Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler og toksiske metabolitter

1. Introduktion

1.1 Projektets baggrund
1.1.1 Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler i Danmark
1.1.2 Projekts formål
1.2 Projektindhold og afgrænsning
1.2.1 Problemløsning
1.2.2 Mikrobiologiske bekæmpelsesorganismer
1.3 Litteraturens begrænsninger i forbindelse med vurdering af mikroorganismers forekomst, kvantitet og aktivitet

Introduktion

Mange bakterier og svampe er i stand til at producere toksiske sekundære metabolitter under forskellige forhold. F.eks. producerer en del levnedsmiddelbårne svampe mykotoksiner under lagring. Man har kendskab til, at mange af de mikroorganismer, der anvendes i mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, producerer en række forskellige toksiske sekundære metabolitter in vitro, men ringe viden om under hvilke forhold og i hvilke mængder de produceres under naturlige forhold in vivo, samt stoffernes stabilitet og persistens (Lübeck, 1994). For nogle mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler er det vist, at produktion af sekundære metabolitter er en nødvendighed for en effektiv bekæmpelse af mål patogener. For de fleste biologiske midler angives andre virkemekanismer at være den primære årsag til antagonisternes effektivitet overfor plantepatogener så som konkurrence om plads og næring, mykoparasitisme og induceret resistens.

I godkendelsesmæssige sammenhænge er det vigtigt at kende til de sundhedsmæssige konsekvenser, der er forbundet med at udbringe potentielt toksinproducerende mikroorganismer inden for plantedyrkning, hvor afgrøderne anvendes til føde for mennesker og husdyr.

1.1 Projektets baggrund

Baggrund

Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler har siden den 26. juli 1993 skulle godkendes af Miljøstyrelsen for at kunne markedsføres i Danmark. Der findes dog en overgangsordning for de midler, der blev solgt i Danmark før den 26. juli 1993, således at disse midler fortsat må sælges, såfremt der er søgt om godkendelse af disse midler senest d. 26. juli 1994. Miljøstyrelsen skal udarbejde kriterier og retningslinier for vurdering med henblik på godkendelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler

Miljøstyrelsen skal vurdere de mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler i forhold til mennesker og dyrs sundhed, og derfor udarbejde retningslinier for vurdering og kriterier for godkendelse af midlerne (Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, Vejledning fra Miljøstyrelsen Nr. 8, 1993). Miljøstyrelsen har tidligere udgivet en rapport vedrørende metoder til undersøgelse af miljømæssige konsekvenser ved udbringning af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler (Folker-Hansen et al., 1993) samt rapport indeholdende oversigt over udvalgte mikroorganismers indhold af kendte sekundære metabolitter (Lübeck, 1994).

1.1.1 Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler i Danmark

Midler

I Danmark må der på nuværende tidspunkt markedsføres 18 mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Ingen af disse midler er endnu godkendte, men er omfattet af overgangsordningen (se afsnit 1.1). Sytten af midlerne indeholder organismer, der er kendt for at kunne producere toksiner: Bacillus thuringiensis,Streptomyces griseoviridis, Phlebiopsis gigantea, Trichoderma harzianum, T. polysporum og Verticillium lecanii. Det 18. middel indeholder et insektvirus, Agrotis segetum granulosis virus og udgør derfor ikke nogen toksinrisiko. Tabel 1.1 viser en oversigt over disse 18 midlers aktive organisme, midlets målgruppe (skadedyr/patogen), tiltænkt afgrøde (værtplante for skadegører) samt midlets udbringningsform. Disse oplysninger stammer fra de pågældende firmaers ansøgning om godkendelse og brugsanvisninger.

Anvendelsesmåde

Afhængigt af de mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers målgruppe udbringes midlerne på forskellig vis. Jordboende svampe og insekter rammes enten ved iblanding, udvanding eller udsprøjtning til voksemediet, samt ved frøbejdsning, mens skadegører i fyllosfæren rammes ved udsprøjtning og evt påsmøring.

1.1.2 Projektets formål

Formål

Formålet med projektet er at belyse, under hvilke miljøbetingelser mikroorganismers metabolitproduktion kan udgøre en sundhedsmæssig risiko i spiselige afgrøder i forbindelse med udbringning af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Dette er tilstræbt ved klarlægge den aktive organismes spredningsmuligheder, etablering- og overlevelseevne i afgrøden i relation til anvendelsesmåden af midlet og økologiske parametre i henholdsvis jord/rodzone, fyllosfære og på afgrøder efter høst. Desuden vil forekomsten af naturlige populationer af toksinproducerende mikroorganismer blive belyst dels for at eksemplificere hvorledes økologiske parametre påvirker disse organismers produktionen af sekundære metabolitter, og dels for at kunne vurdere, om den sundhedsmæssige risiko ved at indtage toksiner fra mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler er større end risikoen ved at indtage toksiner fra den naturligt forekommende mikrobiota. Rapporten vil kunne være med til at danne grundlag for Miljøstyrelsens eventuelle kravsspecifikationer om dokumentation samt acceptkriterier for mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler.

Tabel 1.1. Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, der må markedsføres i Danmark.

Table 1.1. Microbial pest control agents allowed to be market in Denmark

Se her

1.2 Projektindhold og afgrænsning

1.2.1 Problemløsning

Lübeck (1994) udarbejdede en oversigt over udvalgte bekæmpelsesorganismers potentielle produktion af sekundære metabolitter og deres toksicitet, og fandt at viden om de sekundære metabolitters produktionsforhold og -mængde, stabilitet og persistens in situ var meget begrænset. Tilstedeværelse af metabolitter som restkoncentrationer i/på planteprodukter må dog i høj grad antages at afhænge af anvendelsesmåden for plantebeskyttelsesmidlet samt af den producerende organismes økologi. Denne rapport tager derfor udgangspunkt i viden om den producerende organismes sprednings-, overlevelses- og etableringsevne i rodzone, fyllosfære og på efterhøstprodukter, da det forventes, at der kun produceres metabolitter, når organismen er aktiv. Ved at studere organismens økologi på relevante plantedele og i relevante økologiske nicher kan man således få belyst, om det er sandsynligt at finde sekundære metabolitter. Desuden inddrages litteraturstudier af den naturligt forekommende mikrobiota, som er metabolitproducerende, dels for at illustrere hvorledes økologiske parametre influerer på mikroorganismernes vækst og toksinproduktion, og dels for at vurdere om den sundhedsmæssige risiko ved at indtage toksiner fra mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler er større end risikoen ved at indtage toksiner fra den naturligt forekommende mikrobiota.

Økologiske nicher

Helt afhængig af planteart anvendes forskellige morfologisk meget forskellige dele af planten til fødevarer herunder eksempelvis rødder (gulerødder, persillerod), knolde (kartofler), bladgrønsager (salat, spinat, krydderurter), frugter (æble, pærer), frø (byg, hvede) og nødder. De økologiske nicher som de mikrobiologiske midler applikeres direkte til, eller som organismen kan spredes til efter den primære applikation nemlig jord/rodzone, fhyllosfære og lagrede høstprodukter giver meget forskelligartede muligheder for mikrobiel vækst. Derfor er disse tre habitaters generelle økologi, specielt med hensyn til svampe og bakterier, beskrevet for bedre at kunne vurdere en applikeret mikroorganismes mulighed for overlevelse, etablering og aktivitet på et givent produkt.

1.2.2 Mikrobiologiske bekæmpelsesorganismer

Mikroorganismer

Rapporten vil primært omhandle bekæmpelsesorganismer (MBO) der markedsføres i Danmark p.t. og som anvendes til bekæmpelse af plantepatogener, jvf. Tabel 1.1. Da kun bakterie- og svampebaserede plantebeskyttelsesmidler er producenter af sekundære metabolitter, vil det virus-baserede insekticid følgeligt ikke blive inddraget i denne rapport. Rapporten vil ej heller omhandle Bacillus thuringiensis varianter's økologi og toksinproduktion, trods denne organismes evne til at producere adskillige toksiner, idet Miljøstyrelsen tidligere har udgivet en rapport om bakteriens økologi og miljømæssige effekter (Hansen et al., 1996). Specifikke forhold vedrørende den insektpatogene svamp Verticillium lecanii vil heller ikke blive beskrevet. Gruppen af antagonister til bekæmpelse af plantesygdomme består af bakterien Streptomyces griseoviridis og svampene Trichoderma harzianum, T. polysporum og Phlebiopsis gigantea. Der vil dog primært blive fokuseret på organismen Trichoderma harzianum og denne organismes udbringning i mark, plantage eller væksthus, og hvor planteprodukter bruges til konsum.

1.3. Litteraturens begrænsninger i forbindelse med vurdering af mikroorganismers forekomst, kvantitet og aktivitet.

Naturlig forekomst

Diversiteten blandt bakterier og svampe i det globale økosystem er enorm. Det er således estimeret, at der på nuværende tidspunkt er beskrevet ca 70.000 arter af svampe og 4.800 arter af bakterier, men de beskrevne arter formodes kun at udgøre henholdsvis 7% og <2% af de teoretisk set eksisterende arter (Hammond, 1995). Fra jordmiljøet er der isoleret og identificeret ca. 40.000 arter af mikroorganismer, men ud fra studier af rRNA er det estimeret at 90% af mikroorganismerne i jord endnu ikke er identificeret (Roper & Ophel-Keller, 1997). Den naturlige forekomst af mikroorganismer i et bestemt økosystem vil derfor kun dække de arter, der kan isoleres og bestemmes ud fra standardmetoder. I de fleste af de undersøgelser, der refereres til i rapporten er der anvendt direkte pladning og/eller forskellige varianter af pladespredninger til detektering og kvantificering af mikroorganismer. Metoderne giver problemer, når populationen af mikroorganismer i jorden eller på og i planter skal detekteres, idet mange mikroorganismer ikke kan eller er vanskelige at dyrke ved hjælp af standarddyrkningsmedier. Derudover kan valg af dyrkningsmediets sammensætning med hensyn til næringkilder pH, vandpotentiale (a_w), inkubationstemperatur etc. også have stor indflydelse ikke blot på den estimerede populationsstørrelse men også på populationens sammensætning (Roper & Ophel-Keller, 1997). Prøveudtagning herunder antal og størrelse samt bearbejdning har også betydning for hvilke mikroorganismer der isoleres. Endvidere har hovedformålet i mange af de refererede undersøgelser været at identificere specifikke grupper af mikroorganismer eksempelvis plantepatogener, hvilket ikke udelukker tilstedeværelsen af arter anvendt til mikrobiologiske bekæmpelse, idet der som oftest findes en restgruppe af uidentificerede organismer. Ydermere er mikroorganismer ved undersøgelse af den naturlige microbiota ofte kun bestemt til slægtsniveau, og derfor af begrænset værdi i rapporten, hvor der ønskes specifik viden om enkelte arters forekomst.

Kvantitet og aktivitet

Brug af pladespredningsteknikken til kvantificering af mikroorganismer i jord og på over-og underjordiske plantedele er især problematisk for svampegruppen. Det skyldes at der er stor forskel på svampegruppen og bakterigruppen med hensyn til morfologien af henholdsvis aktive og inaktive (hvile) stadier (Parkinson & Coleman, 1991). Bakterier eksisterer hovedsagelig som afgrænsede celler og derfor vil pladespredning for disse organismer give et rimeligt udtryk for biomassen. Svampe forekommer derimod både som mycelium og sporer, hvor hovedparten af sporene vil udvikle kolonier, mens kun en ikke nærmere defineret del af myceliet vil udvikle kolonier på substratet. I henhold til Warcup (1955) vil kolonier ved en pladespredning udvikles langt hyppigere fra sporer end fra mycelium. Pladespredninger giver et tal for tilstedeværelsen af spiredygtige strukturer af organismen i form af hyfefragmenter, sporer eller hvilestrukturer, men metoden giver ingen information om organismernes biomasse. Ydermere giver pladespredning heller ikke altid et realistisk mål for mikroorganismers aktivitet, idet antal cfu (colony forming units) og aktivitet ikke nødvendigvis er positivt korrelerede (de Leij et al., 1995; Lumsden et al., 1990). Disse forhold vanskeliggør vurderingen af om påvisning af en specifik arts tilstedeværelse efter pladespredning er udtryk for aktiv kolonisation eller om der er tale om inaktive spiringsenheder. Da aktivitet er en forudsætning for dannelse af sekundære metabolitter kan det derfor ikke alene ud fra cfu afgøres, om en organisme er i stand til at producere metabolitter på en given plantedel. Det ligger dog fast at pladespredninger i forbindelse med nærværende rapport kan give indtryk af om den pågældende organisme er til stede, og dermed potentielt har mulighed for at producere sekundære metabolitter. Vurderingen af mikroorganismers aktivitet må derimod hovedsagelig bedømmes ud fra viden om deres økologi, herunder specielt om organismen vil være i stand til at kolonisere specifikke plantedele i givne økologiske nicher.

In vitro/in vivo

Mange oplysninger omkring mikroorganismernes vækstkrav, metabolitproduktion og biologisk bekæmpelsesaktivitet bygger på in vitro undersøgelser og bør derfor nøje vurderes, idet resultater opnået ved in vitro forsøg ofte afviger signifikant fra resultater opnået in vivo.