Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frø

Sammendrag

Baggrund og formål

Baggrund

Frøbårne sygdomme forårsager på verdensplan store skader på kultur-planterne. Selvom kemisk bejdsning i vid udstrækning har givet en effektiv bekæmpelse af frøbårne sygdomme på korn, er der visse begrænsninger og miljømæssige ulemper forbundet med anvendelse af kemiske pesticider. Det har forstærket efterspørgslen efter alternativer til kemisk bejdsning, og frøbejdsning med antagonistiske mikroorganismer kan være et sådant alternativ. Lovende isolater er som oftest selekteret blandt flere hundrede isolater på baggrund af høj effektivitet under laboratorie og/eller markforhold. Da biologiske bekæmpelsesesmidler er baseret på levende organismer, har vanskeligheder omkring produktion, formulering og shelf-life eller manglende effektivitet ved applikering under markforhold dog ofte vist sig at komplicere kommercialiseringen af sådanne produkter.

Formål

Formålet med dette projekt er at udvikle et biologisk bejdsemiddel mod frøbårne patogener primært i korn som alternativ til kemisk bejdsning og derved opnå en miljømæssigt renere udsæd. I projektet fokuseres undersøgelserne på udvikling af produktions- og formulerings-metoder, der sikrer tilstrækkelig shelf-life (evne til at overleve lagring) og aktivitet af de udviklede præparater samt evaluering af disses effektivitet under markforhold. I projektet benyttes et lovende isolat af Gliocladium roseum (IK726), der er selekteret på baggrund af høj bekæmpelseseffektivitet under markforhold. Størstedelen af arbejdet er koncentreret om biologisk bekæmpelse af sygdomme forårsaget af de frøbårne patogener, Fusarium culmorum og Bipolaris sorokiniana.

Produktion og formulering

Udvikling af G. roseum isolat IK726

Et biologisk bekæmpelsesmiddel baseret på IK726 kan kun fremstå som et realistisk alternativ til de kemiske midler, såfremt aktive spirings-enheder af antagonisten kan masseproduceres og formuleres reproducer-bart og økonomisk rentabelt. Biomasse af IK726 ønskes desuden for-handlet i nedtørret form, primært for at mindske risikoen for kontamine-ring, men også for at få et mere anvendeligt og håndterbart produkt. G. roseum producerer to typer af spiringsenheder: hyfer og ukønnede sporer (konidier). Da hyferne ikke overlever hurtig nedtørring er alle undersø-gelser vedrørende IK726 baseret på konidier. IK726 producerer villigt konidier både ved fast (FaF) og ved flydende fermentering (FlF). Ved opformering på sphagnum/ klid (FaF) med en samlet produktionstid på 16-17 døgn er der opnået en reproducerbar produktion på 3-8 x 10⁸ cfu per g præparat. Ved formulering af konidier fra FaF i molersprodukter er der med en samlet produktionstid på 15 døgn opnået 2.1-6 x 10⁹ cfu/g præparat. Ved en tilsvarende formulering af konidier fra FlF i moler er der med en samlet produktionstid på 9 døgn opnået 2.0-6.5 x 10⁹ cfu/g præparat. Indholdet af cfu/g i G. roseum præparaterne er således fuldt på højde med eller højere end indholdet af aktive enheder i allerede markedsførte præparater baseret på f.eks Trichoderma spp. FlF der er en veletableret teknik til opformering af mikroorganismer generelt, men også FaF, der allerede benyttes til produktion af en række af de kommercielle biologiske bekæmpelsesmidler baseret på svampe-antagonister, kan således med højt udbytte anvendes til opformering af IK726. Ved valg af produktionsmetode bør det indgå i overvejelserne, at flere undersøgelser tyder på, at IK726 konidier fra FaF er mere robuste med hensyn til nedtørringstolerance og shelf-life end konidier fra FlF.

Shelf-life af præparater

Shelf-life af biologiske bekæmpelsesmidler er en central faktor for et præparats kommercielle succes. Det anbefales derfor, at produkterne skal kunne lagres, helst uden køling, i minimum 1 år uden væsentlig tab af overlevelse. Talrige test af IK726´s overlevelse efter lagring ved tem-peraturer fra 4° til 10°C har vist, at lagring ved denne temperatur er uafhængig af produktions- og formuleringmetode, idet shelf-life for alle testede standard- og optimerede præparattyper har været stabil i mere end l år. Stabilisering af IK726´s shelf-life ud over 3-4 måneder ved 20°C er derimod langt vanskeligere, hvilket også er et erkendt problem for mange kommercielle præparater. Ved hjælp af optimerede produktions- og formuleringsmetoder er IK726´s evne til at overleve lagring ved 20°C dog blevet stærkt forbedret. Således kan overlevelsen i både sphagnum/ klid- og molerspræparater nu opretholdes på et stabilt højt niveau i op til et år ved denne temperatur. Med stabilt shelf-life i op til et år, synes mulighederne for kommerciel udnyttelse af G. roseum (IK726) således at være gode.

Spiring af lagrede konidier

Selvom nedtørring af IK726 konidier resulterer i en signifikant reduktion af spiringsprocenten og spiringshastighed ved sammenligning med friskhøstede konidier, så påbegynder både friske og tørrede konidier spiring indenfor 4 timer. Ved sammenligning med mange svampearter anvendt til biologisk bekæmpelse spirer konidier af IK726 relativt hurtigt. Det kan være en betydende faktor ved bekæmpelse af spirings-skadende patogener som Pythium spp, der påbegynder spiring 0-4 timer efter såning af frø.

Biologisk bekæmpelsesaktivitet af lagrede konidier

En høj og stabil bekæmpelseseffekt af lagrede præparater er en væsentlig

forudsætning for, at biologiske bekæmpelsesmidler kan anvendes med succes i jordbrugserhvervet. Kvaliteten af IK726 præparater, målt som bekæmpelseseffektivitet overfor F. culmorum og B. sorokiniana, er derfor evalueret i en række kontrollerede klimakammerforsøg med byg- og hvedeplanter. Graden af bekæmpelse er relateret til præparaternes formulering, lagertemperatur og lagertid. For lagring ved 4°C har såvel standard som optimerede formuleringer af sphagnum/klid og molerspræparater udvist stabil og effektiv bekæmpelse af F. culmorum uafhængig af om præparaterne er lagret få uger eller i op til et år. For vellykket lagring ved 20°C er formuleringen af IK726 meget afgørende. Med standardformuleringer af sphagnum/klid og molerspræparater kan bekæmpelseseffektiviteten opretholdes på højt niveau i ca. 2 måneder efter lagring ved denne temperatur. Med optimeret formulering kan der derimod opretholdes en høj og stabil bekæmpelseseffektivitet over en testperiode på 10 måneder med lagring ved 20°C. Bejdsning med IK726 er endvidere kompatibel med en række klæbemidler, hvilket kan være værdifuldt ved integration af IK726 med eksisterende frøbehandlings-metoder.

Dosis-respons

Der er udarbejdet dosis-respons kurver for sammenhængen mellem antal spiredygtige IK726 konidier på frøene og den procentvise bekæmpelse af F. culmorum og B. sorokiniana. For konidier lagret ved 4°C er der en stærk lineær sammenhæng (r=0.73) mellem dosis (cfu/frø) og den procentvise bekæmpelse af F. culmorum. Det er estimeret, at ca. 5 x 10³ cfu/frø er tilstrækkelig for en effektiv bekæmpelse (>80%). For frisk-høstede konidier er der ligeledes en stærk positiv lineær sammenhæng mellem dosis og bekæmpelse af F. culmorum (r=0.95), og den effektive dosis er af samme størrelsesorden. Det viser, at bekæmpelseseffekten er reproducerbar for begge konidietyper og at effektiviteten af lagrede konidier generelt er lige så høj som for friskhøstede konidier. Med hensyn til bekæmpelse af B. sorokiniana, har en dosering på 1 x 10⁴ cfu/frø af såvel friske som lagrede konidier af IK726 generelt givet en effektiv bekæmpelse (>80%). En dosering på ³10⁴ cfu/frø bør derfor være tilstrækkelig til at sikre en effektiv beskyttelse mod begge frøbårne patogener. Ved undersøgelser af direkte effekter af IK726 på plantevæksten, er der for doseringer fra 10¹ til 4 x 10⁴ cfu/frø ikke fundet signifikante effekter på hverken plantefremspiring eller plantetørvægt. Det er således muligt at øge doseringen af IK726 på frø væsentligt, eksempelvis i forbindelse med bekæmpelse af andre patogener, uden at influere negativt på planteetableringen.

Shelf-life og aktivitet af konidier lagret på frø

En kommercialisering af biologisk frøbejdsning vil være et mere realistisk alternativ til de kemiske midler, hvis frø bejdset med G. roseum kan lagres. Ved en specifik anvendelse af IK726 til bejdsning af korn vil lagertemperaturen under nordiske forhold typisk ligge på 15-20°C. I praksis lagres udsæd af vårbyg maksimalt i 8 måneder, mens lagerkravet til vinterhvede maksimalt er 3 måneder. IK726 har med optimeret formulering overlevet stabilt på bejdsede frø lagret ved 20°C i en testperiode på 6 måneder. I en testperiode på 7½ måned har bekæmpel-sen af Bipolaris sorokiniana også været høj og stabil for bejdsede frø lagret ved denne temperatur. På baggrund af de praktiske krav til opbevaring af bejdset korn synes der derfor at være gode muligheder for at anvende IK726 til bejdsning i kommerciel skala.

Markforsøg

Manglende effektivitet og stabilitet i sygdomsbekæmpelsen, når biologisk bekæmpelse overføres fra laboratoriet til naturlige vækstforhold er ofte et problem. Der er i projektperioden udført 6 markforsøg, der entydigt viser, at bejdsning af både byg og hvede med G. roseum (IK726) giver en signifikant bekæmpelse af F. culmorum. IK726 har udvist antagonisme overfor F. culmorum ved lave jordtemperaturer, der er typiske for korndyrkning under danske forhold. Således er der i forsøgene målt jordtemperaturer fra 6.2°C og op til 12°C i etableringsfasen. Væksthusforsøg har desuden vist, at IK726 også bekæmper F. culmorum effektivt i temperaturområdet 10°- 20°C. Markforsøgene har endvidere bekræftet, at lagrede formuleringer af IK726 bekæmper F. culmorum lige så effektivt som friskhøstede konidier af antagonisten. Ud fra stabilitets- og effektivitetskrav synes anvendelse af IK726 til biologisk bejdsning af korn at være et realistisk alternativ til kemisk bejdsning, specielt med henblik på bekæmpelse af F. culmorum.

IK726's potentiale overfor andre patogener.

Indledende forsøg har vist, at IK726 også kan bekæmpe andre plantepatogener. Screeningsundersøgelser vedrørende bekæmpelse af stinkbrand (Tilletia caries) i hvede har vist, at bejdsning med IK726 resulterer i en reduktion af procent brandaks i både mark- og væksthusforsøg. I klimakammerforsøg har bejdsning af roefrø med G. roseum (IK726) desuden resulteret i en signifikant reduktion af rodbrand forårsaget af jordbårent inokulum af Pythium ultimum. Undersøgelser vedrørende reisolering af G. roseum fra byg- og hvederødder indikerer endvidere, at IK726 er rhizosfære kompetent (kan koloniserer rodnettet fra frø). Det forstærker IK726´s potentiale til bekæmpelse af jordbårne patogener yderligere, idet rhizosfære kompetance anses for en væsentlig parameter for effektiv bekæmpelse af sådanne patogener via frøbejdsning.

Videnformidling

Via efteruddannelese af konsulenter og landbrugslærere indenfor jordbrugssektoren, har projektet bidraget med videnopbygning indenfor praktisk anvendelse af biologiske bekæmpelsesmidler. En sådan viden er helt afgørende for succesfuld implementering af biologisk bekæmpelse i land- og havebrug. Desuden er væsentlige dele af projektet præsenteret i forbindelse med undervisning på KVL og i internationalt forum ved flere lejligheder ligesom udvalgte resultater er publiceret i proceedings.

Videre udvikling af IK726 og firmainteresser

Væsentlige dele af projektet, der omhandler produktion og formulering af IK726, forventes at have partenterbar nyhedsværdi, hvilket øger mulighederne for en kommerciel udnyttelse af IK726 (jvf. konklusion). En række samarbejdsrelationer og projekter skal sikre den fremtidige udvikling af IK726. Der er således indgået en samarbejds-og optionsaftale med frøfirmaet Dæhnfeldt a/s vedrørende udvikling og anvendelse af IK726 til bejdsning af grøntsags- og blomsterfrø. Et 3- årigt projekt er påbegyndt i 1998 med det formål at udvikle biologisk bekæmpelse til praktisk anvendelse overfor udsædsbårne og jordbårne sygdomme, specielt i korn. Her vil IK726´s effekt overfor flere frøbårne sygdomme bl.a. blive testet i markforsøg. I forbindelse med ovennævnte projekt er der ydermere indledt et samarbejde med Cillus a/s vedrørende biologisk bejdsning af korn. Cillus a/s importerer, formulerer og eksporterer plantebeskyttelsesmidler (kemiske og biologiske) med hovedvægt på frøbejdsning af korn og græsser. Desuden afprøver Danisco Seed i øjeblikket IK726 til bejdsning af sukkerroefrø, og et mere formaliseret samarbejde forventes i løbet af 1998/99.

Konklusion

I projektet "Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frø" er der opnået resultater, der kraftigt understreger, at der er gode muligheder for at udnytte G. roseum (IK726) til kommerciel frøbejdsning mod frøbårne sygdomme i korn. IK726 kan således produceres billigt og reproducer-bart og formulerede præparater har stabilt shelf-life i op til 1 år efter lagring ved temperaturer op til 20°C. Bekæmpelseseffektiviteten af lagrede IK726 præparater har i væksthusforsøg været høj og reproducerbar. Endvidere har en serie markforsøg vist, at bejdsning med IK726 giver høj og stabil bekæmpelseeffektivitet under varierende miljøforhold. Endelig kan IK726 lagres på frø i mere end ½ år ved 20°C uden tab af bekæmpelseseffektivitet. En nyhedsundersøgelse foretaget af Plougmann, Vingtoft & Partners fastslår, at der er gode muligheder for patentbeskyttelse af væsentlige dele af den teknologi, der er udviklet i forbindelse med projektet. Derudover peger projektet frem mod nye anvendelsesområder for IK726.