensartede resultater og svigtende bekæmpelseseffekt under naturlige vækstbetingelser. Gennem produktion og formulering af MBO'en kan bekæmpelseseffektivitet, stabilitet samt produktets shelf-life dog forbedres væsentligt. Applikationsmetode Den metode, der benyttes til applikation af antagonisten, er afhængig af det pågældende patogens livscyklus og patogenese og hvilket trin i plantens udvikling, der søges beskyttet. Frø og jordbårne patogener Jordboende, patogene mikroorganismer bekæmpes ved iblanding, udvanding eller udsprøjtning til voksemediet, samt ved frøbejdsning. Det har generelt vist sig at være vanskeligt at etablere en tilstrækkeligt høj og aktiv population af en introduceret MBO i et komplekst økosystem som jorden, idet en stor naturlig population af bakterier og svampe i forvejen er etableret i de næringsrige mikrohabitater. Den introducerede population reduceres i reglen forholdsvis hurtigt, men en introduceret population af bakterier eller svampe kan overleve fra få uger og op til flere år i jorden, oftest i form sporer der er i en tilstand af inaktivitet (fungistasis). Iblanding af MBO'er til væksthus-afgrøder har formodentlig et større perspektiv, både økonomisk og bekæmpelsesmæssigt, dels fordi der anvendes relativt små mængder voksemedium (og dermed mindre mængde præparat), dels fordi mange af de anvendte voksemedier har en lavere mikrobiel bufferkapacitet, hvorved antagonisten får bedre mulighed for at etablere sig. Ved frøbejdsning beskyttes frøet først og fremmest mod udsædsbårne patogener. Hvis antagonisten er rhizosfærekompetent, defineret som evnen til at kolonisere rodnettet efter applikation til frøet, så kan rødderne også beskyttes mod jordbårne patogener. Fyllosfære patogener Plantepatogene mikroorganismer i fyllosfæren bekæmpes ved udsprøjtning og evt påsmøring af sårflader. Overlevelse af MBO'er i fyllosfæren er generelt begrænset fra få dage til få uger, og det er derfor ofte nødvendigt med mange behandlinger. Det skyldes, at MBO'er i anvendelse i dag ofte ikke er tilpasset fyllosfæremiljøets klimatiske fluktuationer og ikke kan udnytte eller konkurrerer dårligt med den etablerede mikrobiota om de sparsomme, tilstedeværende næringskilder. Succes vil ofte være betinget af, at der er tilgængelig næring f.eks. i form af senescent væv, henfaldne kronblade, pollen og honningdug, eller at patogenet har skabt indgangsveje til næring, som antagonisten kan udnytte i konkurrence med patogenet, eller at MBO'er introduceres til en nyligt opståede, næringsrige nicher (sårflader), der endnu ikke er koloniserede af den naturlige mikroflora. Efterhøst patogener Efterhøstpatogener bekæmpes ved påsprøjtning eller dypning. Miljøbetingelserne ved lagring er generelt meget stabile og kontrollerede, eksempelvis lagres de fleste frugter og grønsager ved temperaturer tæt på 0°C. Netop lave lagertemperaturer er med til at vanskeliggøre biologisk bekæmpelse af lagersygdomme, idet mange anvendte antagonister ikke er aktive eller har ringe aktivitet ved sådanne temperaturer. Den naturligt forekommende mikrobiotas toksinproduktion Indenfor svampeslægterne Aspergillus, Penicillium Fusarium og Alternaria, der ofte forekommer på høstprodukter, findes der både patogene og saprofytiske arter, der er stærk involveret i ødelæggelse og nedbrydning af afgrøder i marken og under transport og lagring. Mange af disse arter er også i stand til at producere toksiske, sekundære metabolitter (mykotoksiner), der hyppigt detekteres i visse planteprodukter til konsum, så som cerealier. Mykotoksiner kan produceres på planter i vækst og derved kontaminere høstprodukter, eller produktionen kan ske under transport og lagring af de høstede produkter. Såvel vækst af svampene som produktion af mykotoksiner er stærkt afhængig af miljøfaktorer som substrat, vandaktivitet, temperatur, mikrobiel interaktion etc. De betingelser, der understøtter toksinproduktionen, er dog oftest mere specifikke og begrænsede end betingelserne for vækst. Risikoen for produktion af mykotoksiner på høstprodukter øges, hvis produkterne lagres under ugunstige forhold, det vil blandt andet sige forhold der accelererer produkternes naturlige nedbrydning og senescens (specielt frugt og grønsager) eller med et vandindhold, der er for højt (primært cerealier). Under sådanne betingelser vil mykotoksinproducerende patogener og svækkelsesparasitter have gode muligheder for vækst og potentiel mykotoksinproduktion. MBO'ers produktion af sekundær metabolitter Mange biologiske bekæmpelsesorganismer (MBO) kan producere sekundære metabolitter in vitro. Antibiosis via sådanne metabolitter regnes da også for at være en mekanisme, der ofte er involveret i biologisk bekæmpelse af plantepatogener. Det er dog vigtigt at pointere, at in vitro metabolitproduktion i mange tilfælde ikke er korreleret med den biologisk bekæmpelseeffekt in vivo. Desuden er informationer omkring MBO'ers produktion af sekundære metabolitter in vivo meget begrænset. De i litteraturen fundne rapporter omhandler primært produktion af sekundære metabolitter i jord, rhizosfære og på frø sået i jord, efter applikation af MBO'erne Pseudomonas fluorescens, P. aureofaciens og Trichoderma virens (tidligere Gliocladium virens). Den foreliggende viden indikerer endvidere, at tilførsel af tilgængelige næringskilder (eksudater, organisk materiale) er essentielt for metabolitproduktionen som sådan og for dens omfang. På baggrund af det begrænsede kendskab til MBO'ers in situ metabolitproduktion, og da der kan være variation mellem isolater inden for samme art m.h.t. metabolitprodution, kan der ikke drages generelle konklusioner. Den potentielle risiko må derfor for nærværende vurderes på baggrund af den specifikke organismes naturlige forekomst og økologi samt kendskab til organismens potentielle in vitro metabolitproduktion. Trichoderma harzianum Isolater af T. harzianum indgår i flere af de i DK markedsførte produkter og i produkter, der er miljøgodkendt i USA. Arten T. harzianum adskiller sig væsentlig fra andre arter af Trichoderma blandt andet med hensyn til in vitro metabolitproduktion og generelle vækstkrav. T. harzianum er en typisk jordbåren, saprofytisk svamp, der forekommer naturligt i alle typer af jorde i et niveau svarende til 102 til 104 cfu per g jord. Afhængig af isolatet kan aktivitet forekomme i temperaturintervallet 5° til 36°C og ved en minimumsvandaktivitet (aw) på 0.91. Rhizosfærekompetance synes ikke at være en normal egenskab for isolater af T. harzianum. Der findes dog eksempler på isolater med rhizosfærekompetance, der dog som oftest er fremkommet ved mutagenbehandling eller protoplastfusion. T. harzianum kan forekomme naturligt på blade, frugt, grønsager og frø, dog primært som kontamineringer, idet arten generelt er dårligt tilpasset til fyllosfæremiljøet. Således er overlevelsen af konidier applikeret til ovenjordiske plantedele generelt dårlig, idet < 1% er levedygtige efter 2-3 uger. Desuden kan konidier af T. harzianum ikke spire på levende, intakt plantevæv, med mindre der tilsættes eksogen næring. Metabolitter, der produceres af T. harzianum in vitro, er ikke påvist in situ, hverken i jord/rhizosfære eller på høstprodukter. Generelle forhold vedrørende risikovurderinger I forbindelse med en risikovurdering af en MBO vil mange informationer kunne hentes fra litteraturen. Sådanne informationer vil dog som oftest være af generel karakter, hvorfor der i konkrete sager kan opstå behov for at fremskaffe dokumentation af mere specifik karakter. Der findes brugbare metoder til at opnå detaljerede data vedrørende MBO'ers økologi og metabolitproduktion i de forskellige habitater. Det må dog i hvert enkelt tilfælde vurderes nøje, om et eventuelt krav om yderligere dokumentation, baseret på eksperimentelle undersøgelser, er nødvendigt, da de fleste af de tilgængelige metoder til sådanne undersøgelser kun kan gennemføres med betydelige omkostninger til følge. I kapitel 7 er der anført en række problemstillinger, der i enkelt tilfælde kan være relevante at få yderligere belyst. Selv om produktet er kontamineret med MBO'er, er de i dag anvendte organismer ikke
kendt for at forårsage efterhøstproblemer i form af vækst og sporulering på
planteprodukter. Risikoen for metabolitproduktion efter høst skønnes derfor i
almindelighed at være minimal. SummaryBackground Many of the microorganisms used as biological control agents (BCAs) are producers of toxic secondary metabolites in vitro. However, information concerning production of such toxins under natural conditions in vivo is sparse. The occurrence of toxins in or on plant products will, to a high degree, depend on the method of delivery of the BCA and on the ecology of the potentially toxin producing organism. It is widely held, that microorganisms only produce metabolites when they are active. Therefore focus in this report will be on the ability of the organism to spread, survive and establish in soil, in the rhizosphere and phyllosphere and on postharvest products. At the moment 18 BCAs are marketed in Denmark on dispensation until official EU approval has been obtained. This report primarily deals with microorganisms used for biological control of plant pathogens with specisal focus on the organism Trichoderma harzianum. Objectives. The main objective of this report is to elucidate the environmental conditions under which metabolites produced by microorganisms may pose a human health risk in agricultural and horticultural crops in relation to the application of BCAs. In order to achieve this end, the spread, survival and establishment of microorganisms in crops will be related to the method of application and ecological parameters in the soil and rhizosphere, phyllosphere and post harvest environments. The natural occurrence of populations of toxin producing microorganisms will be examined partly to exemplify how ecological parameters affect toxin production by these organisms and partly to evaluate whether there are greater health risks associated with ingestion of toxins from BCAs in compared to ingestion of toxins from the indigenous microbiota. Natural occurring microbiota Microorganisms can be detected on all fresh plant products such as fruits, vegetables and cereals. The composition of the microbiota on such products depend on the cropping conditions, the type of product and the storage conditions. Amongst the fungi the genera Cladosporium, Alternaria, Epicoccum, Aspergillus, Penicillium and Fusarium are highly common. Amongst the yeasts especially Cryptococcus spp., Sporobolomyces spp. and Aureobasidium pullulans occur and within the bacteria Pseudomonas, Xanthomonas, Chromobacterium and Klebsiella are the dominating genera Ecological habitats Soil, rhizosphere, phyllosphere and post harvest products are the main ecological habitats that BCAs may occupy either following direct application or by secondary spread. These habitats offer very different opportunities for microbial growth and establishment. Soil and rhizosphere are characterized by an indigenous microflora, rich in species diversity and amount of biomass, in which an intensive competition takes place for nutrient rich substrates, such as plant debris and root exudates. The phyllosphere is a very dynamic habitat with drastic and frequent fluctuations in temperature, humidity and radiation and where nutrients are often very limited. Therefore the microorganisms in the phyllosphere have to be highly adapted in order to survive and establish in this habitat. The postharvest environment is more defined and stable. Fruit and vegetables are mainly stored at a high relative humidity and a low temperature in order to maintain the quality of the product and to reduce development of postharvest pathogens. Cereals should be stored with a low water content (ca. 13%). At such low water availability microbial growth is very limited. Biological control In this report microbial control of plant pathogens is defined as: " The artificial introduction of antagonistic microorganisms into the environment to control plant pathogens". Most of the organisms used for biological control have been isolated from natural environments such as the soil, rhizosphere, phyllosphere, fruits and seeds. The mechanisms involved in biological control are generally classified into four groups: antibiosis, competition, mycoparasitism and induced resistance. However in practice these mechanisms often are not clearly separable, as antagonists often have multiple modes of action. Mode of application The method used for application of BCAs depends on the life-cycle of the pathogen, its pathogenesis and this, in turn, determines at which stage of plant development application should take place. Soil and seedborne plant pathogens Soilborne plant pathogens are controlled by incorporating, drenching or spraying the BCA on growth medium or by seed coating. In general, it has proven to be difficult to establish a sufficiently high and active population of a BCA when it is introduced into a complex ecosystem with a high microbial buffering capacity, such as soil. The normally observed decline in an introduced population varies according to environment and species, but bacteria and fungi may survive from a few weeks and up to several years, mainly as inactive spores (fungistasis). Direct application of BCAs to greenhouse crops, when grown in smaller volumes of e.g soilless potting mixture seems more economically feasible than application to soil on a field scale. Furthermore soilless or artificial growth media probably possess a lower microbial buffering capacity at crop start, which offers good opportunities for the establishment of an early introduced BCA. Seed coating Seed coating mainly protects the seed against seedborne pathogens. However if the antagonist is rhizosphere competent, i.e. able to colonize the developing root after seed application, then also the plant may be protected against soilborne pathogens Phyllosphere pathogens Plant pathogens in the phyllosphere are mainly controlled by spray application of BCAs. The survival of BCAs is generally limited to a few days or weeks due to poor climatic adaption and poor ability to compete for nutrients in the phyllosphere. Therefore repeated treatment with the BCA are often needed. Successful biocontrol in the phyllosphere generally depends on the capacity of the BCA to exploit sparse sources of nutrients such as necrotic tissue, pollen, honey dew, etc. or freshly made wounds, not yet colonized by the natural microbiota and of the availability of these resources. Postharvest pathogens Post harvest pathogens are controlled by spraying or dipping. Most fruits and vegetables are stored at low temperature, often near 0°C. However, low temperature storage is one of the main limitations to efficient biological postharvest disease control, since many of the known antagonists have no or very low activity at such temperatures. Toxin production by the natural microbiota Fungi belonging to Aspergillus, Penicillium, Fusarium, and Alternaria are often detected on harvested products and they are strongly involved in spoilage of crops both in the field and during transport and storage. Many of these species can also produce the toxic secondary metabolites (mycotoxins) that are frequently detected in plant products used for human and animal consumption, such as cereals. Mycotoxins may be produced during the growth of the crop or during storage of the harvested products. Both fungal growth and mycotoxin production are dependent on environmental factors such as substrate, temperature, water activity, microbial interactions etc, with the limits for mycotoxin production usually being more narrow than those for growth of the organism. The risk of fungal growth and thereby potential mycotoxin formation in harvest products increases, if products are handled incorrectly and/or stored under conditions which accelerate the natural deterioration and senescence processes (especially in fruits and vegetables) or with too high a water content (primarily cereals). Production of secondary metabolites by BCA's Many BCAs can produce secondary metabolites in vitro and in many cases these are thought to be involved in biocontrol (antibiosis). However, it should be noted that in vitro production of metabolites in many cases is not correlated with biocontrol efficacy in vivo. Furthermore, there are only a few reports of in situ production of secondary metabolites in relation to biocontrol of plant pathogens. Reported cases mainly concern Pseudomonas fluorescens, P. aureofaciens and Trichoderma virens (former Gliocladium virens). These studies indicate that availability and amount of nutrient (exudates, organic material) is essential for metabolite production and for the amount produced. Since the knowledge of in situ metabolite production by BCAs is incomplete and since isolates within species can vary in production of metabolites, general conclusions concerning metabolite productivity cannot be drawn. Thus, presently, potential risks must be evaluated in the light of the natural occurrence and ecology of the BCA in question and on the basis of knowledge of potential in vitro metabolite production of the specific organism in question. Trichoderma harzianum Isolates of T. harzianum are the active ingredient in two BCA products marketed in DK and in several products registered in the USA. The species T. harzianum differs from other Trichoderma species in respect to in vitro production of metabolites and requirements for growth. T. harzianum is a typical soilborne saprophytic fungus which occurs naturally in all soil types (102 to 104 cfu/ g soil). Dependent on the isolate, the fungus is active between 5° and 36°C and at a minimum water activity (aw) of 0.91. Rhizosphere competence does not seem to be a natural trait of T. harzianum. T. harzianum can occur naturally in the phyllosphere and on postharvest products as contamination. Conidia applied to aerial plant organs generally survive poorly and a rapid decrease in the population density to below 1% is often observed after 2 to 3 weeks. Furthermore, conidia of T. harzianum are unable to germinate on intact living plant tissue without an exogenous nutrient supply. Metabolites produced by T. harzianum in vitro have not been detected in situ either in soil, the rhizosphere or on postharvest products General considerations concerning risk assessment Much of the information needed for risk assessment of BCAs is available while it is mainly general in nature. For each individual case more specific ducumentation on e.g. ecology and metabolite production by the BCA may be required. Methods to obtain this kind of data are available, but the need of such data should be carefully considered, since such methods generally are costly. Aspects which might be considered for more detailed study are dealt with in chapter 7. Although a postharvest product may be contaminated with BCAs, none of the organisms
used at the moment are known to cause postharvest problems in terms of their growth and
sporulation on plant products. Therefore in most cases, the risk of metabolite production
on harvested products can be considered minimal. 1. IntroduktionIntroduktion Mange bakterier og svampe er i stand til at producere toksiske sekundære metabolitter under forskellige forhold. F.eks. producerer en del levnedsmiddelbårne svampe mykotoksiner under lagring. Man har kendskab til, at mange af de mikroorganismer, der anvendes i mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, producerer en række forskellige toksiske sekundære metabolitter in vitro, men ringe viden om under hvilke forhold og i hvilke mængder de produceres under naturlige forhold in vivo, samt stoffernes stabilitet og persistens (Lübeck, 1994). For nogle mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler er det vist, at produktion af sekundære metabolitter er en nødvendighed for en effektiv bekæmpelse af mål patogener. For de fleste biologiske midler angives andre virkemekanismer at være den primære årsag til antagonisternes effektivitet overfor plantepatogener så som konkurrence om plads og næring, mykoparasitisme og induceret resistens. I godkendelsesmæssige sammenhænge er det vigtigt at kende til de sundhedsmæssige konsekvenser, der er forbundet med at udbringe potentielt toksinproducerende mikroorganismer inden for plantedyrkning, hvor afgrøderne anvendes til føde for mennesker og husdyr. 1.1 Projektets baggrundBaggrund Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler har siden den 26. juli 1993 skulle godkendes af Miljøstyrelsen for at kunne markedsføres i Danmark. Der findes dog en overgangsordning for de midler, der blev solgt i Danmark før den 26. juli 1993, således at disse midler fortsat må sælges, såfremt der er søgt om godkendelse af disse midler senest d. 26. juli 1994. Miljøstyrelsen skal udarbejde kriterier og retningslinier for vurdering med henblik på godkendelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler Miljøstyrelsen skal vurdere de mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler i forhold til mennesker og dyrs sundhed, og derfor udarbejde retningslinier for vurdering og kriterier for godkendelse af midlerne (Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, Vejledning fra Miljøstyrelsen Nr. 8, 1993). Miljøstyrelsen har tidligere udgivet en rapport vedrørende metoder til undersøgelse af miljømæssige konsekvenser ved udbringning af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler (Folker-Hansen et al., 1993) samt rapport indeholdende oversigt over udvalgte mikroorganismers indhold af kendte sekundære metabolitter (Lübeck, 1994). 1.1.1 Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler i DanmarkMidler I Danmark må der på nuværende tidspunkt markedsføres 18 mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Ingen af disse midler er endnu godkendte, men er omfattet af overgangsordningen (se afsnit 1.1). Sytten af midlerne indeholder organismer, der er kendt for at kunne producere toksiner: Bacillus thuringiensis,Streptomyces griseoviridis, Phlebiopsis gigantea, Trichoderma harzianum, T. polysporum og Verticillium lecanii. Det 18. middel indeholder et insektvirus, Agrotis segetum granulosis virus og udgør derfor ikke nogen toksinrisiko. Tabel 1.1 viser en oversigt over disse 18 midlers aktive organisme, midlets målgruppe (skadedyr/patogen), tiltænkt afgrøde (værtplante for skadegører) samt midlets udbringningsform. Disse oplysninger stammer fra de pågældende firmaers ansøgning om godkendelse og brugsanvisninger. Anvendelsesmåde Afhængigt af de mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers målgruppe udbringes midlerne på forskellig vis. Jordboende svampe og insekter rammes enten ved iblanding, udvanding eller udsprøjtning til voksemediet, samt ved frøbejdsning, mens skadegører i fyllosfæren rammes ved udsprøjtning og evt påsmøring. 1.1.2 Projektets formålFormål Formålet med projektet er at belyse, under hvilke miljøbetingelser mikroorganismers metabolitproduktion kan udgøre en sundhedsmæssig risiko i spiselige afgrøder i forbindelse med udbringning af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Dette er tilstræbt ved klarlægge den aktive organismes spredningsmuligheder, etablering- og overlevelseevne i afgrøden i relation til anvendelsesmåden af midlet og økologiske parametre i henholdsvis jord/rodzone, fyllosfære og på afgrøder efter høst. Desuden vil forekomsten af naturlige populationer af toksinproducerende mikroorganismer blive belyst dels for at eksemplificere hvorledes økologiske parametre påvirker disse organismers produktionen af sekundære metabolitter, og dels for at kunne vurdere, om den sundhedsmæssige risiko ved at indtage toksiner fra mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler er større end risikoen ved at indtage toksiner fra den naturligt forekommende mikrobiota. Rapporten vil kunne være med til at danne grundlag for Miljøstyrelsens eventuelle kravsspecifikationer om dokumentation samt acceptkriterier for mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Tabel 1.1. Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, der må markedsføres i Danmark. Table 1.1. Microbial pest control agents allowed to be market in Denmark 1.2 Projektindhold og afgrænsning1.2.1 ProblemløsningLübeck (1994) udarbejdede en oversigt over udvalgte bekæmpelsesorganismers potentielle produktion af sekundære metabolitter og deres toksicitet, og fandt at viden om de sekundære metabolitters produktionsforhold og -mængde, stabilitet og persistens in situ var meget begrænset. Tilstedeværelse af metabolitter som restkoncentrationer i/på planteprodukter må dog i høj grad antages at afhænge af anvendelsesmåden for plantebeskyttelsesmidlet samt af den producerende organismes økologi. Denne rapport tager derfor udgangspunkt i viden om den producerende organismes sprednings-, overlevelses- og etableringsevne i rodzone, fyllosfære og på efterhøstprodukter, da det forventes, at der kun produceres metabolitter, når organismen er aktiv. Ved at studere organismens økologi på relevante plantedele og i relevante økologiske nicher kan man således få belyst, om det er sandsynligt at finde sekundære metabolitter. Desuden inddrages litteraturstudier af den naturligt forekommende mikrobiota, som er metabolitproducerende, dels for at illustrere hvorledes økologiske parametre influerer på mikroorganismernes vækst og toksinproduktion, og dels for at vurdere om den sundhedsmæssige risiko ved at indtage toksiner fra mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler er større end risikoen ved at indtage toksiner fra den naturligt forekommende mikrobiota. Økologiske nicher Helt afhængig af planteart anvendes forskellige morfologisk meget forskellige dele af planten til fødevarer herunder eksempelvis rødder (gulerødder, persillerod), knolde (kartofler), bladgrønsager (salat, spinat, krydderurter), frugter (æble, pærer), frø (byg, hvede) og nødder. De økologiske nicher som de mikrobiologiske midler applikeres direkte til, eller som organismen kan spredes til efter den primære applikation nemlig jord/rodzone, fhyllosfære og lagrede høstprodukter giver meget forskelligartede muligheder for mikrobiel vækst. Derfor er disse tre habitaters generelle økologi, specielt med hensyn til svampe og bakterier, beskrevet for bedre at kunne vurdere en applikeret mikroorganismes mulighed for overlevelse, etablering og aktivitet på et givent produkt. 1.2.2 Mikrobiologiske bekæmpelsesorganismerMikroorganismer Rapporten vil primært omhandle bekæmpelsesorganismer (MBO) der markedsføres i Danmark p.t. og som anvendes til bekæmpelse af plantepatogener, jvf. Tabel 1.1. Da kun bakterie- og svampebaserede plantebeskyttelsesmidler er producenter af sekundære metabolitter, vil det virus-baserede insekticid følgeligt ikke blive inddraget i denne rapport. Rapporten vil ej heller omhandle Bacillus thuringiensis varianter's økologi og toksinproduktion, trods denne organismes evne til at producere adskillige toksiner, idet Miljøstyrelsen tidligere har udgivet en rapport om bakteriens økologi og miljømæssige effekter (Hansen et al., 1996). Specifikke forhold vedrørende den insektpatogene svamp Verticillium lecanii vil heller ikke blive beskrevet. Gruppen af antagonister til bekæmpelse af plantesygdomme består af bakterien Streptomyces griseoviridis og svampene Trichoderma harzianum, T. polysporum og Phlebiopsis gigantea. Der vil dog primært blive fokuseret på organismen Trichoderma harzianum og denne organismes udbringning i mark, plantage eller væksthus, og hvor planteprodukter bruges til konsum. 1.3. Litteraturens begrænsninger i forbindelse med vurdering af mikroorganismers forekomst, kvantitet og aktivitet.Naturlig forekomst Diversiteten blandt bakterier og svampe i det globale økosystem er enorm. Det er således estimeret, at der på nuværende tidspunkt er beskrevet ca 70.000 arter af svampe og 4.800 arter af bakterier, men de beskrevne arter formodes kun at udgøre henholdsvis 7% og <2% af de teoretisk set eksisterende arter (Hammond, 1995). Fra jordmiljøet er der isoleret og identificeret ca. 40.000 arter af mikroorganismer, men ud fra studier af rRNA er det estimeret at 90% af mikroorganismerne i jord endnu ikke er identificeret (Roper & Ophel-Keller, 1997). Den naturlige forekomst af mikroorganismer i et bestemt økosystem vil derfor kun dække de arter, der kan isoleres og bestemmes ud fra standardmetoder. I de fleste af de undersøgelser, der refereres til i rapporten er der anvendt direkte pladning og/eller forskellige varianter af pladespredninger til detektering og kvantificering af mikroorganismer. Metoderne giver problemer, når populationen af mikroorganismer i jorden eller på og i planter skal detekteres, idet mange mikroorganismer ikke kan eller er vanskelige at dyrke ved hjælp af standarddyrkningsmedier. Derudover kan valg af dyrkningsmediets sammensætning med hensyn til næringkilder pH, vandpotentiale (aw), inkubationstemperatur etc. også have stor indflydelse ikke blot på den estimerede populationsstørrelse men også på populationens sammensætning (Roper & Ophel-Keller, 1997). Prøveudtagning herunder antal og størrelse samt bearbejdning har også betydning for hvilke mikroorganismer der isoleres. Endvidere har hovedformålet i mange af de refererede undersøgelser været at identificere specifikke grupper af mikroorganismer eksempelvis plantepatogener, hvilket ikke udelukker tilstedeværelsen af arter anvendt til mikrobiologiske bekæmpelse, idet der som oftest findes en restgruppe af uidentificerede organismer. Ydermere er mikroorganismer ved undersøgelse af den naturlige microbiota ofte kun bestemt til slægtsniveau, og derfor af begrænset værdi i rapporten, hvor der ønskes specifik viden om enkelte arters forekomst. Kvantitet og aktivitet Brug af pladespredningsteknikken til kvantificering af mikroorganismer i jord og på over-og underjordiske plantedele er især problematisk for svampegruppen. Det skyldes at der er stor forskel på svampegruppen og bakterigruppen med hensyn til morfologien af henholdsvis aktive og inaktive (hvile) stadier (Parkinson & Coleman, 1991). Bakterier eksisterer hovedsagelig som afgrænsede celler og derfor vil pladespredning for disse organismer give et rimeligt udtryk for biomassen. Svampe forekommer derimod både som mycelium og sporer, hvor hovedparten af sporene vil udvikle kolonier, mens kun en ikke nærmere defineret del af myceliet vil udvikle kolonier på substratet. I henhold til Warcup (1955) vil kolonier ved en pladespredning udvikles langt hyppigere fra sporer end fra mycelium. Pladespredninger giver et tal for tilstedeværelsen af spiredygtige strukturer af organismen i form af hyfefragmenter, sporer eller hvilestrukturer, men metoden giver ingen information om organismernes biomasse. Ydermere giver pladespredning heller ikke altid et realistisk mål for mikroorganismers aktivitet, idet antal cfu (colony forming units) og aktivitet ikke nødvendigvis er positivt korrelerede (de Leij et al., 1995; Lumsden et al., 1990). Disse forhold vanskeliggør vurderingen af om påvisning af en specifik arts tilstedeværelse efter pladespredning er udtryk for aktiv kolonisation eller om der er tale om inaktive spiringsenheder. Da aktivitet er en forudsætning for dannelse af sekundære metabolitter kan det derfor ikke alene ud fra cfu afgøres, om en organisme er i stand til at producere metabolitter på en given plantedel. Det ligger dog fast at pladespredninger i forbindelse med nærværende rapport kan give indtryk af om den pågældende organisme er til stede, og dermed potentielt har mulighed for at producere sekundære metabolitter. Vurderingen af mikroorganismers aktivitet må derimod hovedsagelig bedømmes ud fra viden om deres økologi, herunder specielt om organismen vil være i stand til at kolonisere specifikke plantedele i givne økologiske nicher. In vitro/in vivo Mange oplysninger omkring mikroorganismernes vækstkrav, metabolitproduktion og
biologisk bekæmpelsesaktivitet bygger på in vitro undersøgelser og bør derfor
nøje vurderes, idet resultater opnået ved in vitro forsøg ofte afviger
signifikant fra resultater opnået in vivo. 2. Beskrivelse af de økologiske habitater hvortil mikrobiologiske bekæmpelsesorganismer kan applikeres og spredesØkologiske habitater De økologiske habitater, som de mikrobiologiske bekæmpelsesmidler kan applikeres og spredes til, kan inddeles i tre overordnede habitater: jordbunden, fyllosfære og lagrede høstprodukter. Disse er beskrevet med hensyn til karakteristiske og generelle forhold. Desuden er generelle forhold omkring spredning af mikroorganismer beskrevet. 2.1 JordbundenJorden er et komplekst og dynamisk miljø, hvor den kvalitative og kvantitative sammensætningen af den mikrobiel le flora er under indflydelse af jordtype, vegetation, kulturforanstaltninger og de klimatiske forhold og komplekse og multiple interaktioner mellem disse parametre. Der er store sæsonmæssige svingninger i populationen af mikroorganismer som følge af interaktioner mellem disse parametre. I tabel 2.1 er en skønnet naturlig forekomst af svampe og bakterier i pløjelagets dybde i markjord uden hensyntagen til betydningen af interaktioner mellem jordtype, kulturplante- og foranstaltninger og klima (Brady, 1984). Under tempererede klimaforhold er svampefloraen ofte domineret af arter indenfor slægterne Penicillium, Fusarium, Mucor, Aspergillus, Gliocladium, Trichoderma, Trichothecium, Alternaria, Cladosporium, Rhizopus og Chaetomium (Brady, 1984; Domsch et al., 1980; Martin & Ordal, 1980). Den overvejende del af svampepopulationen i jord ernærer sig som saprofyter af dødt organisk materiale, primært plantevæv. En del af populationen er plantepatogener. Disse er enten biotrofe patogener, det vil sige at de ernærer sig af værtplanten uden at dræbe denne eller nekrotrofe patogener, der ernærer sig af væv de selv har dræbt. Mange nekrotrofe patogener er dog fakultative saprofyter. Bakterier, der hyppigt forekommer i jorden findes indenfor slægterne Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium, Alcaligenes, Chromobacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Bacillus, Clostridium og Streptomyces (Martin & Ordal, 1980). Hovedparten af bakterierne i jorden er heterotrofe og ernærer sig af organiske stoffer (sukker, stivelse, cellulose og protein) syntetiseret af andre organismer. En del af populationen er autotrofe og er stand til at opbygge livsnødvendige organiske stoffer af uorganiske forbindelser (Subba Rao, 1995). Mikroorganismernes mest betydelige rolle i naturlige økosystemer, som jord, må henføres til deres aktive involvering i nedbrydning og mineralisering af plante (og animalsk) materiale. De tilstedeværende organismers næringskrav, vækstrate, formering, enzymproduktion (cellulaser, kitinaser etc.), antibiotikaproduktion o.s.v. og deres gensidige påvirkninger vil resultere i successive ændringer i mikrofloraens sammensætning på et givent habitat i form af et givent organisk materiale. Voksemedier I væksthuse anvendes ofte voksemedier som rockwoll, sphagnum, pottemix, vandkultur. Disse medier har som habitat for mikroorganismer en langt mindre diversitet og mangfoldigt end markjord. Desuden giver plantedyrkning i væksthuse mulighed for i høj grad at kontrollere dyrkningsbetingelser og klimatiske parametre. Tabel 2.1. Relative antal af mikroorganismer fundet i jord (Brady,1984) Table 2.1. Relative number of microorganisms in soil.
1) 18 cm dybde Jord udgør ikke et homogent miljø, og indenfor en specifik jord er mulighederne for mikrobiel aktivitet meget forskelligartede, afhængig af om organismen befinder sig i non-rhizosfæren (bulk soil), på planterester, i rhizosfæren (rodzonen) eller i spermosfæren. Generelle økologiske forhold for mikroorganismer i disse overordnede habitater vil blive beskrevet. 2.1.1 Non-rhizosfærenNon-rhizosfære jord (bulk soil) defineres som jord, der ikke er koloniseret af planterødder. De fleste mikroorganismer, der befinder sig uden for rhizosfæren, er inaktive eller i hviletilstand. Denne tilstand benævnes ofte fungistasis og er en exogen hviletilstand, der formodentlig skyldes en kombination af generel mangel på substrat og/eller antibiosis og næringsmangel som følge af konkurrerende mikroorganismers aktivitet (Curl & Truelove, 1986). Mange af de inaktive organismer vil dog være stand til at spire og vokse, så snart en rod trænger ind i det område hvor organismen befinder sig, eller når der tilføres en passende næringskilde f.eks. i form af planterester under nedbrydning til området. 2.1.2 PlanteresterDen næring der frigøres fra planterester under nedbrydning i jorden kan stimulerer spiringsenheder (sporer, mycelium, o.s.v.), der er under indflydelse af fungistasis til at spire. Endvidere kan planterester tjene til overlevelse eller opformering af patogener i perioder, hvor modtagelige værtplanter ikke er tilgængelige . 2.1.3 RhizosfærenDefinition Rhizosfæren der er knyttet til planterødder udgør et speciel og kompliceret miljø. Rhizosfæren betegner området omkring roden, hvor aktiviteten af mikroflora - og fauna påvirkes af eksudater fra roden. Rodeksudaterne består af kemiske forbindelser som f.eks kulhydrater, aminosyrer, glykosider, organiske syrer, vitaminer og enzymer. Disse molekyler udskilles især bag rodkappen og ved basis af siderødder (Bolton et al., 1993; Curl & Truelove, 1986; Lynch, 1990; Subba Rao, 1995). Rhizosfæreeffekten Rhizosfæren er karakteriseret af højere mikrobiel aktivitet end i jorden udenfor rhizosfæren. Den effekt rødder udøver på den mikrobiel le aktivitet kaldes rhizosfæreeffekten. Rhizosfæreeffekten er bestemt dels af jordens tekstur og dels af de udskilte stoffers tilstand. Eksempelvis diffunderer flygtige forbindelser længere end forbindelser, der er opløst i jordvandet, og faste forbindelser vil ophobes på rodoverfladen (Jensen & Hockenhull, 1984). Som det fremgår af tabel 2.2 er aktiviteten af både bakterier, actinomyceter og svampe meget højere i rodzonen end i rodfri jord (non-rhizosfærejord). R/S forholdet (population i rhizosfære jord /population i non rhizosfære jord), der er et mål for rhizosfæreeffekten i et givet rod/plante system er større og mere udtalt for bakterier end for svampe (Curl & Truelove, 1986), svarende til at bakterier generelt er mere tilpassede til at udnytte rodeksudater og konkurrence i rodzonen. Tabel 2.2. Sammenligning af grupper af mikroorganismer pr g tør jord i rhizosfæren af hvede og non-rhizosfære jord (Curl & Truelove, 1986). Table 2.2. Comparison of the numbers of various groups of organisms g-1 dry soil in the rhizosphere of wheat and in non-rhizosphere soil
Faktorer der influerer på rodeksudation Såvel kvantitet som kvalitet af rodeksudater er under indflydelse af mange forskelligartede faktorer, herunder planteart -og udviklingstrin, temperatur- og lysforhold, jordens fugtighed, flygtige forbindelser, kultur-foranstaltninger som eksempelvis planteernæring (gødskning) og anvendelse af kemikalier på såvel blade som jord (næringsstoffer, fungicider, antibiotika, herbicider m.v.). Endvidere sker der mikrobiel le interaktioner, der influerer på permeabiliteten af rodceller, rodens metabolisme, absorption af specifikke eksudater og påvirker mængden af plantetilgængelig næring. Faktorer der influerer på rhizosfærepopulationer Den kvalitative og kvantitative sammensætning af rhizosfærens mikrobielle population påvirkes enten direkte eller indirekte af rodeksudater og vil derfor i varierende grad være påvirket af de faktorer, der influerer på planternes rodeksudation som nævnt ovenfor. Generelle effekter af udvalgte faktorer er yderligere uddybet. Planteart, sort og udviklingstrin Bælgplanter inducerer eksempelvis en større opformering af bakterier end ikke-bælgplanter. Også mellem sorter indenfor en art er der observeret signifikante forskelle i rhizosfære populationer. Ved sammenligning af sorter der er modtagelige for visse patogener, med sorter der ikke er modtagelige, er det fundet, at rhizosfære populationer af bakterier og svampe ofte har været større for de modtagelige sorter (Curl & Truelove, 1986; Liljeroth, 1990; Weller & Thomashow, 1994). Densiteten af rhizosfære populationen øges generelt med stigende plantealder, ligesom sammensætningen af populationen er anderledes på kimrødder og unge rødder end på ældre og etablerede rødder. Jordtype Generelt er rhizosfæreeffekten målt på den totale rhizosfære population mest udtalt i sandede jorde og mindst tydelig i svære lerjorde og jorde med højt humusindhold. Jordbehandling Jordbehandlinger i form af gødskning med kunstgødning eller organisk gødning, planterester, kalkning og tilførsel af pesticider er formodentlig af større betydning end jordtypen. Eksempelvis medfører gødskning med mineralsk gødning ikke blot en betydelig forøgelse af den mikrobielle population i rhizosfæren, gødskningen influerer også på sammensætningen af floraen (Curl & Truelove, 1986; Liljeroth, 1990). Miljøfaktorer Specielt jordtemperatur og vandindhold er betydende parametre. Effekten er i høj grad indirekte effekt af disse faktorers indflydelse på mængden og kvaliteten af plante eksudater (Curl & Truelove, 1986). Rhizosfærens udstrækning Rhizosfæreeffekten er i sig selv knyttet til et meget snævert område omkring rodnettet og strækker sig generelt fra rodoverfladen (rhizoplanet) og nogle få millimeter ud i jorden (Bolton et al., 1993; Campbell & Greaves, 1990; Curl & Truelove, 1986). I tabel 2.3 er givet et eksempel, der viser hvorledes populations densiteten af mikroorganismer bestemt ved pladespredning hurtigt aftager når afstanden til rodoverfladen øges (Papavizas & Davis, 1961). Også diversiteten blandt mikroorganismerne aftager med stigende afstand til rodoverfladen (Bolton et al., 1993). Tabel 2.3. Mikroorganismer i varierende afstand fra rodoverfladen af lupin småplanter (Papavizas & Davis, 1961). Table 2.3. Microorganisms at various distances from the root surface of lupin seedlings.
1) Rodoverfladen (rhizoplan) Mikrobielle interaktioner og de enkelte arters økologiske tilpasning er afgørende for artssammensætningen i rhizosfæren. Generelt set er bakterier mest dominerende i rhizosfæren og mange svampe konkurrerer dårligt om rodeksudater eller kan ikke udnytte disse. 2.2. FyllosfærenOverfladen af overjordiske plantedele er et meget dynamisk miljø, der udsættes for meget store mikroklimatiske fluktuationer i temperatur, relativ luftfugtighed, dug, regn, vind og indstråling. Disse forhold påvirker mikrofloraens aktivitet og sammensætning dels direkte og dels indirekte gennem modificering af planteoverfladens metaboliske tilstand, morfologi og overflade kemi. Den mikrobiel le dynamik i fylloplanet afspejles dels ved en uensartet fordeling af populationer indenfor blade (aggregering af populationer) og dels ved stor variation i den mikrobiel le population mellem individuelle blade og mellem planter. Derudover ses der generelt en stigning i densiteten af den mikrobiel le population i løbet af vækstsæsonen og en udpræget/tydelig ændring i sammensætning af populationen i løbet af sæsonen (Andrews, 1992; Kinkel, 1997). Langt den overvejende del af fyllosfærens mikrobiota er saprofytisk og lever af dødt organisk materiale og kun en mindre del udgøres af patogener (Tolstrup, 1984) Næringsstoffer På plantens overflade er tilstedeværelsen af næringskilder en absolut nødvendighed, dels for vækst af saprofyter, og dels for patogener, der har en epifytisk vækstfase inden penetrering af planten. Næringskilderne i fyllosfæren kan være af endogen eller exogen oprindelse og består af carbonhydrater, aminosyrer, organiske syrer etc. I modsætning til rhizosfæren, bidrager exogene kilder i høj grad med næringsstoffer gennem jord partikler, støv, ioner og stoffer opløst i regnvand, honningdug fra bladlus, døde mikroorganismer, pollen etc. Den næring der udskilles af planten i form af eksudater påvirkes kvantitativt og kvalitativt, dels af plantealder, og dels af miljøændringer som temperatur, lys og gødskning (Kenerley & Andrews, 1990). Fyllosfære organismers succession De dominerende fyllosfære mikroorganismer i den tempererede zone består af svampe, gær og bakterier og forekommer i størrelsesordenen 104-107 spiringsenheder per cm2 bladareal (Kenerley & Andrews, 1990). Kolonisering af fyllosfæren er som nævnt i høj grad sæsonafhængig, hvilket hovedsagelig skyldes at bakterier, gær og svampe har forskellige vækstkrav både med hensyn til næring og mikroklima og dermed udnytter forskellige nicher. Bakterier er generelt mest til stede i begyndelsen af vækstsæsonen, mens populationen af gærsvampe kun forøges langsomt og først er tilstede i højt antal midt i sæsonen. Svampene er derimod generelt først aktive mod slutningen af vækstsæsonen, hvor bladene begynder at senescere (Blakeman, 1985; Blakeman & Fokkema, 1982). Bakterier Bakterier er oftest de første og eneste kolonisatorer af de unge blade, hvor nærings niveauet på bladene er lavt, idet bakterier kan multiplicere i opløsninger med meget lavt indhold af aminosyrer og carbonhydrater. Bakterier indenfor arterne Pseudomonas, Xanthomonas, Chromobacterium og Klebsiella vil ofte være tilstede i fyllosfæren (Campbell, 1989). Under markforhold fandt Morris & Rouse (1985), at bakteriepopulationen på bønneblade var af størrelsesordenen 5 x 103-5 x 105/blad og ca. 106/bælg. Gærsvampe Forekomsten af gær på blade er hovedsagelig et resultat af kolonisering fra luftbårnet inokulum. Gæren kræver adgang til simple sukkerforbindelser, der som oftest er utilstrækkelig på nyudfoldede blade. I løbet af vækstsæsonen øges udskillelsen af sukkerforbindelser fra det indre bladvæv og samtidig afsættes carbonholdige forbindelser i form af pollen og honningdug på bladene. Tilgængelighed af N-forbindelser kan blive begrænsende faktor når densiteten af gærsvampe er høj, og konkurrence om aminosyrer kan forklare det fald i bakteriepopulationen, der ofte indtræffer senere på vækstsæsonen. I modsætning til fyllosfærebakterier, der kun overlever kort tid i tørt vejr, kan gærsvampe overleve og kolonisere blade i en længere periode uden regn. Den saprofytiske mikroflora på overjordiske plantedele er i store dele af vækstsæsonen stærkt domineret af gærsvampe, der koloniserer bladet eksponentielt og kan opnå densiteter på 104-2 x 105 cfu/cm2. Gærsvampe som Cryptococcus spp., Sporobolomyces spp. og Aureobasidium pullans er naturligt forekommende og adapteret til miljøet i fyllosfæren (Fokkema, 1983; Köhl & Fokkema, 1994). Svampe Svampesporer afsættes på blade gennem hele vækstsæsonen, men i starten af sæsonen vil de som oftest være i hviletilstand eller eventuelt være i stand til at vokse langs de antikline epidermis cellevægge, hvor en forholdsvis høj næringsudsivning finder sted. Når bladet undergår de første stadier af senescens kan sporer, af f.eks Cladosporium og Alternaria spire og afhængig af bladalder, næringsstatus på bladet og mikroklima kan en kolonisering ved hyfevækst finde sted. Kvalitativt set er sammensætningen af svampefloraen i fyllosfæren meget divers (Dickinson, 1976; McLean & Sutton, 1992). I følge Dickinson (1976) er der fra fylloplanet af 35 værtplantearter identificeret over 100 forskellige svampeslægter. Ved en undersøgelse af svampepopulationens sammensætning på æbleblade, blev der isoleret mere 100 arter, men kun 7 af arterne var dominerende i fylloplanet, mens resten blev betegnet som sjældne (kontaminering) (Kenerly & Andrews, 1990). Falconi & Mendgen (1994) undersøgte ligeledes populationen af svampe på æbleblade og var stand til at identificerede 32 arter, hvoraf de 21 var tilstede gennem hele vækstsæsonen i højt antal. De epifytiske svampe, der kan findes i fyllosfæren kan i henhold til Dickinson (1976) inddeles i 3 hovedklasser. A. Non-patogene epifyter
B. Patogener
C. Svampe der ikke udnytter fylloplanet som substrat.
I tabel 2.4 ses eksempler på kvalitative og kvantitative sammensætninger af mikroorganismer i fyllosfæren på forskellige plantearter. Identificerede slægter og arter i fyllosfæren af forskellige plantearter. Som det fremgår af tabellen er der specielt tale om arter indenfor slægterne Cladosporium, Alternaria, Epicoccum og Rhizopus. I fyllosfæren forekommer der også ofte svampe indenfor slægterne Penicillium, Fusarium og Aspergillus, der ligesom arter af Alternaria potentielt er stand til at producere mykotoksiner. Det skal dog understreges at de talmæssige bestemmelser af densiteten i fyllosfæren enten er opgjort ved pladespredninger eller ved direkte tælling af sporer, og derved ikke udtrykker noget om organismernes aktivitet, som beskrevet i afsnit 1.3. UV I modsætning til mikroorganismer i jorden bliver epifytiske mikroorganismer i fylloplanet eksponeret for UV-lys, der kan skade mikroorganismer. UV-bestråling skader ikke plantevævet, men kan totalt eliminere de epifytiske mikroorganismer (Sztejnberg & Blakeman, 1973). Strålings eller tørkeresistente sporer i form af tykvæggede eller pigmenterede cellevægge er formodentlig af stor betydning for overlevelsen. Der findes dog også tyndvæggede hyaline residenter i fyllosfæren, hvilket indikerer at andre mekanismer end resistens mod strålingsskade, så som hastigheden af DNA- photorepair kan være af betydning (Cullen & Andrews, 1984; Tronsmo, 1992). Tabel 2.4 Naturlig forekomst af bakterier og svampe i fyllosfæren (blade) af forskellige plantearter Table 2.4. Natural occurrence of bacteria and fungi in the phyllosphere of crop plants 1) dom.=dominerende, M.a.=meget almindeligt forekommende,
a.=almindeligt forekommende og sj.=sjældent forekommende 2.3 Lagrede høstprodukterStørstedelen af de grønsager, frugter og cerealier der høstes med henblik på anvendelse til konsum, lagres gennem kortere eller længere perioder inden de når frem til forbrugeren. De fysiske og kemiske forhold som forskellige produkter lagres under frembyder forskellige habitater og nicher for aktivitet af mikroorganismer. 2.3.1 Lagring af frugt og grønt.Frisk frugt og grønsager består af levende væv, der konstant undergår irreversible ændringer og processer, der for størstedelens vedkommende er uønskede. Senescens er det sidste stadie i et planteorgans udvikling og fører gennem irreversible stadier til nedbrydning af cellerne og død. Respiration er den overordnede proces, hvorved organisk materiale nedbrydes og energi frigøres, en proces, der kræver O2 og resulterer i CO2 frigives. Som følge af respiration sker der et tab af oplagret næring, der medfører at senescensen fremskyndes, og at produktets kvalitet i form af energiværdi, smagsparametre og tørvægt gradvist forringes. Den hastighed, hvormed de enkelte produkter fordærves er generelt proportional med den produktspecifikke respirationsrate (RR). Eksempelvis har æbler, løg og kartofler en lav RR-værdi, gulerødder, kål, salat og tomater en moderat RR-værdi og jordbær , bønner og broccoli har en høj RR-værdi (Kader, 1985). Faktorer som temperatur, luftfugtighed, udvikling af ethylen, såringer og patogener indvirker alle på senescens og nedbrydning af lagrede planteprodukter. Friske planteprodukter er meget forskellige i morfologisk struktur (rødder, stængler, blade, blomster, frugter etc.), i kemisk sammensætning og med hensyn til den generelle fysiologi (Kader, 1985). Derfor varierer det enkelte produkts lagringskrav, og anbefalinger vedrørende maksimum postharvest shelf-life meget mellem forskellige produktgrupper (se tabel 2.6). Lagersygdomme Udvikling af lagersygdomme forudsætter først og fremmest forekomst af organismen på det pågældende produkt. Dernæst er organismens mulighed for aktivitet på produktet stærkt påvirket af høst- og håndterings forhold og af de fysiske og kemiske lagerbetingelser. Naturlig forekomst Den mikrobielle sammensætning på høstprodukter er meget afgørende for potentiel udvikling af lagersygdomme. Mikrofloraen på frugt og grønsager, der ikke er i direkte eller nær kontakt med jorden, vil i høj grad være påvirket af fyllosfære mikrofloraen (se tabel 2.4). Hvorimod mikrofloraen på planteprodukter, der høstes fra jorden eller er i tæt kontakt med jorden (kartoffel, gulerod, salat) kan forventes at have en anderledes sammensætning (Smith & Anderson, 1992). I Tabel 2.5 er angivet eksempler på slægter og arter, der er identificeret på frugt, grønsager og cerealier. Tabel 2.5. Naturlig forekomst af gærsvampe, svampe og bakterier på høstede frugter, grønsager og frø. Identificerede slægter og arter af mikroorganismer er angivet. Table 2.5. Natural occurrence of yeasts, fungi and bacteria on post harvest products (fruits, vegetables and seeds). Identified genera and species are given. 1) Identificerede svampearter og slægters forekomst som
sporer på hvedeaks umiddelbart inden høst. Høst og håndtering Høstmetode og håndtering før lagring er også afgørende for udviklingen af lagersygdomme. Frugt og grønsager udsat for stød, såring, vask, opvarmning og køling etc. kan dels medføre prædisposition for råd ved at skabe indfaldsveje for patogener og dels medvirke til at patogener spredes til ikke kontaminerede produkter (Spurr, 1994). Lagerbetingelserne Høstprodukternes resistens overfor postharvest patogener er tæt knyttet til modningsprocessen. Med få undtagelser stiger frugt og grønsagers modtagelighed overfor postharvest patogener således stærkt med stigende senesceringsgrad af vævet (Arul, 1994; Sommer, 1985 a). En passende modenhedsgrad ved høst samt lagerbetingelser der minimerer respiration og senescens under lagring er afgørende for produkternes resistens overfor postharvest patogener. Under lagring er miljøbetingelserne mere ensartede end under markforhold, idet temperatur, fugtighed og /eller luftarternes sammensætning kan kontrolleres i større eller mindre grad (Lacey, 1989). Temperatur Temperaturen er formodentlig den faktor, der påvirker holdbarheden af produkter og herunder udvikling af lagersygdomme mest. En lav temperatur under lagring og transport undertrykker sygdomsudvikling på to måder, dels ved direkte at hæmme patogeners vækst og dels ved at opretholde værtens naturlige resistens ved at forsinke senescens. I tabel 2.6 er angivet idealkrav til opbevaring af frugt og grønsager udarbejdet af Bioteknisk Institut (Anon., 1984 & 1986). Samtidig er nogle af de alvorligste lagersygdomme angivet. For de fleste produkter anbefales en lagertemperatur på ca. 0°C som optimal eks. æble, gulerod. En del produkter er følsomme overfor køleskader og må derfor opbevares ved højere temperaturer såsom kartoffel 4-6°C, agurk 7-14 °C og tomat 11-14°C. Vandindhold og pH Langt de fleste frugter og grønsager har højt vandindhold og en nærings sammensætning, der kan understøtte vækst af mikroorganismer. Frugt har dog generelt lav pH og angribes derfor primært af svampe, mens grønsager er modtagelige for både svampe og bakterier (Bulgarelli & Brackett, 1991; Pitt & Hocking, 1985). Tabel 2.6. Anbefalede lagerbetingelser under transport og/eller lagring af frugt og grønsager med hensyn til temperatur, luftfugtighed og kontrolleret atmosfære (O2 og CO2). Vigtige postharvest patogener er endvidere angivet. Table 2.6. Recommended storage conditions regarding temperature, relative humidity and controlled atmosphere during transport and storage. Important postharvest pathogens are mentioned. 1) Idealkrav til temperatur og relativ luftfugtighed ved
lagring af frugt og grønt (Anon, 1984 & 1986) Når produkterne når ud i detailhandlen, transporteres eller opbevares hjemme hos forbrugeren, er det ikke sandsynligt at lagerbetingelser skitseret i Tabel 2.6 opretholdes. Der må nok generelt regnes med betydeligt højere temperaturer, hvilket i de fleste tilfælde øger væksten af mikroorganismer, især hvis fugtigheden samtidig er høj. Kontrolleret atmosfære Kontrolleret atmosfære (KA) anvendes ofte under transport og/eller lagring af frugt og grønsager. Atmosfærens sammensætning ændres, hvilket oftest indebære reduktion af oxygen (O2) og/eller forhøjelse af carbondioxid (CO2) koncentrationen (Kader, 1985, Spott & Sanderson, 1994). Kommerciel anvendelse af KA finder mest sted indenfor produktion af frugter som æbler, jordbær, pære og indenfor grønsager som salat, kål og tomat. I tabel 2.6 er anbefalede koncentrationer af O2 og CO2 angivet. I forhold til bekæmpelse af efterhøst sygdomme har KA dels en indirekte effekt ved at forlænge produkternes shelf-life og dels en direkte reducerende effekt på sygdomsudvikling af visse patogener. Sommer et al. (1981) fandt eksempelvis at ved en reduktion af O2 koncentrationen til under 2% blev væksten af B. cinerea reduceret. 2.3.2 Lagring af cerealierKorn er altid kontamineret med mikroorganismer i form af primært svampe og gærsvampe. Den mikrobiel le populations størrelse og sammensætning (Tabel 2.5 ) er dog stærkt afhængig af kornets udvikling og modningsgrad før høst og af de efterfølgende lagerbetingelser (Lacey et al., 1991). Ved høst vil kernerne i høj grad være invaderet med såkaldte marksvampe så som Alternaria spp., Cladosporium spp., Fusarium spp. og Drechslera spp. Der er som regel kun små mængder inokulum på kernerne inden høst af slægter som Aspergillus og Penicillium. Konidier af disse deciderede lagersvampe forekommer med lav frekvens i luft over åbent land og ofte med høj frekvens i lukkede rum, hvilket betyder at korn kan bliver yderligere kontamineret under lagringsprocessen. Ved høstprocessen kan kernerne også blive kontamineret med jordbårent inokulum. Med stigende lagertid vil der som følge af respiration ske en gradvis kvalitetsforringelse af cerealier. Den generelle kvalitetsforringelse kan dog accelereres kraftigt som følge af mikroorganismernes (svampes) aktivitet. Derudover er arter indenfor slægterne Aspergillus og Penicillium stand til at producere mykotoksiner i korn under specifikke vækstvilkår (se endvidere kapitel 4). Vandindhold/vandaktivitet I relation til mikroorganismers vækst er vandtilgængelighed den mest betydende faktor for en god opbevaring af korn, og derfor bliver cerealier ofte tørret for at nedbringe vandindholdet i kernerne. Vand der er tilgængeligt for vækst af mikroorganismer udtrykkes bedst ved hjælp af enheden vandaktivitet (aw), der defineres som forholdet mellem vanddamptrykket i substratet (P) og vanddamptrykket i rent vand (P0) ved samme temperatur. Vandpotentialet (Y), der udtrykker summen af osmotisk, matrix og turgor potentialer, er også et mål for tilgængelighed af vand. Mikroorganismer reagerer således i relation til aw (eller Y) og ikke på vandindholdet som sådan. Svampevækst kan foregå i området fra 1.00 (rent vand) og ned til 0.6 aw (Lacey, 1989; Lacey et al.,1991). Den nedre grænse for vandaktivitet med hensyn til vækst af de svampe der normalt findes på lagret korn er omkring 0.70 (-0.49 MPa). Med en vandprocent i kornet på omkring 13% vil risikoen for mykotoksin dannelse under lagring derfor være minimal (Hermansen & Stapel, 1979; Lacey et al., 1991). Som det fremgår af tabel 2.7 skal man være opmærksom på at tilsyneladende små udsving i vandprocenten på 1-2% giver betydelige udsving i aw og dermed i mikroorganismernes muligheder for aktivitet. Tabel 2.7 Sammenhæng mellem vandindhold i korn og vandtilgængelighed (Lacey et al., 1991). Table 2.7. The correlation between water content of grain and water availability.
Temperatur Temperaturen er afgørende for en svamps væksthastighed og dermed for den skade, der forvoldes i en given lagerperiode. Den optimale væksttemperatur er desuden afhængig af vandaktiviteten i substratet (Hermansen & Stapel, 1979; Lacey et al., 1991) Opsummering For optimal lagring anbefales det, at kornet nedtørres til ca. 13% vandindhold, og holdes konstant på dette niveau i lagerperioden. Under sådanne lagerforhold vil vandaktiviteten i kernerne være så lav at vækst af mikroorganismer generelt ikke er mulig. 2.4 Spredning af mikroorganismerDe fleste undersøgelser af mikroorganismers spredning i jord og fyllosfæren er udført med patogene svampe og bakterier. Men mange af de kendte spredningsmekanismer vil formodentlig være de samme for mikroorganismer generelt (Fitt et al., 1989; Ingold, 1979; McCartney, 1994; Wallace, 1978). 2.4.1 Jordboende mikroorganismerSpredning af bakterier i jorden sker med sammenhængende vandstrømme og er afhængig af porestørrelsen i jorden. Svampe har mulighed for aktiv spredning i jorden dels igennem zoosporer eller ved hjælp af mycelievækst igennem jorden. Spredning af jordbårne svampe og bakterier kan også ske passivt ved hjælp af jordens fauna, så som orme og insekter. Selvom jordbårne mikroorganisme og patogener i særdeleshed er tilpasset jordmiljøet, forekommer mange af disse organismer også ofte på overjordiske plantedele, det gælder blandt andet arter indenfor Penicillium, Fusarium, Rhizopus og Aspergillus (se tabel 2.4 og 2.5). Andre arter isoleres derimod meget sjældent i fyllosfæren. Der er som oftest tale om en passiv proces, hvor sporer eller mycelium spredes til overjordiske plantedele med fugle, dyr og insekter, med vedhængende jord på høstede planter eller som følge af vind eller maskinel bearbejdning af jord og afgrøder. Herved hvirvles jordpartikler op i luften, hvormed mikroorganismer kan transporteres over korte eller lange afstande og derved spredes til overjordiske plantedele. Ved høst af mange grønsager og cerealier kan jord og dermed mikroorganismer kontaminere produkterne (Wallace, 1978). 2.4.2 Fyllosfære mikroorganismerFor mikroorganismer, der befinder sig i fyllosfæren, sker spredning primært i form af sporer, ved hjælp af vind, regn, vandplask og insekter (Fitt et al., 1989; Ingold, 1960; 1979; McCartney, 1994). Spredning via luft Sporer kan frigøres som følge af en aktiv proces, hvor mekanismen bag frigørelsen generelt er stærkt afhængig af fugtighedsforholdene, som oftest høj fugtighed. Denne spredningsmekanisme findes især hos basidiosvampene og visse gærsvampe (Sporobolomyces, Tilletiopsis m.fl). Passiv frigørelse sker enten som en direkte følge af vind eller ved at blade og stængler bevæges som følge af vind eller kraftig regn. Studier af plantepatogene svampe har vist at luftbårne sporer kan spredes op til flere hundrede kilometer fra kilden, men at hovedparten af sporene afsætte indenfor få cm. Spredning af sporer via luften er kun af betydning såfremt sporene forbliver levedygtige (Ingold, 1979; McCartney, 1994). Temperatur, lys herunder især UV-lys, og resistens mod udtørring influerer på overlevelsen af sporer i luften. Afsætning (landing) af luftbårne sporer på planter kan ske ved sedimentation eller stød og er mere effektiv for store sporer eksempelvis Drechslera spp. end for små sporer eksempelvis Penicillium, Aspergillus spp. Afsætning med turbulente luftstrømme er formodentlig af størst betydning og er meget effektiv for alle typer af sporer. Luftbårne sporer kan dog også fanges af regndråber, og derefter afsættes på planter eller på jorden. Regn kan også skylle sporer af planterne, så disse derved spredes til jorden (Hermansen & Stapel, 1979; Ingold, 1979; McCartney, 1994). Vandplask Spores frigørelse og spredning kan også ske ved hjælp af vandplask, hvor sporene som oftest spredes over meget små afstande. Eksempelvis spredes konidier af Fusarium arter i stor udstrækning ved regnplask (Fitt et al., 1989; McCartney, 1994). Insekter Spredning med insekter er formodentlig af mindre betydning ihvertfald når det gælder epidemisk udvikling af patogener. Til gengæld kan insektspredning foregå inden for meget forskelligartede taksonomiske grupper ligesom mange forskellige insekttyper kan være vektorer så som bier, fluer, bladlus etc. (Ingold, 1979). For en specifik organisme må forhold vedrørende sporulering, sporestørrelse etc. kendes for at vurdere organismens muligheder for spredning indenfor og mellem habitater. 2.5 OpsummeringMikroorganismer findes overalt i vores miljø, og dermed også på alle ferske
planteprodukter til konsum så som frugt, grønsager og cerealier (Tabel 2.4 og 2.5 ). Som
det fremgår af redegørelsen vil muligheden for vækst af en introduceret/kontaminerende
mikroorganisme være meget afhængig af om denne introduceres til jorden, fyllosfære
eller til efterhøst produkter. Jorden/rhizosfæren er karakteriseret af en både
kvalitativ og kvantitativ stor naturligt forekommende saprofytisk mikroflora, der
konkurrerer intensivt om nicher med tilgængelig næring. De komplicerede sammenhænge
mellem miljø, plante og mikroorganismer som er gældende i jord og rhizosfæren gør det
vanskeligt at forudse en introduceret organisme mulighed for aktivitet og overlevelse.
Fyllosfæren er et meget dynamisk habitat, der generelt er karakteriseret af store
fluktuationer i temperatur og fugtighed, der kræver stor tilpasningsevne af
mikroorganismerne. Tilgængelige næringskilder for saprofytisk vækst af mikroorganismer
er stærkt begrænsede og ændres successivt i løbet af vækstsæsonen. Efterhøst
miljøet er derimod mere stabilt og defineret med hensyn til klimaparametre og substrat.
Optimale lagerbetingelserne for henholdsvis frugt og grønt og for cerealier er meget
forskellige. Frugt og grønsager lagres ved høj luftfugtighed og en lav lagertemperatur,
der er afgørende for såvel kvaliteten generelt og som for udvikling af lagersygdomme.
For optimal lagring af cerealier anbefales det, at kernerne nedtørres til ca. 13%
vandindhold og holdes konstant på dette niveau i lagerperioden. Under sådanne
lagerforhold vil vandaktiviteten i kernerne være så lav, at vækst af mikroorganismer
generelt ikke er mulig. 3. Mikrobiologisk bekæmpelse af plantepatogener.3.1 Generelle forhold og principperDefinitioner Biologisk bekæmpelse af plantepatogener kan i bred betydning defineres som "ethvert tiltag der bygger på biologiske mekanismer eller organismer, der kan reducere mængden eller effekten af patogener" . En definition der bygger på en almindelig accepteret definition udarbejdet af Baker & Cook (1974) "Biological control is the reduction of inoculum density or disease-producing activities of a pathogen or parasite in its active or dormant state, by one or more organisms, accomplished naturally or through manipulation of the environment, host, or antagonist or by mass introduction of one or more antagonists". Når biologisk bekæmpelse foretages med mikrobiologiske bekæmpelsesmidler (MBO) kan definitionen dog indsnævres til at gælde "kontrolleret applikation af gavnlige mikroorganismer (antagonister), der kan hæmme patogener og sygdomsudvikling". I den forbindelse skal det nævnes at aktivstoffer i mikrobiologiske bekæmpelsesmidler ifølgedansk lovgivning er defineret som følger: Ved mikrobiologiske aktivstoffer forestås levende mikroorganismer, herunder vira, som har generel eller specifik virkning mod skadegørere eller på planter, plantedele eller planteprodukter i kraft af mikroorganismerne selv eller et eller flere stoffer produceret af disse" (jf. lovbekendtgørelse nr. 583 af 9. juli 1993) Principper Forskellige strategier kan lægges til grund for biologisk bekæmpelse af plantepatogener (1) at reducere det primære inokulum i form af patogenets hvile eller overlevelsesstrukturer, (2) at hæmme eller forhindre at patogenet penetrerer og inficerer værtplanten (3) at undertrykke patogenets mulighed for mycelievækst eller sporulering og dermed hindre eller reducere sygdomsspredning ved at reducere sekundær smitte (Papavizas & Lumsden, 1980; Fokkema, 1995). Virkningsmekanismer De mekanismer, der er involveret i biologisk bekæmpelse, deles ofte op i fire hovedgrupper: (1) Antibiosis: kan defineres som en organismes inhibering af en anden ved produktion og udskillelse af en eller flere sekundære metabolitter. Der vil ofte være tale om væksthæmning men effekten kan også være letal, (2) Konkurrence: hvor antagonisten konkurrere med patogenet om næring (i form af carbonhydrater og N-forbindelser, plads og O2, (3) mykoparasitisme: hvor antagonisten parasiterer patogenet og modtager en del eller al sin næring fra vært svampen og (4) Induceret resistens: antagonisten inducerer resistensmekanismer i værtplanten, der har en hæmmende effekt på patogenet . En antagonists virkemåde vil som oftest være et samspil mellem flere mekanismer, og grænserne mellem mekanismerne er ikke klart adskilte. Derudover er det også muligt at forskellige mekanismer er operative under forskellige miljøforhold (Cook & Baker, 1983). I de fleste tilfælde, hvor biologisk bekæmpelse af patogener er påvist in vivo, er den/de specifikke virkningsmekanismer ikke kendt. Et generelt erkendt problem ved biologisk bekæmpelse har været meget uensartede resultater og svigtende bekæmpelseseffekt, når testen af organismerne flyttes fra kontrollerede laboratorier eller væksthusbetingelser til markforhold, det gælder både for bekæmpelse af jordbårne patogener og for patogener i fyllosfæren. I forhold til rhizosfære og fyllosfære udgør efterhøst miljøet formodentlig den økologiske niche, hvor biologisk bekæmpelse har størst chance for at blive en succes. Det skyldes, at det i langt højere grad er muligt at kontrollerer miljøbetingelserne på et lager på en sådan måde at disse er fremmende for den biologiske bekæmpelsesorganisme (Spotts & Sanderson, 1994). Isolering og selektion Mange af de mikroorganismer der søges anvendt til biologisk bekæmpelse er naturligt forekommende organismer, der isoleret fra eksempelvis jord, rhizosfære, fyllosfære og frugter. Ved hjælp af enten in vitro eller in vivo screeningssystemer, der selekterer for ønskede egenskaber, er potentielle antagonister udvalgt. Forbedring af specifikke egenskaber hos selekterede organismerne, så som rhizosfærekompetance, saprofytisk konkurrenceevne og produktion af antibiotika er også opnået ved hjælp af mutation, protoplast fusion og andre metoder til genmodificering af mikroorganismer (Harman, 1991; Weller & Thomashow, 1994). Produktion og formulering Gennem produktion og formulering af antagonisten kan den biologiske bekæmpelseseffektivitet og stabilitet samt produktets shelf-life forbedres. Her tænkes specielt på valg af antagonist struktur (eksempelvis sporer, klamydosporer, mycelium etc.), produktionsmetode og medievalg, valg af formulering eksempelvis pulver, granulat, piller eller flydende form samt formulering med specifikke næringsstoffer, klæbemidler, fyldstoffer, afspændingsmidler m.v. (Harman, 1991; Lewis & Papavizas, 1991; McIntyre & Press, 1991; Slininger et al., 1996). 3.2 Metoder til applikation af biologiske bekæmpelsesmidlerDen metode der benyttes til applikation af antagonisten er afhængig af det pågældende patogens livscyclus og patogenese og dermed hvilket trin i plantens udvikling der søges beskyttet. Denne sammenhæng er illustreret i tabel 3.1. Frøbejdsning Antagonisten formuleres på frøet og applikeres til jord eller voksemedium ved såning af frøet. Formålet vil være at bekæmpe frøbårne patogener og/eller jordbårne spiringsskadende patogener. Den mængde aktivt stof der udbringes ved frøbejdsning vil være afhængig af såvel doseringen af spiredygtige enheder per frø som af plantetal per m2. Med de doseringer der er arbejdet med for svampe (103-105 cfu/frø ), og et plantetal per m2 der kan varierer fra 5 til 400, vil det betyde, at der tilføres fra 5 x 103 og op til 5 x 107 cfu/m2 (Tabel 3.2). Tabel 3.1 Potentiel biologisk bekæmpelse af patogener på forskellige plantedele i relation til applikationsmetoden er markeret med +. Table 3.1. Potential biological control of pathogens occurring on different plant parts in relation to method of application is market with +. 1) Beskyttelse af rodsystemet mulig såfremt den biologiske
organisme er rhizo- sfære kompetent På frøet vil antagonisten kunne være aktiv i spermosfæren, og hvis antagonisten desuden er rhizosfærekompetent vil der ske en kolonisering af plantens rodnet. Graden af kolonisering er afhængig af jordtype, planteart samt konkurrence med den naturligt forekommende mikroflora i rhizosfæren som beskrevet i afsnit 2.1.3. Såfremt organismen er non- rhizosfærekompetent vil spiringsenheder, der eventuelt er produceret i spermosfæren være i hvile (fungistasis) uden mulighed for aktivitet med mindre at egnede næringskilder bliver tilgængelige. Formuleringen af antagonisten på frø med additiver som eksempelvis specifikke næringskilder og klæbemidler kan være med til at skabe et miljø omkring frøet, der er mere fordelagtig for den mikrobiologiske bekæmpelsesorganisme og derigennem fremmer organismens aktivitet og effektivitet (Harman, 1991; Harman & Taylor, 1988; Jensen et al., 1996). Tabel 3.2. Tilført antal spiringsenheder af en antagonist per m2 jord i forhold til doseringen (cfu/frø) og antal planter per m2. Table 3.2. The number of applied antagonistic propagules per m2 in relation to dosage (cfu/seed) and number of plants per m2.
Iblanding til voksemedier Ved iblanding af mikrobiologiske midler til voksemediet inden såning eller udplantning af stiklinger og udplantningsplanter, er det muligt at bekæmpe rodpatogener. Det har generelt vist sig at være vanskeligt at etablerer en høj population af en introduceret mikroorganisme i et komplekst økosystem som jorden, idet en stor naturlig population af bakterier og svampe i forvejen er etableret i de næringsrige mikrohabitater (Deacon, 1991; Alabouvette & Steinberg, 1995; Lumsden & Lewis, 1989). En introduceret population af bakterier eller svampe kan overleve fra få uger og op til flere år i jorden som eksempelvis inaktive sporer (fungistasis). Aktivitet i form af spiring og vækst finder kun sted såfremt en passende næringskilde er tilstede eller tilføres til jordmiljøet. Decline i populationer af MBO introducerede til jord sker generelt hurtigere for bakterier end for svampe. Et andet problem ved iblanding af MBO direkte til jorden er, at der skal tilføres så store mængder for at opnå en god bekæmpelse, når det drejer sig om landbrugsafgrøder, at det generelt set er uøkonomisk. Derimod synes iblanding af MBO til væksthus-afgrøder at have et større perspektiv, dels fordi at der anvendes relativt små mængder voksemedium og dels fordi at mange af de anvendte voksemedier, så som sphagnum og pasteuriseret jord, menes at have en lavere mikrobiel bufferkapacitet, hvorved antagonisten får bedre mulighed for at etablere sig (Deacon, 1991; Green, 1996; Lumsden & Lewis, 1989). Etablering af MBO i jord og vokemedier kan optimeres gennem formuleringen ved eksempelvis at immobilisere organismen i alginatpiller tilsat en passende næringskilde, som antagonisten derved får førsteret til at udnytte (Lumsden & Lewis, 1989; Walter & Lumsden,1997). Udsprøjtning/udvanding Ved udsprøjtning af det biologiske middel er det muligt at applikere biologiske midler fra såning og frem til høst og ved lagring. Ved udsprøjtning/udvanding af suspension af produktet på jordoverfladen er det teoretisk muligt at bekæmpe frø- og jordbårne patogener. I praksis vil det dog være vanskeligt at etablerer en tilstrækkelig høj og aktiv koncentration af mikroorganismen i voksemediet generelt af samme årsag som anført vedrørende etablering af MBO ved iblanding. Ved udsprøjtning af MBO i fyllosfæren kan blade, blomster og frugter beskyttes mod patogener. Overlevelse af MBO i fyllosfæren er generelt begrænset fra få dage til få uger, og det er derfor ofte nødvendigt med mange behandlinger. Det skyldes, at MBO'er ofte ikke er tilpasset fyllosfære miljøet og ikke kan udnytte de sparsomme næringskilder der er tilstede, og dels at der som regel allerede er en etableret mikroflora tilstede, når antagonisten introduceres. Succes vil ofte være betinget af at der er tilgængelig næring f.eks. i form af senescent væv, henfaldne kronblade, pollen og honningdug, eller at patogenet har skabt indgangsveje til næring, som antagonisten kan udnytte i konkurrence med patogenet eller at MBO introduceres til en nyligt opstået næringsrige nicher (sårflader), der endnu ikke er koloniseret af den naturlige mikroflora (Deacon, 1991; Fokkema, 1993; Elad et al., 1996; Köhl & Fokkema, 1994). Biologisk bekæmpelse af lagersygdomme kan ske ved direkte sprøjtning med MBO på produkterne eller dypning i suspensioner af MBO for visse produkter (æble, gulerod). Et af hovedproblemerne ved mikrobiologisk bekæmpelse af lagersygdomme er, at antagonisten ofte skal være aktiv ved lav temperatur (Arul, 1994). Det skyldes, at langt de fleste frugter og grønsager lagres ved temperaturer omkring 0°- 6°C og måske også i kontrolleret atmosfære, der ikke er optimal for antagonisten (se tabel 2.6). Opsummering Mikrobiologisk bekæmpelse af plantepatogener bliver formodentlig kun en succes,
såfremt antagonisten er stand til at være aktiv og konkurrencedygtig i det samme
mikrohabitat, som patogenet, der skal bekæmpes, er tilpasset til. Det betyder som
udgangspunkt, at et indgående kendskab til såvel patogenets som antagonistens økologi
er nødvendigt for at kunne vælge den rette applikationsmetode og det rette
applikationstidspunkt. 4. Naturligt forekommende mikroorganismers toksinproduktion i planteprodukter.Mange af de mikroorganismer der findes naturligt på planter i vækstperioden, på efterhøstprodukter under transport og lagring og i jorden er kendt for at kunne producere toksiske metabolitter, der kan detekteres i planteprodukter. Det gælder især arter indenfor svampeslægterne Aspergillus, Penicillium, Fusarium og Alternaria, der potentielt kan producere en lang række mykotoksiner (Betina, 1989 & 1994; Frisvad & Samson, 1991, Smith et al., 1994). Indenfor disse slægter findes der både patogene og saprofytiske arter, der er stærk involveret i ødelæggelse og nedbrydning af afgrøder i marken og under transport og lagring. Betina (1994) har opstillet tre overordnede betingelser der influerer på produktionen af toksiner i naturlige habitater:
Selv om en organisme, der er kendt for at kunne producere sekundære metabolitter, detekteres i eller på et produkt, kan der udelukkende drages definitive konklusioner om forekomsten af metabolitter, såfremt disse isoleres og identificeres. Det skyldes først og fremmest:
4.1 Naturlig forekomst af toksiske metabolitter i planteprodukter.Penicillium Arter indenfor slægten Penicillium forekommer hyppigt i fyllosfæren og på høstede produkter (tabel 2.4 og 2.5). Det er estimeret at 70-80% af Penicillinerne potentielt er stand til at producerer mykotoksiner (Pohland & Wood, 1987). Vigtige naturlig forekommende Penicillium toxiner i planterprodukter er citrinin, penicillic acid og ochratoxin A, der primært forekommer i korn samt patulin, der primært er detekteret i frugt og grønsager (tabel 4.1 og 4.2). Ifølge Smith et al., (1994) er æblejuice ofte kontamineret med patulin, men niveauet er generelt meget lavt i størrelsesordenen <100 ppb. Aspergillus Arter indenfor slægten Aspergillus kan ofte detekteres i fyllosfæren, og forekommer hyppigt på især lagret korn, men også på høstprodukter af frugt og grønsager (Bulgarelli & Brackett, 1991), se endvidere tabel 2.4 og 2.5. De vigtigste toksiner produceret af Aspergillus spp. er aflatoksinerne B1, B2, G1, G2, der formodentlig er de mest dokumenterede mykotoksiner på verdensplan i fødevarer. De højsete koncentrationer af toksinerne er fundet i visse typer af nødder og frø (Smith et al., 1994). Ochratoxin A produceres af Aspergillus spp. er også detekteret i planteprodukter (Tabel 4.1). I Danmark er der fastsat maksimalgrænseværdier for indhold visse mykotoksiner i levnedsmidler: for aflatoxin B1, (2 µg/kg), for summen af aflatoksinerne B1, B2, G1, G2 (4µg/kg) og for ochratoksin A (5µg/kg korn eller kornprodukt) Fusarium Arter indenfor slægten Fusarium kan detekteres i fyllosfæren, på korn og grønsagsprodukter. Mange af Fusarierne optræder som patogener. Fusarium spp. kan potentielt producere en lang række trichothecene mykotoksiner. Indenfor trichothecenerne kan toxiner som DON (Tabel 4.2), T-2 og DAS detekteres i planteprodukter (Smith et al., 1994). Alternaria Næst efter Cladosporium er sporer af Alternaria spp (A. Alternata, A. tenius) blandt de mest almindeligt forekommende luftbårne sporer over det meste af verden (Lacey, 1989). Alternaria er derfor også almindeligt forekommende på de fleste planteafgrøder i fyllosfæren og på frugter, bær og korn ved høst (se tabel 2.4 og 2.5). Alternaria spp. kan producere adskillige mycotoxiner så som tenuazonic acid (TA), alternariol (AOH), alternariol methylether (AME), der er detekteret i en lang række fødevarer inficeret med Alternaria spp. (Pohland & Wood, 1987; Lacey, 1989; Visconti & Sibilia, 1994) (se tabel 4.1). Tabel 4.1. Eksempler på naturlig forekomst af toxiner i frugt og grønsager (Mod. efter Pohland & Wood, 1987; Speijers & Egmond, 1993). Table 4.1. Examples of natural occurrence of mycotoxins in fruits and vegetables.
Tabel 4.2. Naturlig forekomst af mycotoksinerne ochratoxin A og DON i cerealier (Modificeret efter Pohland & Wood; Speijers & Egmond, 1993) Table 4.2. Natural occurrence of the mycotoxins ochratoxin A and DON in cereals.
I en rapport udarbejdet for EU-kommisionen "Mycotoxins in Human Nutrition and Health" (Smith et al., 1994) konkluderes det blandt andet, at 20% af kornafgrøderne produceret i EU har et måleligt indhold af myktoksiner. 4.2 Økologiske parametres betydning for mikroorganismers aktivitet og toksinproduktion.Mykotoksiner kan produceres på planter i vækst og derved kontaminerer høstprodukter eller produktionen kan ske under transport og lagring af de høstede produkter. Såvel vækst af svampene som produktion af mykotoksiner er stærkt afhængig af miljøfaktorer, men de betingelser der understøtter toksinproduktionen er oftest mere specifikke end betinglserne for vækst generelt (Frisvad og Samson; 1991) Mykotoksinproduktion under markforhold. De mikroorganismer der i stand til at producere mykotoksiner i afgrøder på marken findes primært indenfor slægterne Aspergillus og Fusarium. Indenfor Fusarium drejer det sig under danske forhold primært om de patogene arter F. graminearum og F. culmorum, der kan inficere aks og kerner og producere mykotoksiner under særlige klimatiske betingelser. Mykotoksinproduktion under lagring Såfremt en mikroorganisme der potentielt er toksinproducerende er tilstede på et lagret produkt, er der en lang række økologiske parametre der influerer på vækst og toksindannelsen. Vigtige faktorer er produktets kemiske sammensætning og fysiologiske tilstand, vandaktivitet, temperatur, pH, mekanisk beskadigelse, beskadigelse som følge af insekters aktivitet, O2 og CO2 niveau og interaktioner mellem mikroorganismer (Ominski et al., 1994; Betina, 1994). Temperatur og vandaktivitet Generelt set er især vandindhold og temperaturforhold under lagring kritiske faktorer, der er stærkt bestemmende (begrænsende) for en specifik svamps vækst og produktion af sekundære metabolitter (Betina, 1994). Som det fremgår af tabel 4.3 er den nedre temperaturgrænse for vækst og dermed potentiel mulighed for mycotoksinproduktion meget varierende fra art til art. P. digitatum kan kun vokse i intervallet 6° til 37°, mens P. expansum er i stand til at vokse ved temperaturer helt ned til -6°C. Også med hensyn til vandaktivitet er der stor variation mellem slægter og arter. Generelt er aw minimums grænsen for vækst lavere end aw værdien for toksin produktion. Eksempelvis kan P. expansum vokse ved vandaktivitet ned til 0.82-0.85, mens produktion af mycotoksinet patulin kræver en vandaktivitet på minimum 0.99 (Frisvad & Samson, 1991). Tabel 4.3. Eksempler på svampe der kan producere mycotoksiner på foder og fødevarer. Temperaturområde og optimum for aktivitet samt laveste aw for henholdsvis svampevækst og toksinproduktion er angivet. Table 4.3. Fungi able to produce mycotoxins on foods and feeds. Temperature range and optimum for activity plus minimal aw for growth and toxin production is shown 1) kilde Lacey, 1989 Kontaminering af planteprodukter med mykotoksiner som følge af svampeaktivitet, kan i mange tilfælde undgåes eller minimeres såfremt, produkterne høstes på det optimale tidspunkt, håndteres korrekt og skånsomt, og lagres under fysiske forhold, der så vidt mulig hindre vækst af mikroorganismer. Væsentlige betingelser for god lagning af udvalgte planteprodukter er beskrevet i afsnit 2.3. 4.3 Sekundære toksiske metabolitter i jord4.3.1 Forekomst og nedbrydningForekomst af organismer Mange af de antibiotika- og mykotoksinproducerende svampe og bakterier som Aspergillus, Penicillium, Fusarium og Streptomyces er naturligt forekommende i jordøkosystemer (Domsch et al., 1980). I tabel 5.4 er der vist eksempler på naturlig forekomst af potentielt mykotoksinproducerende svampearter og slægter i landbrugsjorde. Produktion af toksiner Nielsen (1995) udarbejdede en rapport på baggrund af en gennemgang af litteraturen og fandt at der er meget få informationer omkring produktion af sekundære metabolitter som antibiotika og mykotoksiner i jord. Kun i en enkelte undersøgelse fra 1969 blev der detekteret patulin i en hvededyrket jord. Den højeste produktion var koncentreret omkring organisk materiale i jorden. Nielsen (1995) konkluderede på linie med Williams & Vickers (1986), at mykotoksiner sandsynligvis forekommer naturligt i jord, i kortvarige perioder, i områder lokaliseret omkring organisk materiale. Detektion De få eksisterende informationer omkring forekomst af mykotoksiner i jord kan dels henføres til tekniske vanskeligheder ved isolering af metabolitterne, og dels at sekundære metabolitter vil være uensartet fordelt i jorden og oftest koncentreret omkring næringkilder i form planterester og rødder. Tabel 4.4. Naturlig forekomst af mykotoksinproducerende svampeslægter og arter i landbrugsjorde Table 4.4 Natural occurrence of mycotoxin producing fungi in soils. Nedbrydning og adsorbtion En hurtigt nedbrydning enten kemisk eller mikrobiologisk af mykotoksiner i jord samt adsorbering af især basiske toksiner til jordpartikler regnes for at være stærkt medvirkende til, at det generelt er vanskeligt at påvise metabolitproduktion i jorden (Gottlieb, 1976; Williams & Vickers, 1986; Nielsen, 1995). 4.3.2 PlanteabsorptionPlanteabsorption Såfremt planter dyrkes i jord og voksemedier, der er kontamineret med sekundære metabolitter, er der en potentiel mulighed for at planterne kan optage sådanne stoffer. Mertz et al, (1981) kunne detektere aflatoksin B1 (AFB1) i kimrødder og blade af salat 7 til 10 døgn efter udplantning af forspirede frø i henholdsvis steril og usteril jord tilført aflatoxin AFB1 (125µg/1.5 g jord). Den mængde AFB1 som salatkimplanter i usteril jord absorberede svarede kun til 0.2-0.8% af den mængde der var tilsat jorden, men undersøgelsen demonstrere dog, at en sekundær metabolit i jord kan absorbers af planter. 4.4 Toksiske sekundære metabolitter i sporerEn række undersøgelser har vist, at sporer fra mange almindeligt forekommende svampearter kan indeholder toksiske sekundære metabolitter (Tabel 4.5). Disse toksiner kan formodentlig medføre en direkte sundhedskadelig toksisk effekt ved inhalering af større mængder sporer. Desuden er toksiner i sporer muligvis også involveret i udvikling af human allergier (Smith et al., 1994). Tabel 4.5. Toksiske sekundære metabolitter detekteret i svampesporer. Table 4.5. Toxic secondary metabolites in fungal spores 4.5 OpsummeringIndefor svampeslægterne Aspergillus, Penicillium Fusarium og Alternaria findes der både patogene og saprofytiske arter, der er stærk involveret i ødelæggelse og nedbrydning af afgrøder i marken og under transport og lagring. Mange af disse arter er også i stand til at producere mykotoksiner og disse detekteres hyppigt i visse planteprodukter til konsum, så som cerealier. Mykotoksiner kan produceres på planter i vækst og derved kontaminere høstprodukter, eller produktionen kan ske under transport og lagring af de høstede produkter. Såvel vækst af svampene som produktion af mykotoksiner er stærkt afhængig af miljøfaktorer (substrat, vandaktivitet, temperatur, mikrobiel interaktion etc.. De betingelser der understøtter toksinproduktionen er oftest mere specifikke og begrænsede end betinglserne for vækst. Risikoen for produktion af mykotoksiner på høstprodukter øges, hvis produkterne
lagres under ugunstige forhold, det vil blandt andet sige forhold der accelererer
produkternes naturlige nedbrydning og senescens (specielt frugt og grønsager) eller med
et vandindhold, der er for højt (primært cerealier). Under sådanne betingelser vil
mykotoksinproducerende patogener og svækkelsesparasitter have gode muligheder for vækst
og potentiel mykotoksinproduktion. 5. Biologiske bekæmpelsesorganismers produktion af sekundære metabolitter in vivoMange slægter af phyllosfære, jord og rhizosfære mikroorganismer herunder svampe, gær og bakterier er rapporteret at kunne producere sekundære metabolitter, så som antibiotika, der har en hæmmende effekt på mikroorganismer, eller sekundære metabolitter der er toksiske overfor dyr og mennesker så som mycotoksiner (Betina, 1989; Blakeman & Fokkema, 1982; Lübeck, 1994; Stirling et al., 1995; Smilanick, 1994). Antibiosis regnes da også for at være en mekanisme, der ofte er involveret i biologisk bekæmpelse af plantepatogener, selvom metabolitproduktion in situ som oftest ikke er påvist. 5.1 Indirekte bevis for antibiosis in vitroIn vitro produktion Mange af de mikroorganismer, der har udvist effektiv biologisk bekæmpelse af plantesygdomme, heriblandt de arter, der ønskes anvendt i Danmark, har vist sig at være i stand til potentielt at producere sekundære metabolitter. I tabel 5.1 er antallet af identificerede metabolitter fra udvalgte mikroorganismer listet (Lübeck, 1994). Listen er dog ikke komplet, idet der konstant isolereres og identificeres nye stoffer. I forbindelse med disse stoffers eventuelle produktion in vivo og dermed potentiel risiko for at fødevarer kontamineres med toksiske metabolitter skal flere vigtige forhold tages i betragtning:
Dilemma Hvordan skal man med hensyn til risikovurdering forholde sig til en organisme, der in vitro producerer en lang række metabolitter, hvoraf en eller flere antages at kunne være skadelige for mennesker, men hvor der ikke er indikation for, at antibiosis som følge af metabolitproduktion er involveret i bekæmpelsen. Skal der analyseres for restkoncentrationer af toksiske metabolitter, og i givet fald hvilke ?. Tabel 5.1. Antal identificerede sekundære metabolitter fra udvalgte mikrobiologiske bekæmpelsesmidler (MBO)1). Oplysninger vedrørende markedsføring af MBO og godkendelse af MBO i andre EU lande eller USA er angivet. Table 5.1. Number of identified secondary metabolites from biological control agents (BCA). Information on BCA marketed in Denmark and registration in other EU countries or the USA. 1) Lübek, 1994 5.2 Indirekte bevis for antibiosis in vivoNon-metabolitproducerende mutanter I bestræbelserne på at bevise sekundære metabolitters betydning i praktisk biologisk bekæmpelse, er der indenfor de seneste år anvendt et approach der bygger på in vivo assay og molekylær genetiske metoder med følgende hovedpunkter: (i) Der udvikles et plantebioassy, hvor biologisk bekæmpelsesaktivitet kan påvises, (ii) et vildtypeisolat med god bekæmpelsesaktivitet in vivo og som producere antibiotika in vitro selekteres, (iii) vildtypeisolatet muteres, og en mutant, der ikke kan producere det pågældende antibiotika selekteres, og (iv) ved hjælp af et genomisk bibliotek fra vildtype isolatets DNA komplementeres mutant- isolatet, så evnen til antibiotikaproduktion genetableres. Med udgangspunkt i den skitserede fremgangsmåde, er det med stor sandsynlighed vist, at de sekundære metabolitter phenazine og 2,4-diacetylphloroglucinol produceret af Pseudomonas fluorescens og P. aureofaciens er involveret i biologisk bekæmpelse af plantepatogener (Keel et al., 1992; Weller & Thomasshow, 1994). Wilhite et al. (1994) viste at gliotoxin produceret af Trichoderma virens er involveret i biologisk bekæmpelse af rodpatogenet Pythium ultimum in vivo. Syv mutanter med manglende evne til gliotoxin produktion gav således relativt set kun 54% sygdomshæmning som gennemsnit i sammenligning med vildtypen (100%), der blev dog ikke ikke fremstillet komplementerede gliotoxinproducerende mutanter. Studier som de ovennævnte repræsenterer stærke genetiske beviser, der understøtter, at antibiosis også kan spille en stor rolle for biologisk bekæmpelse af plantesygdomme med MBO i naturlige systemer in vivo. En anden fordel er, at der identificeres en metabolit, der med stor sandsynlighed produceres in vivo, og derved får man følgelig mulighed for at analysere planteprodukter med hensyn til eventuelle restkoncentrationer af den pågældende metabolit. Applikation af metabolitter til planter En anden metode til indirekte påvisning af sekundære metabolitters betydning i biologisk bekæmpelse af plantepatogener bygger på en direkte applikation af en metaboilt produceret af antagonisten in vitro til planter inokuleret med patogenet. Såfremt metabolitten kan hæmme patogenet in vivo, er det en indikation for at antibiosis er involveret i bekæmpelse in situ (Cutler & Hill, 1994; Kenerly & Andrews, 1990). 5.3 Produktion af sekundære metabolitter in situGrunden til, at der kun er få rapporter angående detektion af sekundære metabolitter i forbindelse med biologisk bekæmpelse af plantepatogener beror formodentlig på et eller flere af nedenstående forhold:
I det følgende vil den tilgængelige viden angående produktion af sekundære metabolitter detekteret in situ i forbindelse med mikrobiologiske bekæmpelsesorganismers aktivitet og bekæmpelse af plantepatogener blive beskrevet. 5.3.1 Jord og rhizosfæreGliotoxin Allerede i 50'erne blev gliotoxin isoleret fra frø og fra landbrugsjord iblandet plantemateriale, der var inokuleret med mikroorganismen Trichoderma viride (T. virens ?) (Wright, 1952). I løbet af 90'erne er der desuden kommet publikationer vedrørende produktion af gliotoxin i jord og voksemedier i forbindelse med biologisk bekæmpelse af rodpatogener som Pythium ultimum og Rhizotonia solani med Trichoderma virens formuleret i alginatpiller. Gliotoxin er rapporteret at have antibakteriel, antifungal, antiviral, immunosuppresive aktivitet og mammalian toxicitet. LD50-værdien er bestemt til 25 mg/kg (rotter) (Walter & Lumsden, 1997). Gliotoxin er følsom overfor oxidation og varme og toksinet inaktiveres efter 10 min. varmebehandling ved 100°C (Walter & Lumsden, 1997). Produktion på frø Wright (1956c) anvendte et isolat af T. viride, der producerede gliotoxin in vitro og viste, at der kunne isoleres gliotoxin fra frøskapper af ært, hvede og sennep frø, når disse var inokuleret (bejdset) med sporer af T. viride og inkuberet i usteril pottemuld. For frø inkuberet uden T. viride sporer kunne der ikke detekteres gliotoxin, hvilket viser, at frøeksudater understøttede produktionen af toksinet. Målinger af gliotoxin indholdet i ærtefrøkapper over en 12 døgns inkubationsperiode viste endvidere, at gliotoxin ikke blev introduceret med sporer af antagonisten, idet toksinet først blev detekteret efter 3 døgns inkubation. Den maksimale produktion af gliotoxin blev opnået efter 6 døgn, hvorefter produktionen faldt markant (tabel 5.2). Det beror formodentlig på at frøeksudater er en nødvendig og begrænsende næringskilde for produktionen af gliotoxin, og at eksudaterne er opbrugt i løbet af denne periode. Den nære sammenhæng mellem næringskilde og gliotoxinproduktion blev endvidere understøttet af undersøgelserne, der viste, at på det tidspunkt hvor den højeste koncentration af gliotoxin i frøkappen blev målt (89µg/g frøkappe), kunne der til sammenligning i jorden lige omkring frøet kun detekteres 0.4 µg per g jord (Wright, 1956c). Det var endvidere også muligt at detektere gliotoxin i frøkappen fra frø, der ikke var bejdsede med T. viride, såfremt frøene blev sået i en kompostjord med en stor naturlig forekomst af T. viride (Wright, 1956c). Tabel 5.2 Produktion af gliotoxin på ærtefrø bejdset med Trichoderma viride og dyrket i pottemuld inkuberet ved 25°C (modificeret efter Wright, 1956c). Table 5.2. Production of gliotoxin on pea seeds coated with Trichoderma viride and grown in soil at 25°C.
Produktion i jord tilsat planterester I flere undersøgelser er effekten af tilførsel af T. viride og organisk materiale til jord undersøgt. T. viride producerede gliotoxin i usteril jord, såfremt der samtidig blev tilført næring i form af 1-5% (w/w tørvægt) tørrede formalede kløverblade eller opblødte hvedestrå (Wright, 1952; 1956 a & b). Undersøgelserne viste endvidere, at en sænkelse af pH-værdier i jord eller tilsatte organiske substrater forøgede T. viride's produktion af gliotoxin i visse jordtyper (Wright, 1956b). Generelt var et højt indhold af tilgængelige planterester i jorden dog den mest betydende faktor for gliotoxinproduktion. Produktion fra alginatpiller Alginatpiller indeholdende T. virens og en næringskilde i form af hvedeklid kan ved iblanding til jord og kunstige vækstmedier bekæmpe rodpatogenerne Pythium ultimum og Rhizotonia solani (Walter & Lumsden, 1997). Gliotoksinproduktion menes at være en væsentlig mekanisme i den biolgiske bekæmpelse (Harris & Lumsden, 1997;Wilhite et al., 1994). Lumsden et al. (1992) undersøgte indvirkningen af dyrkningsmediets sammensætning på produktionen af gliotoxin efter iblanding af klid-alginat piller formuleret med T. virens til fire typer af vækstmedier. Som det fremgår af tabel 5.3 kunne der detekteres et højere indhold af gliotoxin i voksemedier og jorde med et højt indhold af organisk materiale end i mere mineralske jordtyper (sandjord). Andre undersøgelser har da også vist at næringsstoffer er nødvendige for den biologiske bekæmpelsesaktivitet af T. virens (Lewis & Papavizas, 1985 og 1987), ligesom produktion af gliotoxin in vitro er meget afhængig af næringsammensætningen. Temperaturens indflydelse på in vivo produktionen af gliotoxin er også undersøgt. I et voksemedium tilsat alignatpiller med T. virens, kunne gliotoxin detekteres efter 3 døgns inkubation i et temperaturinterval fra 15°C til 30 °C. Den største produktion blev detekteret ved 30°C, hvor produktionen var ca. 5 gange så stor som ved 15 °C (Lumsden et al., 1992). Tabel 5.3. Detektion af gliotoxin i jorde og voksemedier efter tilførsel af alginat/klid piller med Trichoderma virens og 3 døgns inkubation ved 20-25°C (Modificeret efter Lumsden et al., 1992). Table 5.3. Detection of gliotoxin in soils and artificial growth media after application of alginate/bran pills with Trichoderma virens incubated 3 days at 20-25°C.
1) sphagnum/vermiculit/næringsstoffer Persistens I en meget koncentreret blanding af usterilt voksemedie og alginat piller med T. virens (1:1 w/w) blev der detekteret op til 0.65 mg gliotoxin per g pille efter 1 døgns inkubation men ingen gliotoxin til t=0. Mængden af gliotoxin aftog med tiden men kunne dog detekteres efter 18 døgns inkubation (<0.1 mg/g pille) (Lumsden et al.,1992). Lumsden & Walter (1995) angiver, at gliotoksin produceret efter inkorporering af alginat piller i jord bevarer aktiviteten en kort periode, hvorefter toksinet inaktiveres af jordens mikrobiota. Det angives endvidere, at de undersøgelser der viser dette forhold, ikke er publiseret. Produktionsfasen Gliotoxin kunne detekteres i mediet i en afstand af 4-5 cm fra centrum af alginatpillen. Denne afstand var den samme som den afstand T. virens var vokset ud fra alginatpillen. Produktionen af gliotoxin var således associeret med mycelievækst i den ekspanderende koloni. In vivo blev gliotoxin altså dannet i vækstfasen (tropofasen) og ikke som det ofte synes at være tilfældet med sekundære metabolitter i den såkaldte stationære fase (idiofase) (Lumsden et al., 1992; Lübeck, 1994). Opsummering vedrørende gliotoxin Den mikrobiologiske bekæmpelsesorganisme T. virens ( evt. også T. viride) kan producere gliotoksin in vivo, men produktionen er stærkt afhængig af tilgang til en anvendelig næringskilde så som eksudater fra frø eller organiske planterester i jorden eller en formulering af organismen i alginatpiller tilsat passende næringskilder. En høj inkubationstemperatur på 25-30°C synes at være optimal for produktionen af gliotoksin i jord. Desuden tyder undersøgelserne på, at gliotoxinkoncentrationen i jord aftager forholdsvis hurtigt, dels når adgangen til næringskilder mindskes og dels som følge af mikrobiologisk nedbrydning og adsorption i jord og voksemedier. Phenazine Pseudomonas fluorescens isolat 2-79 blev isoleret fra hvederødder i en markjord, der var supressiv overfor goldfodsyge (take-all decline) fremkaldt af patogenet Gaeumanomyces graminis (Weller & Cook, 1983). Ved bejdsning af hvede med 2-79 er der i markforsøg opnået en god bekæmpelse af goldfodsyge. P. fluorescens er rhizosfære kompetent, og den biologiske bekæmpelseseffektivitet tilskrives i høj grad isolatets produktion af den sekundære metabolit phenazine eller PCA (phenazine-1-carboxylic acid) i rhizosfæren (Weller & Thomashow, 1994). PCA er et kondenseret heterocyklisk phenazine derivat med antibakteriel og antifungal aktivitet. LD50 angives til 400 i.v. (Lübeck, 1994). Tabel 5.4. Produktion af PCA i rhizosfæren af hvede bejdset med Pseudomonas fluorescens 2-79 og biologisk bekæmpelse af goldfodsyge i markjord (Mod. efter Thomashow et al.,1990). Table 5.4. Production of PCA in the rhizosphere of wheat coated with Pseudomonas fluorescens 2-79 and biological control of take-all in field soil.
1) Phenazine blev ekstraheret fra rødder med vedhængende
jord (friskvægt) Produktion i rhizosfæren PCA's betydning for biologisk bekæmpelse af goldfodsyge er vist ved hjælp af en mutant af 2-79 uden evnen til PCA- produktion (phz -) og en komplementeret mutants genetablerede PCA produktion (se evt. afsnit 5.2). PCA blev således kun isoleret fra rhizosfæren af planter fra frø bejdset med 2-79 vildtypen eller det komplementerede mutant-isolat (tabel 5.4). Produktionen af PCA i rhizosfæren fra 2-79 bejdsede hvedefrø dyrket under markforhold (12-27 ng PCA/g rod) var af samme størrelsesorden som for planter dyrket i væksthus. Væksthusforsøgene viste endvider, at PCA produktionen i rhizosfæren var uafhængig af, om jorden var inokuleret med patogenet. Det indikerer, at nærings-forsyningen i hvedens rhizosfæren generelt er tilstrækkelig til at understøtte produktion af PCA, uanset om patogenet er tilstede eller ej (Thomashow et al., 1990). 2,4-diacetylphloroglucinol Keel et al. (1992) anvendte et isolat af Pseudomonas fluorescens (CHA0) til iblanding til et voksemedie (gnotobiotisk system) bestående af vermiculit, kvartssand og kvartspulver, der blev inokuleret med patogenet Gaeumannomyces graminis var. tritici inden såning af hvede. Som det fremgår af tabel 5.5 var der en stærk positiv korrelation mellem sygdomshæmning og isolat CHA0 (CHAO,(phl+)) med det gen, der koder for metabolitten 2,4-diacetylphloroglucinol (phl). En mutant af CHA0 uden genet (CHA0, phl-) havde en langt svagere sygdomsreduktion. Ydermere kunne komplementering af mutanten (CHA625/pME3128, (phl+)) genetablere en højere grad af bekæmpelse. Det var endvider muligt at isoler phl fra rhizosfæren af hvederødder for begge phl+ isolater i størrelsesordenen 0.94-1.36 µg/g rod for CHA0 (phl+) og 0.19-0.26 µg/g rod for CHA625/pME3128 (phl+). Forsøget viser endvidere at bekæmpelsen ikke afhænger signifikant af rhizosfærepopulationen af Pseudomonas (Tabel 5.5) Tabel 5.5. Produktion af 2,4-diacetylphloroglucinol (phl) i rhizosfæren af hvede efter tilførsel af Pseudomonas fluorescens, bekæmpelse af Gaeumannomyces graminis og rhizosfærepopulationen af Pseudomonas. (Modificeret efter Keel et al., 1992). Table 5.5. Production of 2,4-diacetylphloroglucinol (phl) in the rhizosphere of wheat after soil application of Pseudomonas fluorescens, disease control of Gaeumannomyces graminis and the rhizosphere population of Pseudomonas. 5.3.2 Planteprodukter til konsumDet har ikke været muligt at finde eksempler på detektion af sekundære metabolitter på blade og frugter som følge af anvendelse af MBO til bekæmpelse af plantepatogener. Der er dog to undersøgelser, der påviser produktion af sekundære metabolitter på kartoffelknolde. Pyrrolnitrin blev detekteret i sår på kartoffelknolde en uge efter at kunstigt sårede knolde var inokuleret med Pseudomonas cepacia og patogenet Fusarium sambucinum (Burkhead et al., 1994). Hvert sår blev inokuleret med ca. 2.75 x 105 cfu af P. cepacia, og efter 7 døgns fugtig inkubation ved 15°C kunne der isoleres 1.2-1.7 x 106 cfu per sår, og der blev detekteret pyrrolnitrin i sårene (3 x 2 mm) svarende til minimum 0.87 ng per sår. Det er endvidere værd at bemærke, at der kun blev detekteret pyrrolnitrin i de sår, der var inokuleret med både patogenet Fusarium og antagonisten P. cepacia , mens metabolitten ikke kunne detekteres fra sår, der alene var inokuleret med P. cepacia.. Efter behandling af kartoffelknolde med Trichoderma virens var Aluko & Hering (1970) i stand til at detektere antibiotika produktion på sklerotier af patogenet Rhizotonia solani isoleret fra knoldene. På selve knoldene kunne metabolitterne derimod ikke isoleres. De isolerede toxiner var formodentlig gliotoxin og viridin. 5.4 OpsummeringMange biologiske bekæmpelsesorganismer (MBO) kan producere sekundære metabolitter in vitro. Antibiosis regnes da også for at være en mekanisme, der ofte er involveret i biologisk bekæmpelse af plantepatogener. Det er dog vigtigt at pointere, at in vitro metabolitproduktion i mange tilfælde ikke er korreleret med den biologisk bekæmpelseeffekt in vivo. Som det fremgår af ovenstående gennemgang er informationer omkring MBO'ers produktion af sekundære metabolitter in vivo desuden meget begrænset. Den foreliggende viden indikerer, at for MBO'ers produktion af sekundære metabolitter i jorden, i rhizosfæren eller på frø sået i jord er tilgængelighed af næringsstoffer i form af exudater fra frø og rhizosfære eller organiske planterester af afgørende betydning. Det må formodes at MBO'ers potentielle produktion af sekundære metabolitter i og på planter generelt er under kompleks påvirkning af mange økologiske parametre så som substrat, temperatur, pH, mikrobielle interaktioner m. fl. som det også beskrevet for produktion af toksiske metabolitter i kapitel 4. På baggrund af det begrænsede kendskab til MBO'ers in situ
metabolitproduktion kan der ikke drages generelle konklusioner. Den potentielle risiko må
vurderes på baggrund af den specifikke organismes økologi og kendskab til den
potentielle metabolitproduktion, herunder akut toksisitet og den producerede metabolits
mængde og persistens. 6. Trichoderma harzianum's økologiTaxonomi Den imperfekte svamp Trichoderma hazianum Rifai tilhører klassen Hyphomycetes under Deuteromycotina. Svampens perfekte stadium der henregnes til slægten Hypocrea Fr.forekommer dog kun sjældent i kultur (Rifai, 1969; Bissett, 1991). Trichoderma spp. består af mange arter så som T.virens, T.polysporum, T. viride, T.hamatum. Ud over morfolgiske forskelle mellem arter, er disse også meget forskellige f.eks. hvad angår vækstkrav og metabolitproduktion (Domsch et al., 1980; Lübeck, 1994; Widden & Scattolin, 1988). 6.1 Generelle vækstkrav og metabolitproduktionT. harzianum er på de fleste vækstmedier en hurtigtvoksende svamp, der sporulerer med små (2,8-3,2 x 2,5-2,8 µm) konidier (sporer), der er slimede og produceres enkeltvis og successivt (Rifai, 1969). Hyaline klamydosporer (diameter 6 til 12 µm) kan dannes interkalært eller terminalt på hyfesidegrene, men ses mest i ældre kulturer. Trichoderma harzianum er isoleret fra mange forskellige habitater og jordtyper og formodes at være udbredt over hele verden. T. harzianum kan leve saprofytisk på planterester i jorden som f.eks strå, kan være sekundær kolonisator på nedfaldsløv og er i stand til at bla. at nedbryde stivelse og cellulose (Domsch et al., 1980; Jeffries & Young, 1994). 6.1.1 SpiringSpiring af konidier er under påvirkning af fugtighed, temperatur, pH, CO2 og næring. Med hensyn til fugtighed kan konidier spire indenfor området -10 MPa til -7 Mpa og mættet vanddamp (100% RH), svarende til at spiring kan forekomme ved vandaktiviteter ( aw) fra ca. 0.93-0.95 og 1 (Domsch et al., 1980). Spiring synes at kræve en ekstern næringskilde, dog er den næring, der er knyttet til eksempelvis uvaskede konidier høstet fra næringsrigt substrat tilstrækkelig til at sikre en god fremspiring. Hvis næringsbetingelserne er ugunstige kræves også C02 for at få spiring. Spiringsprocenten er endvidere markant højere ved sure pH-værdier end ved neutrale pH forhold, og desuden er ældre konidier mere følsomme overfor ugunstige spiringsbetingelser end unge konidier (Danielson & Davey, 1973a). Såvel spiring som spiringshastighed er meget stærkt afhængig af temperaturen. Lifshitz et al. (1986) undersøgte spiring af konidier på vandagar ved 19°C og 26°C. Ved 19°C var ingen konidier spiret efter 10 timer og efter 26 timer var kun 26% spiret. Ved 26°C var 14% derimod spiret efter 10 timer og alle spiredygtige konidier (98%) var spiret efter 18 timer. Ved undersøgelse af spiring på PDA fandt O'Neill et al. (1996), at mere end 90% af konidierne var spiret efter 15 timer ved 15°, 20°, 26° og 30°C, mens ingen konidier var spiret efter 2 døgns inkubation ved 5° og 37°C. 6.1.2 VækstKnudsen & Bin (1990) fandt at densiteten af hyfer, der vokser ud fra alginat piller var størst i den tørreste jord med matrix-potentiale på -0.5 MPa mod den mere fugtige jord med -0.03 MPa. Overlevelsen af T. harzianum i lerjorde med matrixpotentialer spændende fra -13,5 MPa (meget tør) til -0.135 MPa blev undersøgt og var størst i den fugtige jord (Liu & Baker, 1980). I de fleste jorde er et matrixpotentiale omkring markkapicitet (ca -0.03 MPa til -0.01 MPa) optimal for plantevækst (Brady, 1984). Sådanne forhold synes også generelt at være gunstige for vækst af Trichoderma, idet Eastburn & Butler (1991) fandt, at matrix potentialer fra -0.05 MPa til -0.1 MPa gav den højeste saprofytiske aktivitet af T. harzianum, derefter aftog aktiviteten lineært med faldende matrixpotentiale fra -0.75 MPa til -1.5 MPa og i vandmættet jord (0.0 MPa) var der ligeledes ringe aktivitet af Trichoderma. Pitt & Hocking (1997), anfører at minimum aw værdier for vækst af T. harzianum er 0.91 ved 25°C, hvilket svarer til et vandpotentiale på ca. -13 MPa. Temperatur Vækst af T. harzianum er stærkt temperaturafhængig, som det fremgår af de nedenfor refererede undersøgelser. Ud af 4 isolater var kun et isolat i stand til at vokse ved 7°C, men isolatet kunne ikke sporulere ved denne temperatur på trods af en inkubationsperiode på mere end 10 døgn (Danielson & Davey, 1973b). Tronsmo & Dennis (1977) undersøgte væksten af 6 isolater af T. harzianum på 2% malt ekstrakt agar ved 2°,5°,10° og 20° C og fandt at ingen af isolaterne kunne vokse ved 2°C, men ved 5°C var 5 af isolaterne i stand til at vokse, og ved henholdsvis 10° og 20° C kunne alle isolater vokse. Selvom der er isolat variation, anses temperaturkravene for vækst af T. harzianum generelt at ligge indenfor en minimumstemperatur på 5°C og en maksimumtemperatur på ca. 36°C (Pitt & Hocking, 1997). Det er dog lykkedes Tronsmo (1989a og 1989b) at selektere et isolat (P1) der er i stand til at vokse ved en lavere temperatur, 3°-34°C. P1 er en mutant af T. harzianum 107, der oprindeligt er isoleret fra træspåner. Fastlæggelse af T. harzianums optimale væksttemperatur er på baggrund af in vitro forsøg angivet til 27-30°C. I jord er den optimale temperatur for kompetitiv kolonisering dog tilsyneladende betydeligt lavere, nemlig mellem 15-21°C (Eastburn & Butler, 1991). CO2-koncentration T. harzianum synes ikke at være negativt påvirket af forhøjet indhold af CO2. Ved neutralt til basisk pH (pH=7.5) vokser de fleste isolater af T. harzianum mere end dobbelt så hurtigt ved koncentrationer på 2% og 10% end i den naturlige atmosfære (ca. 0.03% CO2) (Danielson & Davey, 1973b). 6.1.3 MetabolitproduktionT. harzianum producerer en lang række volatile og non-volatile metabolitter (Dennis & Webster, 1971a og 1971b). Lübeck (1994) fandt på baggrund litteraturundersøgelser, at T. harzianum producerer ihvertfald 18 forskellige metabolitter. Der isoleres og karakteriseres dog til stadighed nye metaboliter så som trichocin HA og MA, harzianum A og harzianic acid, der således yderligere kan føjes til listen (Corley et al., 1994; Dickinson et al., 1995; Goulard et al., 1995; Hlimi et al., 1995; Sawa et al., 1994). De fleste karakteriserede metabolitter udviser antibakteriel og/eller antifungal virkning, men ingen af de karakteriserede metabolitter har udvist cytotoksisk effekter (Lübeck, 1994; Sawa et al.,1994). Det gælder også harzianum A, der ellers hører til gruppen af trichothecener, der ofte er mycotoksiner og potente cytotoksiner overfor eucaryotiske celler (Corley et al., 1994). Kun for ganske få af metabolitterne er den akutte toksisitet (LD50-værdi) kendt. Fire karakteriserede metabolitter har LD50 >150 mg/kg ved intraperitonal indgivelse (i.p.) og en enkelt nemlig isonitrinic acid F LD50 på 20 mg/kg (Lübeck, 1994; Sawa et al., 1994). Variation mellem isolater En del undersøgelser viser, at in vitro produktionen af sekundære metabolitter kan variere mellem isolater indenfor arten T.harzianum. Eksempelvis viste en undersøgelse af 9 isolaters produktion af volatile metabolitter, at kun 2 af isolaterne producerede antibiotika med antifungale effekter. En sammenligning af metabolitproduktionen af tre T. harzianum isolater viste produktion af henholdsvis 2, 2 og 3 metabolitter for hvert af isolaterne. En karakterisering af de isolerede metabolitter viste dog, at isolaterne producerede forskellige metabolitter (Almassi et al., 1991; Dennis & Webster, 1971; Ghisalberti, & Sivasithamparam, 1991). Økologiske parametre Temperaturer i intervallet 5° til 20°C influerede ikke på T. harzianum isolaternes evne til at producere volatile og non-volatile metabolitter in vitro (Tronsmo & Dennis, 1977 and 1978). Cooney et al. (1997) fandt, at den kvantitative produktion af 6-n-pentylpyrone på et fast medium af majskorn ikke blev påvirket af en temperaturstigning fra 15° til 20°C, derimod var der et mindre fald i produktionen ved 25°C på trods af at svampevækst blev initieret tidligere og var kraftigere ved denne temperatur. Serrano-Carreon et al. (1992) fandt, at produktionen af 6-pentyl-a-pyrone var størst i et flydende medium, der med hensyn til næringssammensætning var suboptimalt for vækst af T. harzianum. Selvom der er meget begrænset viden omkring økologiske parametres betydning for T. harzianums metabolitproduktion, må det dog formodes at produktionen generelt er under påvirkning af faktorer som substrat, temperatur, vandaktivitet, mikrobiel interaktion etc., som beskrevet i Kap 4 og 5 for henholdsvis mykotoksinproducerende svampe og for in situ metabolitproduktion af mikrobiologiske bekæmpelsesorganismer. Biologisk bekæmpelse En række undersøgelser viser, at applikation af specifikke metabolitter produceret af T. harzianum kan hæmme vækst af patogene svampe in vitro (Claydon et al., 1987; Cutler & Hill, 1994). Ved applikation af metabolitter til inficerede planter, er der opnået bekæmpelse overfor adskillige patogene svampe (Cutler & Hill, 1994). Antibiosis anses da også i flere tilfælde at være stærkt involveret i biologisk bekæmpelse med T. harzianum in vivo. In vivo detektion I forbindelse med applikation af T. harzianum til biologiske bekæmpelse af plantepatogener in vivo, er der ikke i litteraturen fundet eksempler på in situ detektion af metabolitter, der potentielt produceres af arten. Der er således ikke detekteret T. harzianum producerede sekundære metabolitter hverken i eller på planteprodukter eller i jord/rhizosfære. 6.2. Naturlig forekomst i jordbunden6.2.1 Forekomst i jordCfu/g jord T. harzianum kan være tilstede i jord som både mycelium, konidier og klamydosporer (Papaviza, 1985). Som det fremgår af Tabel 6.1 varierer det naturlige niveau af T. harzianum i jorde typisk mellem 102 cfu/g jord og til 104 cfu/g jord, hvor det laveste niveau må anses for at være mest almindeligt. Der er dog også rapporteret om koncentrationer så høje som 8 x 105 cfu/g i organiske jorde i Chile (Chet & Baker, 1981). Jordens indhold af T. harzianum er stærkt påvirkeligt af biotiske som abiotiske faktorer. Et højt indhold af såvel organisk materiale som et højt lerindhold muliggør generelt et højt populations niveau, svarende til at jorden har en højere "carrying capacity" (Alabouvette & Steinberg, 1995). Svampens aktivitet anses også generelt for at være højest ved sure pH-værdi (Chet, 1987; Harman & Taylor, 1988), men også ved relativet høje pH-værdier (8.0) kan svampen etablere et højt populationsniveau (Lo et al., 1996). Generelt giver forholdsvis høj fugtighed i jorden mellem 0.05 -0.1 MPa også optimale forhold for vækst af T. harzianum (Eastburn & Butler, 1991). Tabel 6.1. Naturlig forekomst af Trichoderma harzianum i forskellige jordtyper. Forfrugt eller afgrøde er angivet. Table 6.1. Natural occurrence of Trichoderma harzianum in soils. 6.2.2 Forekomst og etablering i rhizosfærenRhizosfære-kompetance blandt isolater af T. harzianum synes generelt at være en sjælden egenskab (Harman, 1992). Flere undersøgelser peger på, at vildtype isolater af T. harzianum generelt ikke er rhizosfære kompetente (sensu Ahmad & Baker), idet de ikke er i stand til intensivt at kolonisere de dannede rødder efter en tilførsel med frøet (Chao et al., 1986; Papavizas, 1982; Green & Jensen, 1995; Thrane et al., 1997). T. harzianum kan dog generelt udnytte eksudater fra spirende frø og derved kolonisere frøene, og oftest vil man også kunne genfinde mindre populationer af svampen 1-2 cm under frøet, formodentlig som følge af transport af konidier med vandstrømme (Chao et al.,1986; Green, 1996).Undersøgelser af rodkolonisering foretaget med et GUS-mærket isolat af det ikke rhizosfære-kompetente isolat af T3 viser, at kolonisering af rødderne er meget sporadisk og hovedsagelig knyttet til beskadigede og sårede områder af roden. Rodeksudater synes ikke generelt at kunne understøtte spiring af konidier eller vækst af mycelium og kolonisering af sunde rødder må betragtes som værende ringe (Green & Jensen, 1995; Green, 1995; Thrane et al., 1997) Rhizosfære kompetente isolater Rhizosfære kompetente isolater af T. harzianum er hovedsagelig fremkommet ved genetisk manipulation i form af UV-bestråling, fungicidmutagenbehandling eller protoplastfusion, og der er således tale om mutanter af T. harzianum vildtypeisolater (Ahmad & Baker, 1987; Ahmad & Baker, 1988; Harman, 1991; Sivan & Harman, 1991). Efter screening af en lang række T. harzianum isolater er det dog lykkedes Sivan & Chet (1989) at isolere og vise rhizosfære kompetance i et vildtypeisolat (T-35). Tabel 6.2. Populationstætheden af Trichoderma harzianum i rhizosfæren (cfu/g rhizosfærejord) angivet for forskellige isolater, plantearter og vækstbetingelser. Antagonisten er applikeret ved frøbejdsning. Table 6.2. Population density of T. harzianum in the rhizosphere (cfu/g rhizosphere soil) for different isolates, plant species and growth conditions. The antagonist were applied by seed coating. 1) Isolat 1295-22 er fremkommet efter protoplastfusion af
T95 og T12. Rhizosfære kompetance bestemmes oftest ud fra målinger af cfu/g jord eller per cm rod. I tabel 6.2 er populationstætheden af T. harzianum på rodnettet angivet for forskellige isolater, plantearter og vækstbetingelser. For isolater af T. harzianum følger populationsdensiteten som oftest en C-formet kurve svarende til den største populationstæthed lige under frøet og mod rodspidsen (Ahmad & Baker, 1987). Isolatet 1295-22, der er fremkommet ved protoplastfusion af to T. harzianum isolater, er dog i stand til at kolonisere rodnettet af visse plantearter mere ensartet (Sivan & Harman, 1991). De rhizosfære kompetente isolater varierer med hensyn til populationstæthed på rødderne, og desuden kan isolaternes evne til at koloniserer rødder af forskellige plantearter variere (se tabel 6.2). Populationstætheden for isolatet 1295-22 var eksempelvis højere på rødder af majs end på rødder af bomuld (Sivan & Harman, 1991). Sure jordbundsforhold samt stigende temperatur synes generelt at fremme koloniseringen i rhizosfæren (Ahmad & Baker, 1987). Undersøgelser foretaget af Sivan & Chet (1989) tyder på, at rhizosfære kompetente isolater ikke er i stand til at kolonisere jorden udenfor rhizosfæren, idet populationen i non-rhizosfærejord var 100 gange lavere end i rhizosfære jorden og svarende til niveauet for naturlig forekomst. 6.3 Overlevelse og etablering i jordbundenOverlevelse og etablering af T.harzianum i jord og voksemedier er undersøgt for forskellige formuleringer og vækstbetingelser (Tabel 6.3). Ved tilførsel af et non-rhizosfærekompetent isolat af T. harzianum i form af konidier formuleret i klid fandt Lewis & Papavizas (1984), at T. harzianum populationen hurtigt faldt tilbage til det oprindelige niveau. Generelt vil det være svært at øge populationen på friland ud over det naturlige niveau, der findes i jorden (jordens carrying capacity), med mindre antagonisten kan udnytte rodeksudater fra en afgrøde (Lo et al., 1996) eller antagonisten tilføres i en formulering der bl.a.. sikre tilgængelig næring. I voksemedier med en lavere mikrobiel aktivitet er overlevelsen generelt stabil, og såfremt der samtidig er tilført en brugbar næringskilde kan populationen forøges, ihvertfald indenfor en kortere periode (Heiberg et al., 1996; Lumsden et al., 1989). Opsummering Ved iblanding af inokulum til markjord og andre vokstmedier er mulighederne for etablering og overlevelse formodentlig afhængig af (1) den mængde næring der tilføres med organismen, (2) om organismen er rhizosfærekompetent og (3) om tilførslen sker til jord eller til kunstige voksemedier, der har en lav mikrobiel buffer kapacitet (Alabouvette & Steinberg, 1995; Deacon, 1991). Tabel 6.3. Overlevelse af T. harzianum i jord efter iblanding af antagonisten til jord og voksemedier. Table 6.3. Survival of T. harzianum in soil after mixing inoculum of the antagonist into soil 1) I forsøg med plantevækst indgår der både
non-rhizosfære jord og rhrizofærejord i cfu besteemmelsen 6.4 Fyllosfære og efterhøstprodukter6.4.1 Naturlig forekomst i fyllosfæren og på høstprodukterSom det fremgår af henholdsvis tabel 2.4 og 2.5 anses T. harzianum ikke for at være naturligt forekommende på blade eller høstprodukter. En litteraturgennemgang viser dog, at arten i flere tilfælde kan isoleres fra overfladen af blade, rødder, frugter og frø (tabel 6.4.), selvom T. harzianum's naturlige miljø overvejende er jord og planterester. Fyllosfæren T. harzianum er isoleret i en ikke nærmere angivet frekvens fra fyllosfæren af kiwifrugt, drue, appelsin, eucalyptus og abrikos i Chile (Latorre et al., 1997). Fra Indien er det rapporteret, at T. harzianum er isoleret fra overfladen af raske blade af guava (Psidium guajava L.) sammen med bla. Penicillium og Aspergillus spp (Pandey et al., 1993) og fra overfladen af risblade (Gokulapalan & Nair; 1992). Trichoderma spp. herunder formodentlig også T. harzianum er endvidere isoleret i en lav frekvens fra dildblade dyrket i et dansk gartneri (Kaare Møller, pers. kom.). Efterhøst produkter Ekundayo (1987) rapporterer, at T. harzianum isoleres i 20-100% af tilfældene fra frisk okra, peberfrugt og "melon seeds", der var indsamlet fra lokale markeder i Nigeria. Efter soltørring af produkterne i 20 døgn kunne der dog ikke længere isoleres T. harzianum fra frugterne. Forekomst af T. harzianum på frø angives generelt at være lav og er formodentlig et resultat af kontaminering af frøene fra den naturligt forekommende population i jorden under høstprocessen (Pitt & Hocking, 1997; Sivapalan, 1993; Weiderbörner & Hindorf, 1989). I en enkelt undersøgelse er det påvist, at T. harzianum kan isoleres fra rådne lagrede æbler. Rådområder med vækst af Trichoderma var dog udelukkende centreret omkring væv der var såret (formodentlig af insekter) inden høst (Penrose et al.,1984). T. harzianum er også isoleret fra rådne cassava (Domsch et al., 1980). Tronsmo (1989 b) angiver at T. harzianum i ganske få tilfælde kunne isoleres fra uvaskede gulerødder lagret ved 4°C. I ovenfor citerede kilder er der overvejende tale om sjældne fund af organismen, og i de fleste tilfælde er der formodentlig tale om kontaminering med inaktive sporer. De fleste fund er endvidere rapporteret fra ikke tempererede klimaer. Tabel 6.4. Naturlig forekomst af Trichoderma harzianum i fyllosfæren og på efterhøst produkter. Table 6.4. Natural occurrence of Trichoderma harzianum in the phylloplane and on postharvest products. 6.4.2 Overlevelse og etablering på levende plantevævPå levende intakt plantevæv eksempelvis i fyllosfæren, er der en stærkt begrænset mængde næring tilstede. Desuden er der især under markforhold, men også ofte under mere kontrollerede forhold drastiske og gentagne mikroklimatiske fluktuationer i eksempelvis temperatur og luftfugtighed, hvilket stiller særlige krav til introducerede mikroorganismer, da disse ydermere skal konkurrere med den etablerede mikrobiota (Se endvidere afsnit 2.2 og 3.2). Under markforhold vil en stærkt begrænsede faktor for vækst af svampe være hurtigt opståede ændringer i substratets vandindhold. Trichoderma er således ikke i stand til at vokse på planterester, når vandpotentiale reduceres til -7 MPa, det er til gengæld svampe som Fusarium spp. og Penicillium spp. (Magan & Lynch, 1986). Antagonistens evne til at overleve skiftende perioder med henholdsvis tørre og fugtige forhold er også vigtig for organismens etableringsevnen. Efter en 6 timers periode på tørre nekrotiske løgblade var T. harzianum ikke i stand til at bekæmpe løgskimmel selvom plantematerialet i den efterfølgende periode blev holdt fugtigt. Det var derimod arter indenfor de i fyllosfæren natuligt forekommende slægter Alternaria og Cladosporium og gærsvampen Aureobasidium pullulans, også efter 3 successive perioder med skiftevis tørre og fugtige forhold. Såfremt T. harzianum er tilstede på overfladen af overjordiske plantedele, anses den for at være meget følsom overfor tørre perioder (Köhl & Fokkema, 1994). Spiring T. harzianum applikeres som oftest i en formulering, der hovedsagelig består af konidier. På grønne såvel unge som ældre blade af tomat var konidier af T.harzianum tilført i vandig suspension generelt ude af stand til at spire. Efter 7-14 dage var 4-9% af konidierne dog "opsvulmede", men ingen havde produceret spirehyfe (Elad & Kirshner, 1993). Konidier af T. harzianum observeret på blade af dild var tilsyneladende heller ikke i stand til at spire på trods af en høj luftfugtighed (Kaare Møller, pers. kom.). Det må formodes at T. harzianum isolater i almindelighed sjældent vil spire på intakt levende plantemateriale, med mindre der tilføres exogen næring. Denne sammenhæng er også almindeligt kendt både for naturligt forekommende saprofyter og for nekrotrofe patogener (Köhl & Fokkema, 1994). Se endvidere afsnit 2.2 Overlevelse og etablering Efter applikation af T. harzianum til levende og intakt plantevæv i form af blade, stængler, frugter etc. aftager populationsdensiteten generelt hurtigt (tabel 6.5). I løbet af en 2-3 ugers periode vil kun en lille procentdel af de tilførte spiringsenheder være levende, typisk < 1% (Elad & Kirshner, 1993; Migheli et al., 1994). Tabel 6.5. Overlevelse af Trichoderma harzianum i fyllosfæren og på frugt og grønsager Table 6.5. Survival of Trichoderma harzianum in the phyllosphere and on fruits and vegetables.
I en række undersøgelser under naturlige betingelser er antallet af cfu efter to eller flere applikeringer sammenholdt med populationen af Trichoderma i ubehandlede parceller. Jordbærplanter blev i løbet af sommeren sprøjtet tre gange med T. harzianum suspensioner. Ca. 10 måneder efter den sidste behandling kunne der isoleres Trichoderma spp. fra behandlede plots. (Tronsmo, 1986). Forsøget viser, at Trichoderma spp i et vist omfang kan overvintre på jordbærplanter. I undersøgelser vedrørende biologisk bekæmpelse af Botrytis cinerea på druer, blev der 11 dage efter den sidste af 3 sprøjtninger isoleret 3.4 x 105 cfu /bær i de T. harzianum behandlede plots mod kun 2 x 103 cfu/bær fra usprøjtede plots (Elad,1994). Tronsmo & Dennis (1977) udsprøjtede T. harzianum til jordbærplanter, med sidste udsprøjtning 14 dage før høst. Trichoderma spp. blev isoleret fra behandlede plots i størrelsesordenen 102 -103 cfu/g friske bær, mens der blev ikke blev isoleret Trichoderma fra ubehandlede plots. Efter 2 sprøjtninger af agurkeplanter blev der isoleret ca. 5 x 105 per blad og 5 x 104 cfu/frugt mod ca. 1 x 104 cfu/blad og 1.5 x 103 cfu/frugt fra ubehandlede plots ved målinger udført 22 dage efter sidste sprøjtning (Elad et al., 1993). Undersøgelserne viser, at der specielt over kortere perioder kan etableres en signifikant højere population såvel i fyllosfæren som på frugter i plots der er sprøjtet med sporesuspensioner af T. harzianum. I forbindelse med disse undersøgelser var det ikke muligt at skelne mellem introducerede populationer T. harzianum og evt. naturligt forekommende populationer af T. harzianum. I relation til T. harzianum's ringe mulighed for at spire på intakt plantevæv, vil populationer formodentlig primært bestå af sporer. Økologiske parametre Overlevelsen af T. harzianum populationen på levende plantevæv afhænger især af luftfugtighed og temperatur, men faktorer som planteart, bladalder, planternes ernæring etc. har også betydning, ligesom både 2- og 3-faktor vekselvirkninger mellem flere af parametrene kan influere på overlevelsen (Elad & Kirshner, 1993). Luftfugtigheden er en af de mikroklimatiske parametre, der i høj grad påvirker overlevelsen T.harzianum. Således giver en høj relativ luftfugtighed (RH) på >95% en bedre overlevelse af T. harzianum på blade af tomat, peber og geranium end en RH<85% (Elad & Kirshner, 1993). Undersøgelser tyder endvidere på, at T. harzianum isolater kan variere med hensyn til overlevelsesevne i fyllosfæren (Gaulino et al., 1987; Latorre et al., 1997; Mighelli et al., 1994). Formulering Produktion og formulering af T. harzianum påvirker formodentlig konidiernes evne til overlevelse i fyllosfæren under markforhold (Harman et al., 1996; McKenzie et al., 1991; Elad, 1994). Eksempelvis kan tilsætning af næringsstoffer til formuleringen i form af malt og Pelgel (carboxymethylcellulose og gum arabic) i visse tilfælde fremme overlevelse og aktivitet af T. harzianum i fyllosfæren (Gullino et al., 1987; Harman et al., 1996; McKinzie et al., 1991). Biologisk bekæmpelse Gaulino et al. (1987) undersøgte 23 T. harzianum isolaters bekæmpelseseffektivitet overfor B. cinerea på druer ved 15°C og 28°C. Der var generelt bedre bekæmpelse ved den høje temperatur, hvilket dog var betinget af en høj luftfugtighed, et forhold der generelt ikke er gældende i områder, hvor der dyrkes vin under markforhold. Elad et al., (1993) fandt at temperaturer >20°C i kombination med RH mellem 80 og 97% gav de bedste betingelser for biologisk bekæmpelse af B. cinerea på agurk i kommercielle væksthuse. Isolat 1295-22 I forhold til T.harzianum isolaters generelt set ringe evne til overlevelse og etablering i fyllosfæren, synes isolat 1295-22, der er en protoplast-fusion mellem to T. harzianum isolater, at indtage en særstilling. Lo et al (1997 a) fandt at populationsniveauet efter udsprøjtning af 1295-22 til fyllosfæren af græs (Agrostis palustris Huds.) blev opretholdt i minimum en uge (se tabel 6.5) og ved mikroskopering viste det sig, at 1295-22 er i stand til at spire og danne mycelie på græsblade (Lo et al., 1997 b). Om 1295-22 isolatets tilsyneladende fyllosfærekompetance er gældende for andre plantearter er uvist, men ved applikation af 1295-22 til vinplanter under markforhold, var der ofte ringe overlevelse af isolatet (Harman et al., 1996). McKenzie et al. (1991) undersøgte overlevelsen af forskellige T. harzianum isolater (vildtyper, fungicidresistente mutanter og isolater fremstillet ved protoplastfusioner) på blade af tomat og vin. For alle isolater var der en stærkt faldende overlevelse over en 3 ugers periode, og vildtype isolater overlevede generelt bedre end mutanter og protoplastfusionerede isolater. 6.4.3 Overlevelse og etablering på nekrotisk eller såret plantevævNekrotisk plantevæv og sårflader udgør ved sammenligning med levende intakt plantevæv habitater, hvor der generelt er mere næring til rådighed for aktivitet og vækst af svampe. På nyligt opståede sårflader vil det desuden være muligt for den applikerede antagonist at etablere sig under forhold, hvor der er mindst mulig konkurrence, dels fra andre saprofyter og dels fra patogener (Köhl & Fokkema, 1994, afsnit 3.2). Kolonisering af sårflader T. harzianum er i stand til at kolonisere og sporulere på sårflader af tomatstængler efter inkubation ved 11°C over en periode på 11 døgn. Flere isolater blev testet og enkelte af disse var mere effektive end andre ved den forholdsvis lave inkubationstemperatur (Eden et al., 1996). Overlevelse O'Neill et al. (1996) fandt, at overlevelsen af T. harzianum i sårflader på tomatstængler blev reduceret over en 14 dages periode i de sår, der ikke var inficeret med Botrytis cinerea. Der blev endvidere fundet en bedre overlevelse ved 10°C og RH ca. 85-90% end ved 10°C og en RH på 60%. Biologisk bekæmpelse Kun ved samtidig eller tidligere inokulation med T. harzianum var det muligt at få en god bekæmpelse af B. cinerea i sårflader. Hvis sårflader først inokuleredes med B.cinerea efterfulgt af inokulering med T. harzianum 1 døgn senere, var der ingen reduktion i infektionsgraden (O'Neill et al., 1996). Eden et al. (1996) inokulerede sår med B. cinerea, så hele sårfladen var dækket og inokulerede derefter sårene med antagonistiske isolater, så kun halvdelen af sårfladen var dækket. Ved halv inokulering med T. harzianum kunne sygdomsreduktion ikke opretholdes. Det var derimod muligt ved halv inokulering med antagonistiske isolater af Cladosporium. Disse resultater tyder på at, T. harzianum ikke kan klare sig i konkurrencen med B. cinerea såfremt patogenet er etableret på sårfladen. 6.5 Spredning i relation til applikationmetodeFlere faktorer influerer på, om T. harzianum spredes fra plantedele, hvortil antagonisten direkte er applikeret og til andre plantedele, og i givet fald i hvor stort omfang T. harzianum spredes. Spredning vil bla. være afhængig af applikationsmetode, herunder dosis og behandlings-frekvens, antagonistens formulering, saprofytisk konkurrrenceevne, rhizosfærekompetance, generelle muligheder for overlevelse i det pågældende habitat og af høst- og bearbejdningsprocesser. 6.5.1 Spredning fra jord til ovenjordiske plantedeleSelvom T. harzianum er en udpræget jordbåren saprofyt, sker der i det naturlige miljø en spredning af svampen fra jord til forskellige ovenjordiske plantedele, som det fremgår af afsnit 6.4.1. Spredningmekanismer som beskrevet i afsnit 2.4. er formodentlig involveret. Der er kun få undersøgelser, der kan give information om spredning af T. harzianum fra jord til overjordiske plantedele, efter at antagonisten er introduceret til jord eller voksemedier. Iblanding Et Gus-mærket T. harzianum isolat af 1295-22 blev iblandet markjord svarende til 106 konidier per g. jord. Syv til ti dage efter såning kunne det mærkede isolat i ingen eller meget få tilfælde detekteres på græsblade (Lo et al., 1997b). Det skal i den forbindelse nævnes, at isolatet 1295-22, i modsætning til andre kendte T. harzianum isolater, tilsyneladende er fyllosfærekompetent, ihvertfald på græsblade. Samme isolat blev iblandet jord med en naturlig forekomst af Trichoderma estimeret til 1.8 x 104 cfu/g. Efter iblanding blev populationen signifikant forøget til 1 x 105 cfu/g. En kvantificering af Trichoderma populationen i græsfyllosfæren 17 dage efter såning viste, at T. harzianum iblanding ikke havde medført en signifikant stigning i fyllosfærepopulationen ved sammenligning med ubehandlede kontroller (Lo et al., 1997 a). Udsprøjtning På KVL er der foretaget en endnu ikke publiceret undersøgelse af muligheden for spredning af T. harzianum fra sphagnum til småplanter af dild. Dildfrø blev sået i sphagnum, hvorefter jordoverfladen blev vandet med en sporesuspension af det biologiske middel Supresivit (T. harzianum). Efter 14 døgns inkubation i klimakammer ved 20°C og meget høj luftfugtighed (.100% RH) blev T. harzianum i form af levedygtige sporer detekteret på småplanter i tilknytning til plantens vækstpunktet og desuden på bladspidser og ved bladnodier (Møller pers. kom.). T. harzianum menes at være spredt til fyllosfæren primært via vækstpunktets kontakt med jorden, hvorfra antagonisten sekundært er spredt til bladnodier og bladspidser, formodentlig via kondensvand. Den meget høje luftfugtighed i klimakammeret har formodentlig været medvirkende til overlevelsen i fylloplanet. Som nævnt tidligere var konidierne uspirede. Opsummering På baggrund den nuværende viden kan det konkluderes, at T. harzianum tilført jord/voksemedier ved iblanding eller udsprøjtning kan spredes til fyllosfæren, men at frekvensen generelt må anses for at være lav. Bejdsning Der findes ingen undersøgelser vedrørende eventuel spredning til fyllosfæren, såfremt T. harzianum er applikeret til jord via frøbejdsning. Muligheden for at introducere en stor population af antagonisten er dog ikke nær så stor som ved iblanding og udsprøjtning. Det skyldes, at det med bejdsning kun er muligt at applikere antagonisten en gang ved vækstsæsonens begyndelse i modsætning til eksempelvis sprøjte- applikering, og at den tilførte mængde per m2 er begrænset af antal cfu per frø og af antal planter per m2 (se evt. tabel 3.2). Ved bejdsning af spinat med industrielt udstyr var en dosering på 103 konidier af T. harzianum per frø tilstrækkelig til at bekæmpe af Pythium ultimum og Rhizoctonia solani ved fremspiring (Cliquet & Scheffer, 1996). Med 50 planter per m2 (optimalt) svarer dette til, at der introduceres ca. 1 x 105 cfu af T. harzianum per m2. Ved sammenligning med den estimerede, naturlige population af T. harzianum per m2 i pløjelagets dybde, der oftest vil være af størrelsesordenen 107- 109 cfu/m2 (se tabel 6.1), udgør T. harzianum introduceret med frø <1% af den naturlige population. I relation til den samlede naturlige microbiota, der er estimeret til 1013 til 1014 cfu per m2, er der tale om introduktion af en meget lille population til et økologisk system med en høj bufferkapacitet. 6.5.2 Spredning til rodfrugter efter frøbejdsningFor grønsager som radise, gulerod, persillerod etc., hvor roden udgør den spiselige del af planten, vil viden om MBO'ers eventuelle kolonisering af de høstbare rødder være af interesse. Resultater fra mange undersøgelser tyder på, at de fleste T.harzianum isolater formodentlig ikke er rhizosfærekompetente og derfor ikke i væsentlig grad kan kolonisere rødder efter applikation med frøet (se afsnit 6.2.2.). Det er derimod mere sandsynligt, at bejdsning med og for så vidt også iblanding og udsprøjtning med rhizosfærekompetente isolater til jord kan resultere i en forøget population af T. harzianum på rodfrugter. Dette er dog ikke undersøgt med eksperimentelle data i litteraturen. Ahmed & Baker (1987) viste, at der på rødder af 8 dage gamle radiseplanter kunne isoleres en forholdsvis stor population af T. harzianum fra de unge radiserødder efter bejdsning med det rhizosfærekompetent isolat (T95). En eventuel høj koloniseringsgrad af den spisemodne rod blev dog ikke undersøgt. 6.5.3 Spredning efter applikation til ovenjordiske plantedeleT. harzianum har klæbrige sporer, der ikke så typisk frigøres og spredes med vinden, specielt ikke ved sammenligning med arter indenfor f.eks Penicillium og Cladosporium, der karakteriseres som "støvende" svampe. Udsprøjtning I en række væksthusforsøg, hvor T. harzianum blev udsprøjtet på
agurkeplanter flere gange i løbet af vækstsæsonen, blev der etableret en høj
population på blade og frugter (ca. 103 cfu pr cm2). Samtidig blev
det konstateret at T. harzianum sekundært var blevet spredt til ubehandlede
agurkeplanter i væksthuset (Elad et al., 1993; Elad et al., 1996). I
forsøg udført under markforhold med jordbær, vin, agurk og ruscus, blev der i
forbindelser med gentagne sprøjtebehandlinger med T. harzianum
konidiesuspensioner fundet forholdsvis høje populationer af T. harzianum i
fyllosfæren af planter i de nærliggende ubehandlede kontrolparceller (Elad, 1994; Elad
& Kirshner, 1992; Tronsmo, 1986). Dette tyder på, at der under markforhold kan ske en
spredning til nærliggende ubehandlede planter især efter flere T. harzianum
sprøjebehandlinger indenfor samme vækstsæson. Det skal dog nævnes, at det i
forbindelse med disse undersøgelser ikke var muligt at skelne mellem introducerede
populationer T. harzianum og evt. naturligt forekommende populationer af T.
harzianum. 7. Dokumentation baseret på litteratur og behov for yderligere dokumentation baseret på eksperimentelt arbejde.I forbindelse med en risikovurdering af en MBO vil mange informationer kunne hentes fra litteraturen. Det gælder f.eks viden om økologiske forhold i relevante habitater og specifikke arters naturlige forekomst og vækstkrav som det fremgår af ovenstående rapport. Sådanne informationer vil dog som oftest være af generel karakter, hvorfor der i konkrete sager kan opstå behov for at fremskaffe dokumentation af mere specifik karakter. Der findes brugbare metoder til at opnå detaljerede data vedrørende MBO's økologi og metabolitproduktion i de forskellige habitater. Det må dog i hvert enkelt tilfælde vurderes nøje, om et eventuelt krav om yderligere dokumentation baseret på eksperimentelle undersøgelser er nødvendigt, da de fleste af de tilgængelige metoder til sådanne undersøgelser kun kan gennemføres med betydelige omkostninger til følge. I det følgende er anført nogle af de forhold, der i hvert enkelt tilfælde kan være relevante at få yderligere belyst. Der er desuden eksempler på metoder, der kunne tænkes anvendt 7.1 Data vedrørende potentiel risiko for dannelse af toksiske metabolitter på planteprodukter til konsumTilstedeværelse af arten: Kan mikroorganismer af samme art som den applikerede MBO isoleres fra høstproduktet. Dette kan gøres ved hjælp af pladespredningsteknikker på selektivt medie o.lign.. Tilstedeværelse af isolatet: Hvis arten er tilstede på produktet, kan det undersøges, om det specifikke applikerede isolat (MBO) er blandt de isolerede mikroorganismer. Eksempler på metoder der kan anvendes: Aktivitet af isolatet: Hvis MBO detekteret på produktet er det muligt at undersøge aktiviteten af isolatet og dermed mulighed for dannelse af metabolitter. For de produkter, der lagres gennem kortere eller længere tid, bør aktiviteten undersøges ved de lagerbetingelser og lagringstider, der er relevante for det pågældende produkt. Eksempler på metoder der kan anvendes: Mikroskopi til undersøgelse af mængde og fordeling af sporer, sporespiring og mycelievækst. Undersøgelser in situ ved hjælp af isolater genetisk mærket på en sådan måde, at aktiviteten kan moniteres (GUS, m.fl). 7.1.1 Yderligere undersøgelser såfremt der er mange inaktive sporer af den specifikke MBO på produktetSåfremt der ikke er aktivitet, men der detekteres en stor mængde inaktive sporer på produktet, må to mulige forhold vurderes eller undersøges yderligere:
7.1.2 Yderligere undersøgelser som kan være aktuelle såfremt MBO udviser aktivitet på produktet
7.2 Dokumentation i relation til applikationsmetodeFor MBO der tilføres til jord og voksemedier enten ved bejdsning, iblanding eller udsprøjtning vil den potentielle risiko for at høstproduktet er kontamineret med organismen og dermed også om der potentielt kan være en forekomst af sekundære metabolitter være afhængig af (1) om høstproduktet er rødder eller knolde hvor hensigten med applikeringen af midlet har været direkte kontakt med produktet eller (2) om produktet er blade/stængel frugter eller frø hvor det kræves at organismen spredes fra jorden til disse planteorganer. Ved applikation til fyllosfæren (blade, stængler, blomster og/eller frugter) vil der ofte være mulighed for at produktet er kontamineret (3). Vedrørende (1): Forslag til undersøgelser beskrevet i 7.1 er sandsynligvis specielt relevante når der er tale om produkter, der ved applikation er i direkte kontakt med MBO. Desuden bør planteprodukter undersøges med hensyn til restkoncentrationer, hvis det er erkendt at organismen eller organismer af samme art producerer toksiske metabolitter i jord/rhizosfære. Vedrørende (2): Den mængde enheder af en MBO, der tilføres jorden må bedømmes i forhold til den naturligt forekommende population af arten i jorden. Såfremt det skønnes at der er tale om en meget lille tilførsel i relation til den naturlige population vil der formodentlig ikke være nogen forøget risiko for massiv spredning af arten til fyllosfæren, specielt ikke hvis den pågældende art jævnligt er isoleret fra den naturlige fyllosfære mikrobiota. Som det fremgår af kapitel 2, spredes jordbårne organismer fra jord til fyllosfære. Med hensyn til vurdering af MBO's spredning vil sandsynligheden for spredning til overjordiske plantedele formodentlig være størst for de grønsager der er i direkte kontakt med jord. Da der i litteraturen ikke er fundet tilgængelige undersøgelse af, om MBO tilført til jord, rhizosfære og frø kan spredes til overjordiske plantedele, bør sådanne undersøgelser foretages for relevante kulturer som salat og krydderurter. Disse undersøgelse bør foretages for definitivt at kunne drage konklusioner vedrørende potentielle risici, også selvom der ikke umiddelbart ud fra en økologisk vurdering synes at være nogen begrundet risiko. Selvom MBO ikke detekteres på overjordiske plantedele kan det være relevant som anført under (1) at udføre restkoncentration analyser, hvis det er erkendt, at organismen eller organismer af samme art producerer toksiske metabolitter i jord/rhizosfære, da der er mulighed for, at planter kan optage metabolitter gennem roden. Vedrørende (3): Det vil igen afhænge af den anvendte MBO og forhold som eksempelvis høsttidspunkt og frugtdannelse i forhold til applikationstidspunktet, hvilke behov der er for dokumentation. Flere af undersøgelserne nævnt under 7.1 må dog formodes at være relevante at gennemføre i de fleste tilfælde. Selvom produktet er kontamineret med MBO'er, er de i dag anvendte organismer ikke kendt
for at forårsage efterhøstproblemer i form af vækst og sporulering på planteprodukter.
Risikoen for metabolitproduktion efter høst skønnes derfor i almindelighed at være
minimal. 8 LitteraturlisteAbbas, H.K. & Riley, R.T., 1996. The presence and phytotoxicity of fumonisins and AAL-toxin in Alternaria altanata. Toxicon 34, 133-136. Ahmad, J.S. & Baker, R., 1987. Rhizosphere competence of Trichoderma harzianum. Phytopathology 77, 182-189. Ahmad, J.S. & Baker, R., 1988. Rhizosphere competence of benomyltolerant mutants of Trichoderma spp. Can. J. Microbiol.34, 694-696. Alabouvette, C. & Steinberg, C., 1995. Suppressiveness of soils to invading micro-organisms. In: Biological control Benefits and Risks. Eds. H.M.T. Hokkanen &J.M. Lynch. Cambrigde University Press. side 3-12. Almassi, F., Ghisalberti, E.L., Narbey, M.J. & Sivasithamparam, K., 1991. New antibiotics from strains of Trichoderma harzianum. Journal of Natural Products 54, 396-402. Aluko, M.O. & Hering, T.F., 1970. The mechanisms associated with the antagonistic relationship between Corticum solani and Gliocladium virens. Trans. Br. mycol. Soc. 55, 173-179. Andrews, J.H., 1992. Biological control in the phyllosphere. Annual Review of Phytopathology 30: 603-635. Anon., 1984. Håndbog om Frugt og Grønssager bind 1. Bioteknisk Institut, Kolding, DK Anon., 1986. Håndbog om Frugt og Grønssager bind 2. Bioteknisk Institut, Kolding, DK Anu Appaiah, K.A., Mastan Pasha, Md. & Karanth, N.G.K., 1993. Thiram residue estimation by fungal bioassay and its evaluation in paddy and its milled products. Trop. Agric. (Trinidad) 70, 235-239. Awuah, R.T. & Lorbeer, J.W., 1986. A sorbose-based medium for enumerating propagules of Fusarium oxysporum f.sp. apii race 2 in organic soil. Phytopathology 76, 1202-1205. Arul, J., 1994. Emerging technologies for the control of postharvest diseases of fresh fruits and vegetables. In: Biological Control of Postharvest Diseases, Theory and Practice. Eds. C.L. Wilson & M.E.Wisniewski. CRC Press. side 1-10. Betina, V., 1989. Mycotoxins. Chemical, Biological and environmental aspects. Bioactive molecules, vol 9. Elsevier. Betina, V., 1994. Natural occurrence and environmental aspects of antibiotics and mycotoxins. In Bioactive Secondary Metabolites of Microorganisms. Progress in Industrial Microbiology, Vol. 30, Elsevier. side 433-453. Baker, K.F. & Cook, R.J., 1974. biological Control of Plant Pathogens. W.H. Freeman and Company, San Fransisco. 433 sider. Bissett, J., 1991. A revision of the genus Trichoderma. III. Section Pachybasium. Can J. Bot. 69, 2373-2417. Blakeman, 1985. Ecological succession of leaf surface organisms in relation to biological control. In: Biological control of the phylloplane. Eds Windels, C.E. & Lindow, S.E. The American Phytopathological Society St. Paul, Minnesota. Side 6-30, Blakeman, J.P. & Fokkema, N.F., 1982. Potential for biological control of plant diseases on the phylloplane. Ann. Rev. Phytopathol.20, 167-192. Bolton, H., Fredrickson, J.K. & Elliott, L.F., 1993. Microbial ecology of the rhizosphere. In: Soil Microbial Ecology. Ed. F.B. Metting. Marcel Dekker, Inc. side 27-63. Brady, N.C., 1984. The Nature and Properties of Soil. Macmillan Publishing Company, New York. 750 sider Bulgarelli, M.A. & Brackett, R.E., 1991. The importance of fungi in vegetables. In: Handbook of Applied Mycology, Vol. 3: Foods and Feeds. Eds. Arora, D.K., Mukerji, K.G. & Marth, E.H.. Marcel Dekker Inc., New York. s. 179-199. Burkhead, K.D., Schisler, D.A. & Slininger, P.J., 1994. Pyrrolnitrin production by biological control agent Pseudomonas cepacia B37w in culture and in colonized wounds of potatoes. Applied and Environmental Microbiology 60, 2031-2039. Campbell, R., 1989. biological control of microbial pathogens. Cambrigde University Press. 216 sider. Campbell, R & Greaves, M.P., 1990. Anatomy and community structure in the rhizosphere. In: The Rhizosphere. Ed. J.M. Lynch. John Wiley & Sons. side 11-31. Chao, W.L., Nelson, E.B., Harman, G.E. & Hoch, H.C., 1986. Coloniza- tion of the rhizosphere by biological control agents applied to seeds. Phytopathology 76, 60-65. Chet, I., 1987.Trichoderma- application, mode of action, and potential as biocontrol agent of soilborne plant pathogenic fungi. In: Innovative Approaches to Plant Disease Control. (Ed. I. Chet). John Wiley & Sons, New York. side 137-161. Chet, I & Baker, R., 1981. Isolation and biocontrol potential of Trichoderma hamatum from soil naturally suppressive to Rhizotonia solani. Phytopathology 71, 286-290. Claydon, N., Allan, A., Hanson, J.R. & Avent, A.G., 1987. Antifungal alkyl pyrones of Trichoderma harzianum. Trans. Br. mycol. Soc. 88, 503-513. Cooney, J.M., Lauren, D.R., Jensen, D.J. & Perry-Meyer, L.J., 1997. Effect of harvest time, temperature, light, and spore inoculum concentration on 6-n-pentyl-2H-pyran-2-one production by Trichoderma spp. J. Agric. Food Chem. 45, 2802-2806. Cook, R.J. & Baker, K.F., 1983. The nature and practice of biological control of plant pathogens. American Phytopathology Society, St Paul, MN. 539 sider. Corley, D.G., Miller-Wideman, M & Durley, R.C., 1994. Isoaltion and structure of harzianum A: a new trichothecene from Trichoderma harzianum. Journal of Natural Products 57, 422-425. Cullen, D & Andrews, J.H., 1984. Evidence for the role of antibiotics in the antagonism of Chaetomium globosum to the apple scab pathogen, Venturia inaequalis. Can. J. Bot. 62, 1819-1823. Curl, E.A. & Truelove, B., 1986. The rhizosphere, Springer Verlag, Berlin. 288 sider. Cutler, H.G. & Hill, R.A., 1994. Natural fungicides and their delivery systems as alternatives to synthetics. In: Biological Control of Postharvest Diseases, Theory and practice. Eds. C.L. Wilson & M.E. Wisniewski. CRC Press. side 135-152. Danielson, R.M. & Davey, C.B., 1973a. Effects of nutrients and acidity on phialospore germination of Trichoderma in vitro. Soil Biol. Bichem. 5, 517-524. Danielson, R.M. & Davey, C.B., 1973b. Non nutritional factors affecting the growth of Trichoderma in culture. Soil Biol. Bichem. 5, 495-504. Deacon, J.W., 1991. Significance of ecology in the development of biocontrol agents against soil-borne plant pathogens. Biocontrol Sci. Techn. 1, 5-20. deLeij, F.A.A.M., Whipps, J.M. & Lynch, J.M., 1995. Traditional methods of detecting and selecting functionally important microorganisms from the soil and the rhizosphere. In: Microbial Diversity and Ecosystem Function. Eds. D. Allsopp, R.R. Colwell & D.L. Hawksworth) CAB International, UK. side 321-336. Demain, A.L., 1992. Regulation of secondary metabolism. In: Biotechnology of Filamentous Fungi. Eds. D.B. Finkelstein & C. Ball. Butterworth-Heinemann. Dennis, C., 1976. The microflora of the surface of soft fruits. In:Microbiology of Aerial Plant Surfaces. Eds C.H. Dickinson & T.F. Preece. Academic Press. 419-439. Dennis, C. & Webster, J. 1971 a. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma. I Production of non-volatile antibiotics. Transactions of the British mycological Society 57, 25-39. Dennis, C. & Webster, J. 1971 b. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma. II. Production of volatile antibiotics. Transactions of the british mycological Society 57, 41-48. Dickinson, C.H., 1976. Fungi on the areal surfaces of higher plants. In: Microbiology of Aerial Plant Surfaces. Eds C.H. Dickinson & T.F. Preece. Academic Press. 293-324. Dickinson, J.M., Hanson, J.R. & Truneh, A., 1995. Metabolites of some biological control agents. Pestic. Sci. 44, 389-393. Domsch, K.H., Gams, W. & Anderson, T.H., 1980. Compendium of soil fungi. Vol 1-2. Academic Press, London. Eastburn, D.M. & Butler, E.E., 1991. Effects of soil moisture and temperature on the saprophytic ability of Trichoderma harzianum. Mycologia 83, 257-263. Eden, M.A., Hill, R.A. & Stewart, A., 1996. Biological control of Botrytis cinerea stem infection of greenhouse tomatoes. Plant Pathology 45, 276-284. Ekundayo, C.A., 1987. Mycoflora and vitamin content of sun-dried food condiments in Nigeria. Plant Foods for Human Nutrition 37, 247-252. Elad, Y. (1994). Biological control of grape mould by Trichoderma harzianum. Crop Protection 13, 35-38. Elad, Y. & Kirshner, B., 1992. Establishment of an active Trichoderma population in the phylloplane and its effect on grey mould Botrytis cinerea. Phytoparasitica 20 (suppl.) , 137-141. Elad, Y. & Kirshner, B., 1993. Survival in the phylloplane of an introduced biocontrol agent (Trichoderma harzianum) and populations of the plant pathogen Botrytis cinerea as modified by abiotic conditions. Phytoparasitica 21, 303-313. Elad, Y, Malathrakis, N.E. & Dik, A.J., 1996. Biological control of Botrytis-incited diseases and powdery mildews in greenhouse crops. Crop Protection 15, 229-240. Elad, Y., Zimand, G., Zaqs, Y., Zuriel, S. & Chet, I., 1993. Use of Trichoderma harzianum in combination or alternation with fungicides to control cucumber grey mould (Botrytis cinerea) under commercial greenhouse conditions. Plant Pathology 42, 324-332. Elmholt, S., 1991. Side effects of propiconazole, (Tilt 250 EC) on non-target soil fungi in a field compared with natural stress effects. Microbial Ecology 22, 99-108. Erwin, D.C. & Ribeiro, O.V., 1996. Phytophthora Diseases Worldwide. APS Press. St Paul, Minnesota. Falconi, C.J. & Mendgen, K., 1994. Epiphytic fungi on apple leaves and their value for control of postharvest pathogens Botrytis cinerea, Monilinia fructigena and Penicillium expansum. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz 101, 38-47. Fitt, B.D.L, McCartney, H.A. & Walklate, P.J., 1989. The role of rain in dispersal of pathogen inoculum. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 241-270. Fokkema, N.J., 1983. Narurally-occurring biological control in the phyllosphere. Microbial antagonism. Modes of action and application to the biological control of plant pathogens. (Eds. B. Dubos & J. Olivier.. XXIVe Colloque de la Society Francaise de Phytopathologie.. side 71-79. Fokkema, N.J., 1993. Opportunities and problems of control of foliar pathogens with micro-organisms. Pestic. Sci. 37, 411-416. Fokkema, N.J., 1995. Biological control of foliar fungal diseases. In: Biological Control: Benefits and Risks. Eds. H.M.T. Hokkanen & J.M. Lynch. Cambrigde University Press. side 167-176. Fokkema, N.J., Den Houter, J.G., Kosterman, Y.J.C. & Nelis, A.C., 1979. Manipulation of yeasts on field- grown wheat leaves and their antagonistic effect on Cochliobolus sativus and Septoria nodorum. Trans Br. mycol. Soc. 72,19-29. Folker-Hansen, P., 1993. Miljømæssig vurdering af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Fravel, D.R., 1988. Role of antibiosis in the biocontrol of plant diseases. Ann. Rev. Phytopathology 26, 75-91. Frisvad, J.C. & Samson, R.A., 1991. Filamentous fungi in foods and feeds: ecology, spoilage, and mycotoxin production. In: Handbook of Applied Mycology. Volume 3: Foods and Feeds. Eds D.K. Arora, K.G. Mukerji & E.H. Marth. Marcel Dekker, Inc. New York. Side31-68. Gaulino, M.L., Aloi, C. & Garibaldi, A., 1987. Evaluation of the influence of different temperatures, relative humidityes and nutritional supports on the antagonistic activity of Trichoderma spp. against gray mould of grape. In: Influence of Environmental Factors on the Control of Grape Pests, Diseases and Weeds. Ed. R. Cavalloro. Proceedings of a meeting of the EC Expert's Group/Tessaloniki 6-8 October 1987, A:A:Balkema, Rotterdam/Brokefield/. s.231-235. Ghisalberti, E.L. & Sivasithamparam, K., 1991. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp. Soil. Biol. Biochem. 23, 1011-1020. Gokulapalan, C. & Nair, M.C., 1992. Phylloplane fungi of rice as mycoparasites of Rhizotonia solani. Indian Phytopathology45, 367-368. Gottlieb, D., 1976. The production and role of antibiotics in soil. J. Antibiot. 29, 987-1000. Goulard, C., Hlimi, S, Rebuffat, S. & Bodo, B., 1995. Trichozins HA and MA, antibiotic peptides from Trichoderma harzianum. I. Fermentation, Isolation and Biological Properties. J. Antibiotics 48, 1248-1253. Green, H., & Jensen, D.F., 1995. A tool for monitoring Trichoderma harzianum: II. The use f a GUS transformant for ecological studies in the rhizosphere. Phytopathology 85, 1436-1440. Green, H., 1996. Ecology of Trichoderma spp. in relation to biocontrol of plant diseases caused by Pythium ultimum. Ph.D. thesis. Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole. Hammond, P.M., 1995. Described and estimated spicies numbers: an objective assessment of current knowledge. In: Microbial Diversity and Ecosystem Function. Eds. D. Allsopp, R.R. Colwell & D.L. Hawksworth) CAB International, UK. side 29-72. Hansen, B.M., Hyldebrink, P., Eilenberg, J. & Pedersen J.C., 1996. Bacillus thuringiensis. Ecology and Environmental Use for Microbial Pest Control. Ministry of Environment and Energy, Denmark. Miljøprojekt nr. 316. 126 sider. Harman, G.E. 1991. Seed treatment for biological control of plant disease. Crop Protection 10, 166-171. Harman, G.E., 1992. Development and benefits of rhizosphere competent fungi for biological control of plant pathogens. Journal of Plant Nutrition 15, 835-843. Harman, G.E., Latorre, B., Agosin, E., San Martin, R., Riegel, P.A., Nielsen, P.A., Tronsmo, A & Pearson, R.C., 1996. Biological and intergrated control of Botrytis bunch rot of grape using Trichoderma spp. Biological Control 7, 259-266. Harman, G.E. & Taylor, A.G., 1988. Improved seedling performance by integration of biological control agents at favorable pH levels with solid matrix priming. Phytopathology 78, 520-525. Harris, A.R. & Lumsden, 1997. Interactions of Gliocladium virens with Rhizotonia solani and Pythium ultimum in non-sterile potting medium. Biocontrol Science and Technology 7, 37-47. Heiberg, N., Green, H. & Jensen, D.F., 1996. Population growths and survival of Trichoderma harzianum and Trichoderma virens in sphagnum peat. In: Monitoring Antagonistic Fungi Deliberately Released into the Environment. Eds. D.F. Jensen H-B. Jansson & A. Tronsmo. Kluwer Academic Publishers. side 25-31. Hermansen, J.E & Stapel, C., 1979.Smitsomme sygdomme hos danske landbrugsplanter. DSR Forlag. 198 sider. Hlimi, S., Rebuffat, S., Goulard, C., Duchamp, S. & Bodo, B., 1995. Trichozins HA and MA, antibiotic peptides from Trichoderma harzianum. II. Sequence Determination. J. Antibiotics 48, 1254-1260. Ingold, C.T., 1960. Dispersal by air and water - the take-off. In: Plant Pathology, An Advanced Treatise. Volume III. The Disease Population Epidemics and Control. Eds. J.G. Horsfall & A.E. Diamond. Academic Press, New York. side 137-169. Ingold, C.T., 1979. Dispersal of microorganisms. In: Plant Disease Epidemiology. Blackwell Scientific Publications. Side 11-22. Jeffries, P. & Young, T.W.K., 1994. Interfungal parasitic relationships. CAB International. Jensen D.F.& Hockenhull, J., 1984. Root exudation, rhizosphere microorganisms and disease control. Växtskyddsnotiser 3-4, 49-54. Jensen, B., Knudsen, I.M.B, Jensen, D.F. & Hockenhull, J., 1996. Application of antagonistic microorganisms to seeds to control fungal plant pathogens. Combined Proceedings International Plant Propagators' Society 46, 8-14. Kader, A.A., 1985. Modified atmospheres and low-pressure systems during transport and storage. In: Postharvest Technology of Horticultural Crops. Eds. A.A. Kader, R.F. Kasmire, F.G. Mitchell, M.S. Reid, N.F., Sommer & J.F. Thompson. The Regents of the University of California, USA. side 58-67. Keel, C., Schnider, U., Maurhofer, M., Voisard, C., Laville, J., Burger, U., Wirthner, P., Haas, D. & Défago, G., 1992. Suppression of root diseases by Pseudomonas fluorescens CHA0: importance of the bacterial secondary metabolite 2,4-diacetylphloroglucinol. Molecular Plant-Microbe Interactions 5, 4-13. Kenerley, C.M. & Andrews, J.H., 1990. Interactions of pathogens on Plant Surfaces. In: Microbes and Microbial Products as Herbicides. (Ed. R.E. Hoagland). ACS Symposium Series 439. American Chemical Society, Washington, DC. side 192-217. King, A.D., Jr., 1986. Fungal flora and counts on foods. In: Methods for the Mycological Examination of Food. eds. King, A.D., Pitt, J.I., Beuchat, L.R. & Corry, J.E.L.. Series A: Life Science Vol. 182-185. Kinkel, L.L., 1997. Microbial population dynamics on leaves. Annu. Rev.Phytopathol. 35,327-347. Knudsen, G.R. & Bin, L., 1990. Effects of temperature, soil moisture, and wheat bran on growth of Trichoderma harzianum from alginate pellets. Phytopathology 80, 724-727. Köhl, J. & Fokkema, N.J. 1994. Fungal interactions on living and necrotic leaves. In: Ecology of Plant Pathogens. Eds. J.P. Blakeman & B. Williamson. CAB International, UK. side 321-334. Lacey, J., 1989. Pre-and post-harvest ecology of fungi causing spoilage of foods and other stored products. Journal of Applied Bacteriology Symposium Supplement 1989, 11-25. Lacey, J., Ramakrishna, N., Hamer, A., Magan, N. & Marfleet, I.C., 1991.In: Handbook of Applied Mycology Volume 3: Foods and Feeds. Eds. D.K. Arora, K.G. Mukerji & E.H. Marth. Marcel Dekker, Inc. Side 121-178. Land, C.J., Lundstrom, H. & Werner, S., 1993. Production of tremorgenic mycotoxins by isolates of Aspergillus fumigatus from savmills in Sweden. Mycopathologia 124, 87-93. Latorre, B.A., Agosin, E., San Martin, R. & Vasques, G.S., Effectiveness of conidia of Trichoderma harzianum produced by liquid fermentation against Botrytis bunch rot of table grape in Chile. Crop Protection 16, 209-214. Lewis, J.A. & Papavizas, G.C., 1984. A new approach to stimulate population proliferation of Trichoderma species and other potential biocontrol fungi introduced into natural soils . Phytopathology 74, 1240-1241. Lewis, J.A. & Papavizas, G.C., 1985. Characteristics of alginate pellets formulated with Trichoderma and Gliocladium and their effect on the proliferation in soil. Plant Pathol.,34, 571-577. Lewis, J.A. & Papavizas, G.C., 1987. Application of Trichoderma and Gliocladium in alginate pellets for control of Rhizotonia damping-off. Plant Pathol. 36, 438-446. Lewis, J.A. & Papavizas, G.C., 1991. Biocontrol of plant diseases: the approach for tomorrow. Crop Protection 10, 95-105. Lifshitz, R., Windham, M.T. & Baker, R., 1986. Mechanism of biological control of preemergence damping-off of pea by seed treatment with Trichoderma spp. Phytopathology 76, 720-725. Liljeroth, E. 1990. Microorganisms in the rhizosphere of barley and wheat: The effects of variety and nitrogen fertilization. Ph.D. afhandling. The Swedish University of Agricultural Science, Svalöv. Liu, S. & Baker, R., 1980. Mechanism of biological control in soil suppressive to Rhizotonia solani. Phytopathology 70, 404-412. Lo, C.T., Nelson, E.B. & Harman, G.E., 1996. Biological control of turfgrass diseases with a rhizosphere competent strain of Trichoderma harzianum. Plant Disease 80, 736-741. Lo, C.T., Nelson, E.B. & Harman, G.E., 1997 a. Improving the biocontrol efficacy of Trichoderma harzianum 1295-22 for controlling foliar phases of turf diseases by spray application. Plant Disease 81, 1132-1138. Lo, C.T., Nelson, E.B., Hayes, C.K. & Harman, G.E., 1997 b. Ecological studies of transformed Trichoderma harzianum strain 1295-22 in the rhizosphere and on the phylloplane of creeping bentgrass. Phytopathology (Submittet) Lumsden, R.D., Carter, J.P., Whipps, J.M. & Lynch, J.M., 1990. Comparison of biomass and variable propagules measurements in the antagonism of Trichoderma harzianum against Pythium ultimum. Soil Biol. Biochem., 22, 187-194. Lumsden , R.D. & Lewis, J.A., 1989. Selection, production, formulation and commercial use of plant disease biocontrol fungi: problems and progress. In: Biotechnology of fungi for improving plant growth. Eds. J.M. Whipps & R.D. Lumsden. Cambrigde University Press. side 171-190. Lumsden, R.D., Locke, J.C., Adkins, S.T., Walter, J.F. & Ridout, C.J., 1992. Isolation and localisation of the antibiotic gliotoxin produced by Gliocladium virens from alginate prill in soil and soilless media. Phytopathology 82, 1230-235. Lumsden, R.D & Walter, J.F., 1995. Development of the biocontrol fungus Gliocladium virens: risk assessment and approval for horticultural use. In: Biological Control: Benefits and Risks. Eds. H.M.T. Hokkanen & J.M. Lynch. Cambrigde University Press. side 263-269. Lübeck, M., 1994. Toksiske metabolitter fra udvalgte mikroorganismer. Miljøministeriet Miljøstyrelsen, Arbejdsrapport fra Miljøstyrelsen, Nr. 18, 108 sider. Lynch, J.M., 1990. Introduction: some consequences of microbial rhizosphere competence for plant and soil. In: The Rhizosphere. Ed. J.M. Lynch. John Wiley & Sons. side 1-10. Magan, N & Lynch, J.M., 1986. Water potential, growth and cellulolysis of fungi involved in decomposition of cereal residues. Journal of General Microbiology 132, 1181-1187. Martin, S.E. & Ordal, Z.J., 1980. Sources of food spoilage microorganisms. In: The Safety of Foods. Ed. H.D. Granam. Side 55-67. McCartney, H.A., 1994. Spore dispersal: environmental and biological factors. In: Ecology of Plant Pathogens. Eds. J.P. Blakeman & B. Williamson. CAB International, UK. side 171-185. McGee, D.C., Olanya, O.M. & Hoyos, G.M., 1996. Populations of Aspergillus flavus in the Iowa cornfield ecosystem in years not favourable for aflatoxin contamination in corn grain. Plant Dis. 80, 742-746. McIntyre, J.L. & Press, L.S. 1991. Formulation, delivery systems and marketing of biocontrol agents and plant growth promoting rhizobacteria. In: The rhizosphere and plant growth. Eds. Keister, D.L. & P.B. Cregan, Klüwer Academic Publishers, Netherlands. 289-295. McKenzie, Benzi, D., Dellavalle, D. & Gullino, L., 1991. Survival on the phylloplane of strains of Trichoderma spp. antagonistic to Botrytis cinerea. Petria 1,133-134. McLean, M.A & Sutton, J.C., 1992. Mycoflora of strawberry in Ontario.Can. J. Bot. 70, 846-852. Mertz, D., Edward, T., Lee, D. & Zuber, M., 1981. Absorption of aflatoxin by lettuce seedlings grown in soil adulterated with aflatoxin B1. J. Agric. Food Chem. 29, 1168-1170. Migheli, Q, Herrera-Estrella, A., Avataneo, M. & Gullino, M.L., 1994. Fate of transformed Trichoderma harzianum in the phylloplane of tomato plants. Molecular Ecology 3, 153-159. Morris, C.E. & Rouse, D.I., 1985. Role of nutrients in regulating epiphytic bacterial populations. In: Biological Control on the Phylloplane. (Eds. C.E. Windels & S.E. Lindow). The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota. Side 63-82. Nielsen, M.S., 1995. Mykotoksiner: nedbrydning og stabilitet generelt samt forekomst og nedbrydning i jord. Danmarks Tekniske Universitet, Institut for Bioteknologi, DK. 38 sider. Nikulin, M., Reijula, K., Jarvis, B.B. & Hintikka, E.L., 1996. Experimental lung mycotoxicosis in mice induced by Stachybotrys atra. Int. J. Exp. Pathol. 77, 213-218. Ominski, K.H., Marquardt, R.R., Sinha, R.N. & Abramson, D., 1994. Ecological aspects of growth and mycotoxin production by storage fungi. In: Mycotoxins in Grain: Compounds Other Than Aflatoxin. Eds. J.D. Miller & H.L. Trenholm. Eagan Press, St Paul, Minnesota, USA. side 287-314. O'Neill, T.M., Niv, A., Elad, Y. & Stienberg, D., 1996. Biological control of Botrytis cinerea on tomato stem wounds with Trichoderma harzianum. European Journal of Plant Pathology 102, 635-643. Orum, T.V., Bigelow, D.M. & Nelson, M.R., 1997. Spatial and temporal patterns of Aspergillus flavus strain composition and propagule density in Yuma Country, Arizona, soils. Plant Disease 81,911-916. Pandey, R.R., Arora, D.K. & Dubey, R.C., 1993. Antagonistic interactions between fungal pathogens and phylloplane fungi of guava. Mycopathologia 124, 31-39. Papavizas, G.C., 1982. Survival of Trichoderma harzianum in soil and in pea and bean rhizospheres. Phytopathology 72, 121-125. Papavizas, G.C., 1985. Trichoderma and Gliocladium: Biology, Ecology, and Potential for Biocontrol. Ann. Rev. Phytopathol. 23, 23-54 Papavizas, G.C. & Davey, C.B., 1961. The extent and nature of the rhizosphere of Lupinus. Plant Soil 14, 215-236. Papavizas, G.C. & Lumsden, R.D., 1980. Biological control of soilborne fungal propagules. Ann. Rev. Phytopathol. 18, 389-413. Parkinson, D. & Coleman, D.C., 1991. Mocrobial communities, activity and biomass. Agriculture, Ecosystems and Environment 34, 3-33. Penrose, L.J., Nicholls & Koffmann, W., 1984. Apple fruit rot caused by Trichoderma harzianum. Australasian Plant Pathology 13, 46-47. Pitt, J.I. & Hocking, A.D., 1985. Spoilage of fresh and perishable foods. In: Fungi and Food Spoilage. Academic Press. side 365-381. Pitt, J.I. & Hocking, A.D., 1997. Fungi and Food Spoilage. Blakey Academic & Professional, London. 593 sider. Pohland, , A.E. & Wood, G.E., 1987. Occurrence of mycotoxins in foods. In: Mycotoxins in Foods. Ed. P. Krogh. Academic Press. side 35-64. Pratella, G.C. & Mari, M., 1991. Trichoderma and Gliocladium in biological control of postharvest diseases. Petria 1, 155.(abstract) Rifai, M.A., 1969. A revision of the genus Trichoderma. Commonw. Mycol. Inst. Mycol. Pap. 116, 56 sider. Renwick, A., Campbell, R. & Coe, S., 1991. Assessment of in vitro screening systems for potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis. Plant Pathology 40, 524-532. Roper, M.M. & Ophel-Keller, K.M., 1997. Soil microflora as bioindicators of soil health. In: Biological Indicators of Soil Health. Eds. C.E. Pankhurst, B.M. Doube & V.V.S.R. Gupta. CAB International. Side 157-178. Sawa, R., Mori, Y., Iinuma, H., Naganawa, H., Hamada, S., Furuutani, H., Kajimura, Y., Fuwa, T. & Takeuchi, T., 1994. Harzianic acid, a new antimicrobial antibiotic from a fungus. J. Antibiotics 45, 731-732. Schmitz, S., Weidenbörner, M. & Kunz, B., 1993. Herbs and spices as selective inhibitors of mould growth. Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm. 15, 175-177. Serrano-Carreon, L., Hathout, Y., Bensoussan, M. & Belin, J-M., 1992. Production of 6-pentyl-a-pyrone by Trichoderma harzianum from 18:n fatty acid methyl esters. Biotechnol. Lett. 14, 1019-1024. Seiler, D.A.L.,,1986. Baseline counts for wheat, flour and bran. In: Methods for the Mycological Examination of Food. eds. King, A.D., Pitt, J.I., Beuchat, L.R. & Corry, J.E.L.. Series A: Life Science Vol. 182-185. Sivan, A. & Chet, I., 1989. The possible role of competition between Trichoderma harzianum and Fusarium oxysporum on rhizosphere colonization. Phytopathology 79, 198-203. Sivan, A. & Harman, G.E., 1991. Improved rhizosphere competence in a protoplast fusion progeny of Trichoderma harzianum. J. Gen. Microbiol. 137, 23-29. Sivapalan, A., 1993. Fungi associated with broccoli seed and evaluation of fungal antagonists and fungicides for the control of seed-borne Alternaria brassicicola. Seed Sci. & Technol. 21, 237-245. Slight, J., Nicholson, W.J., Mitchell, C.G., Pouilly, N., Beswick, P.H., Seaton, A. & Donaldson, K., 1996. Inhibition of the alveolar macrophage oxidative burst by a diffusable component from the surface of the spores of the fungus Aspergillus fumigatus. Thorax 51, 389-396. Slininger, P.J. & Shea-Wilbur, M.A., 1995. Liquid-culture pH, temperature, and carbon (not nitrogen) source regulate phenazine productivity of take-all biocontrol agent Pseudomonas fluorescent 2-79. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 794-800. Slininger, P.J., Van Cauwnnberge, J.E., Bothast, R.J., Weller, D.M., Thomashow, L.S. & Cook, R.J., 1996. Effect of growth culture physiological state, metabolites, and formulation on the viability, phytotoxicity, and efficacy of the take-all biocontrol agent Pseudomonas fluorescent 2-79 stored encapsulated on wheat seeds. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 391-398. Smith, J.E. & Anderson, J.G., 1992.Modes of arrival and establishment of microfungi. Journal of Applied Bacteriology Symposium Supplement 1992, 73, 69-79. Smith, J.E., Lewis, C.W., Anderson, J.G. & Solomons, G.L., 1994. Mycotoxins in human nutrition and health. European Commission.Directorate -General XII, Science, Research and Development, Bruxelles, 1994. Smilanick, J.L., 1994. Strategies for the isolation and testing of biocontrol agents. In: Biological Control of Postharvest Diseases, Theory and Practice. Eds. C.L. Wilson & M.E.Wisniewski. CRC Press. side 25-41. Sommer, N.F., 1985 a. Principles of disease suppression by handling practices. In: Biological Control of Postharvest Diseases - Theory and Practice. Eds. C.L. Wilson & M.E. Wisniewski. CRC Press, Inc. 75-82. Sommer, N.F., 1985 b. Strategies for control of postharvest diseases of selected commodities. In: Biological Control of Postharvest Diseases - Theory and Practice. Eds. C.L. Wilson & M.E. Wisniewski. CRC Press, Inc. 83-99. Sommer,N.F., Fortlage, R.J., Buchanan, J.R. & Kader, A.A., 1981. Effect of oxygen on carbon monoxide suppression of postharvest pathogens of fruits. Plant Disease 65, 347-349. Speijers, G.J.A. & van Egmond., 1993. Worldwide ochratoxin A levels in food and feeds. In: Human Ochratoxicosis and its Pathologies. Eds. E.E. Creppy, M. Castegnara & G. Dirheimer. John Libbey, Eurotext, Colloquium Inserm Vol 231. side 85-100. Spotts, R.A., & Sanderson, P.G., 1994. The postharvest environment and biological control. In: Biological Control of Postharvest Diseases - Theory and Practice. Eds. C.L. Wilson & M.E. Wisniewski. CRC Press, Inc. 43-56. Spurr, H.W. & Welty, R.E., 1975. Characterization of endophytic fungi in healthy leaves of Nicotiana spp. Phytopathology 65, 417-422. Spurr, jr. H.W., 1994. The microbial ecology of fruit and vegetable surfaces: Its relationship to postharvest biocontrol. In: Biological Control of Postharvest Diseases- Theory and Practice. Eds. C.L. Wilson & M.E. Wisniewski. CRC Press, Inc. 11-24. Stirling, A.M., Coates L.M., Pegg, K.G. & Hayward, A.C., 1995. Isolation and selection of bacteria and yeasts antagonistic to preharvest infection of avocado by Colletotrichum gloesporioides. Aust. J. Agric. Res., 46, 985-95. Subba Rao, N.S., 1995. Soil Microorganisms and Plant Growth. Science Publishers Inc., USA. 335 sider. Summer, D.R., Gitaitis, J.D., Gay, J.D., Smittle, D.A., Maw, B.W., Tollner, E.W. and Hung, Y.C., 1997. Cotrol of Selbourne pathogenic fungi in fields of sweet onion. Plant Disease 81, 885-891. Sztejnberg, A. & Blakeman, J.P., 1973. Untraviolet-induced changes in populations of epiphytic bacteria on beetroot leaves and their effect on germination of Botrytis cinerea spores. Physiological Plant Pathology 3, 443-451. Thomashow, L., Weller, D.M., Bonsall, R.F. & Pierson III, L.S., 1990. Production of the antibiotic phenazine -1-carboxylic acid by fluorescent Pseudomonas species in the rhizosphere of wheat. Appl. Environ. Microbiol. 56, 908-912. Tolstrup, K. 1984. Saprophytic fungi in the phyllosphere of barley and their effects on the plants' growth and grain yield. P.hD afhandling, Den Kgl Veterinær - og Landbohøjskole, København. 122 sider. Thrane, C., Tronsmo, A. & Jensen, D.F., 1997. Endo-1,3-b-glucanase and cellulase from Trichoderma harzianum: purification and partial characterization, induction of and biological activity against plant pathogenic Pythium spp. European Journal of Plant Pathology 103, 331-344. Tronsmo, A., 1989a. Effects of fungicides and insecticides on growth of Botrytis cinerea ,Trichoderma viride and T. harzianum. Norwegian Journal of Agricultural Science 3, 151-156. Tronsmo, A., 1989b. Trichoderma harzianum used for biological control of storage rot on carrots. Norwegian Journal of Agricultural Science 3, 157-161. Tronsmo, A., 1986. Trichoderma used as a biocontrol agent against Botrytis cinerea rots on strawberry and apple. Meldinger fra Norges Landbrukshøgskole 65 (17), 1-22. Tronsmo, A. & Dennis, C., 1977. The use of Trichoderma species to control strawberry fruit rots. Netherlands Journal of Plant Pathology 83, (suppl. 1) 449-455. Tronsmo, A. & Dennis, C., 1978. Effect of temperature on antagonistic properties of Trichoderma species. Trans. Br. mycol. Soc. 71, 469-474. Tronsmo, A., 1992. Leaf and blossom epiphytes and endophytes as biological control agents. In: Biological Control of Plant Diseases. Eds. E.S. Tjamos, G.C. Papavizas & R.J. Cook. NATO ASI Series. Plenum Press, New York. side 43-54. Wallace, H.R., 1978. Dispersal in time and space: soil pathogens. In: Plant Disease. An Advanced Treatise, Vol. II. How Diseases develops in Populations. Eds. J.G. Horsfall & E.B. Cowling. Side 181-202. Walter, J.F. & Lumsden, R.D., 1997. Gliocladium and biological control of damping-off complex. In: Ecology Interactions and Biological Control. Eds. D.A. Andow, D.W. Ragsdale & F. Nyvall. WestviewPress 1997. side 254-267. Warcup, J.H., 1955. On the origin of colonies of fungi developing on soil dilution plates. Trans. Br. mycol. Soc., 38, 298-301. Weidenbörner, M. & Hindorf, H., 1989. Fungi isolated from protein enriched seeds and pods with special emphasis on the genus Aspergillus. Seed Sci. & Technol. 17, 383-390. Weller, D.M. & Cook, R.J., 1983. Supression of take-all of wheat by seed treatments with fluorescent pseudomonas. Phytopathology 73, 463-469. Weller, D.M. & Thomashow, L.S., 1994. Current challenges in introducing beneficial microorganisms into the rhizosphere. In: Molecular Ecology of Rhizosphere Organisms. Eds. F. O'Gara, D.N. Dowling & B. Boesten. Weinheim, New York. side 1-18. Widden, P. & Scattolin, V., 1988. Competitive interactions and ecological strategies of Trichoderma species colonizing spurce litter. Mycologia 80, 795-803. Williams, S.T. & Vickers, J.C., 1986. The ecology of antibiotic production. Microb. Ecol. 12, 43-52. Visconti, A & Sibilia, A.,1994. Alternaria toxins. In: Mycotoxins In Grains, Compounds Other Than Aflatoxin. Eds J.D. Miller & H.L. Trenholm. Eagan Press, USA. side 315-336. Wilhite, S.E., Lumsden, R.D. & Straney, D.C., 1994. Mutational analysis of gliotoxin production by the biocontrol fungus Gliocladium virens in relation to suppression of Pythium damping-off. Phytopathology 84, 816-821. Wright, J.M., 1952. Production of gliotoxin in unsterilized soil. Nature 170, 673-674. Wright, J.M., 1956a. The production of antibiotics in soil I. Production of gliotoxin by Trichoderma viride. Ann. appl. Biol., 41, 280-289. Wright, J.M., 1956b. The production of antibiotics in soil III. Production of gliotoxin in wheat straw buried in soil. Ann. appl. Biol., 44, 461-466. Wright, J.M., 1956c. The production of antibiotics in soil IV. Production of
antibiotics in coats of seeds sown in soil. Ann. appl. Biol., 44,
561-566. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||