Miljøstyrelsens 12. Mikrobiologiske Metodeafprøvning

Indholdsfortegnelse

1. Sammendrag
    Summary

2. Formål

3. Gennemførelse
3.1. Orientering af laboratorierne
3.2. Deltagende laboratorier
3.3. Analysemateriale
3.4. Analysemetode, analyseparameter og fremstilling af analysemateriale
3.5. Temperaturmåling
3.6. Kontrolanalyse

4. Resultater og konklusion
4.1. Aflevering af resultater og kontrol af indtastning
4.2. Vurdering af metodeforslaget

5. Referencer

6. Bilag
Bilag 1: Deltagende laboratorier
Bilag 2: Fremstilling af analysemateriale
Bilag 3: Beskrivelse af de anvendte bakterier
Bilag 4: Temperaturmåling
Bilag 5: Kontrolanalyse
Bilag 6: Resultater af 12. metodeafprøvning
Bilag 7: Laboratoriernes bemærkninger til metodeforslaget
 

1. Sammendrag

Materiale og metoder

I maj 1998 gennemførte Miljøstyrelsen 12. mikrobiologiske metodeafprøvning med deltagelse af 32 laboratorier. Formålet med metodeafprøvningen var en afprøvning og vurdering af metodeforslaget: "Vandundersøgelse. Bestemmelse af aerobt kimtal i varmt brugsvand". Analysematerialet bestod af 8 prøver (1-8), der var parvis identiske med undtagelse af prøverne 7 og 8. Alle prøver blev analyseret i henhold til metodeforslaget.

Resultater og konklusion

Enkelte punkter i metodeforslaget bør præciseres, inden det udsendes som Dansk standard.

1. Summary

Material and methods

In May 1998 The Danish Environmental Protection Agency accomplished the twelfth microbiological trial with participation of 32 laboratories. The aim of the trial was an evaluation of the draft standard: "Enumeration of aerobic microorganisms in hot domestic water". The material to be analysed consisted of 8 samples (1-8), which were identical in pairs, except sample 7 and 8. All samples were analysed for aerobic microorganisms according to the draft standard.

Results and conclusion

This draft needs a few amendments before publication by Danish Standard.

2. Formål

Vurdering af metodeforslag

Formålet med Miljøstyrelsens 12. mikrobiologiske metodeafprøvning var at afprøve og vurdere metodeforslaget: "Vandundersøgelse. Bestemmelse af aerobt kimtal i varmt brugsvand". Vurderingen blev udelukkende baseret på mikrobiologiske forhold, idet der ikke blev foretaget statistisk bearbejdning af laboratoriernes resultater.

3. Gennemførelse

3.1. Orientering af laboratorierne.1. Orientering af laboratorierne\l.

Dato for metodeafprøvning

I brev af 17.03.1998 orienterede Miljøstyrelsen om gennemførelsen af 12. mikrobiologiske metodeafprøvning på simulerede prøver i uge 20 i 1998.

Vejledning

Den 20.04.1998 fremsendte Referencelaboratoriet vejledning om udførelse af metodeafprøvningen, og der blev tillige tildelt kodenumre.

Modtagelse af analysemateriale

Analysematerialet til brug i metodeafprøvningen blev afsendt fra Referencelaboratoriet den 11.05.1998 som ekspres og rekommanderet for-sendelse til forventet modtagelse på samtlige deltagende laboratorier den 12.05.1998, hvor analysen skulle påbegyndes.

3.2. Deltagende laboratorier

Ad bilag 1

I metodeafprøvningen deltog 32 laboratorier, der fremgår af bilag 1.

3.3. Analysemateriale.3. Analysemateriale\l.

8 prøver

Analysematerialet bestod af 8 nedkølede prøver, som var indeholdt i plastrør og mærket 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8. Hver prøve bestod af ca. 8 ml.

3.4. Analysemetode, analyseparameter og fremstilling af analysemateriale

Ad bilag 2 og 3

Det udsendte materiale skulle analyseres for aerobe kim efter metodeforslaget: "Vandundersøgelse. Bestemmelse af aerobt kimtal i varmt brugsvand". Fremstilling af analysematerialet samt det tilstræbte bakterieindhold i de enkelte prøver ses af bilag 2, og beskrivelse af de anvendte bakterier fremgår af bilag 3.

3.5. Temperaturmåling.

Ad bilag 4

For at sikre stabiliteten af analysematerialet blev dette sendt nedkølet. Laboratorierne blev derfor anmodet om at foretage en temperaturmåling i det plastrør, der udelukkende indeholdt sterilt vand og var mærket med rød tape. Laboratoriernes målinger lå alle indenfor området 0-5°C ved åbning af forsendelsen, hvilket ses i bilag 4.

3.6. Kontrolanalyse.

Ad bilag 5

Til kontrolanalyse blev udtaget 10 rør pr. prøvepar og 5 rør af prøve 7. Aftapningen af kontrolmaterialet blev foretaget samtidig med aftapningen af analysematerialet til laboratorierne. Kontrolmaterialet blev opbevaret i 24 timer i samme type forsendelsessystem som analysematerialet til laboratorierne, hvorefter det blev analyseret i henhold til vejledningen og metodeforslaget. Kontrolanalyse blev således udført for samtlige prøvepar undtagen for prøve 8. Resultaterne, der blev afrundet til 2 betydende cifre, fremgår af bilag 5.

4. Resultater og konklusion

4.1. Aflevering af resultater og kontrol af indtastning.

Afleveringsdato

Laboratoriernes analyseresultater skulle være Referencelaboratoriet i hænde senest den 26.05.1998, hvorefter resultaterne blev indtastet.

Ad bilag 6

Den 15.06.1998 fremsendtes udskrift af resultaterne til laboratorierne. De af laboratorierne kontrollerede og godkendte data fremgår af bilag 6.

4.2. Vurdering af metodeforslaget.

4.2.1. Laboratoriernes bemærkninger til metodeforslaget.

Ad bilag 7

Sammendrag af laboratoriernes bemærkninger til metodeforslaget er rubriceret nedenfor og fremgår i sin helhed af bilag 7.

Apparatur

Et laboratorium gør opmærksom på, at der i punkt 6.1 foreskrives brug af et vandbad, der kan opretholde en temperatur på 46°C ± 1°C, mens der normalt foreskrives 45°C ± 1°C.

Natriumpyrovat

Der er uoverensstemmelse mellem metodeforslaget og de kommercielt tilgængelige substrater m.h.t. indholdet af natriumpyrovat (Sodium Pyrovate) i R₂A.

PH

Det er vanskeligt at opnå et slut-pH på 7,7± 0,2 i dyrkningssubstratet (R₂A), og det er uhensigtsmæssigt, at dyrkningssubstratets slut-pH ikke svarer til det slut-pH, der er angivet for de kommercielle substrater.

Kondensvand

Der foreslås, at der anvendes filterpapir i låget på petriskålene for at undgå evt. kondensdannelse ved høje inkubationstemperaturer.

Udtørring

På trods af indpakning af petriskålene i plastposer, udtørres agaren ofte ved inkubation ved høje temperaturer. Det foreslås derfor, at det i metodeforslaget angives, hvilken type/tykkelse af plastposer, der er egnet til indpakning af petriskålene.

Tælling, beregning

Der er tvivl om fortolkningen af skemaet i metodeforslagets punkt 8.1 vedrørende tælletal og resultatangivelse, og laboratorierne undrer sig over den angivne beregningsmåde i metodeforslaget. Der henvises til Miljøstyrelsens regler, der foreskriver beregning af det vægtede gennemsnit. Ydermere påpeges, at der er angivet taleksempler med to decimaler i eksemplet under punkt 8.1.

4.2.2. Referencelaboratoriets bemærkninger til metodeforslaget.

Natriumpyrovat

Efter opslag i flere kilder bl.a. "Standard Methods, 1992. For the Examination of Water and Wastewater", må det vurderes, at der er tale om en trykfejl i metodeforslagets opskrift på R₂A. Indholdet af natriumpyrovat i R₂A bør i metodeforslaget rettes til 0,3 g pr. liter.

PH

Det fremgår af laboratoriernes bemærkninger til metodeforslaget, at det er vanskeligt at opnå det ønskede slut-pH i dyrkningsubstratet. Det bør derfor i metodeforslaget præciseres, hvorledes dette opnås. Slut-pH i fortyndingsvæsken bør være angivet.

Kondensvand

Enkelte laboratorier anvender et sterilt filter/trækpapir i låget på petriskålene for at undgå kondensdannelse og hermed forebygge problemer med udflydende kolonier på overfladen af agaren. Det anbefales, at denne teknik angives i metodeforslaget, og at det anføres, at filterstykkerne skal have større diameter end låget.

Udtørring

Referencelaboratoriet har, ligesom flere andre laboratorier, i perioder haft problemer med udtørring af dyrkningssubstratet, især når der inkuberes ved 65°C. At dette problem kun forekommer af og til, kan måske skyldes, at der er variation af de anvendte plastposers type og tykkelse. Plastposerne bør være kraftige og af samme type som de plastposer, som sterile petriskåle er indpakket i. Det skal bemærkes, at det ved høje inkubationstemperaturer og lange inkubationstider bør anbefales at bruge mere agar (min. 30 ml) end sædvanligt til dybdeudsæd, hvilket bør fremgå af metodeforslaget.

Luftdannelse

Ved høje inkubationstemperaturer er der en tendens til luftdannelse (bobler) i R₂A, og disse luftdannelser kan være vanskelige at skelne fra kolonier p.g.a. lysbrydningen. Som angivet i metodeforslaget er det derfor vigtigt, at der for at afgøre, om der er tale om bakteriekolonier eller partikler/luftbobler, anvendes forstørrelse på 20-40x.

Udtørring, kondensvand

Laboratoriet, der har udarbejdet metodeforslaget, gør opmærksom på, at laboratoriet ikke har nævneværdige problemer med kondensvand, udtørring og luftbobler. Laboratoriet bruger ikke filterpapir i lågene på petriskålene under inkubationen, men petriskålene inkuberes indpakket i kraftige plastposer af samme type som dem, de sterile petriskåle er indpakket i. Petriskålene inkuberes med bunden i vejret i en "god" inkubator. Laboratoriet foreslår, at det måske bør anføres, at kondensdannelse og udtørring forværres af temperatursvingninger (pga. skabets termostat eller åbning af skabets døre under inkubationen).

Tælling, beregning

Flere laboratorier har anført, at beregning af det vægtede gennemsnit bør anvendes i stedet for den i metodeforslaget anførte beregningsmåde. Det vægtede gennemsnit anbefales i NMKL Rapport nr. 5, 1994, baseret på "Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods" (Marvin L. Speck, 2nd edition, 1984. Washington DC, American Public Health Association). I 3rd edition fra 1992 af APHA's "Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods" anbefales det simple gennemsnit, som er anvendt i metodeforslaget. Lidt firkantet sagt tilgodeser det vægtede gennemsnit den statistiske opfattelse, at der er relativt mindre tilfældig usikkerhed ved højere tælletal, mens det simple gennemsnit tilgodeser den praktiske opfattelse, at der kan være systematisk fejl ved høje tælletal. DS-udvalget har valgt at følge metodeforslaget dvs. at anvende det simple gennemsnit til beregning af kimtallet. Det forudsættes, at der som i andre sammenhænge kun indgår kimtal, som ikke kan afvises ved en chi²-test.

Resultater

Resultaterne for prøve 3 og 4, kimtal ved 44°C viser meget stor spredning, hvilket skyldes, at 44°C er i nærheden af den valgte bakteriestammes temperaturmaksimum for vækst.

Konklusion

Enkelte punkter i metodeforslaget bør præciseres, inden det udsendes som Dansk standard.

5. Referencer

5.1. Brandt, T., Christiansen S. og Lund, C. (Marts,1996).
Bestemmelse af aerobt kimtal i varmt brugsvand. Forslag til Dansk Standard. Fælleskommunal Levnedsmiddelkontrol Københavns Amt Vest.

5.2. Forslag til dansk standard. (udateret)
Vandundersøgelse. Bestemmelse af aerobt kimtal i varmt brugsvand.

5.3. Nordisk Metodikkommitté för Livsmedel (1994).
Handledning i kvalitetssäkring - för mikrobiologiska laboratorier -. Rapport nr 5. Andra upplagan.

5.4. American Public Health Association (1984).
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods" (Marvin L. Speck, 2nd edition, 1984. Washington DC, American Public Health Association).

5.5. American Public Health Association (1992).
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods" (Marvin L. Speck, 3rd edition, 1992. Washington DC, American Public Health Association).

5.6. Standard Methods (1992).
For the Examination of Water and Wastewater. 18th edition. pp 9-32 to 9-35.

5.7. Miljøstyrelsens Mikrobiologiske Referencelaboratorium. 20.04.1998.
Vejledning om udførelse af 12. Mikrobiologiske Metodeafprøvning.

5.8. Arbejdsrapport fra Miljøstyrelsen. Nr. 30. 1993.
Miljøstyrelsens 8. Mikrobiologiske metodeafprøvning.
 

6. Bilagsfortegnelse.

Bilag 1: Deltagende laboratorier
Bilag 2: Fremstilling af analysemateriale
Bilag 3: Beskrivelse af de anvendte bakterier
Bilag 4: Temperaturmåling
Bilag 5: Kontrolanalyse
Bilag 6: Resultater af 12. metodeafprøvning
Bilag 7: Laboratoriernes bemærkninger til metodeforslaget
 

Bilag 1
Deltagende laboratorier.

Alfred Jørgensen, Laboratorium A/S, 1809 Frederiksberg.
Det Kommunale Laboratorium, 6200 Aabenraa.
Fælleskommunal Levnedsmiddelkontrol, 2600 Glostrup.
Hygiejnisk Forvaltning, 9100 Aalborg.
Hygiejnelaboratoriet A/S, 6270 Tønder.
Højmarklaboratoriet A/S, 6940 Lem St.
LevnedsmiddelCenter-Vejle I/S, 7100 Vejle.
Levnedsmiddelkontrollen i København I/S, 1711 København V.
Levnedsmiddelkontrollen I/S, 2740 Skovlunde.
Levnedsmiddelkontrollen I/S, 3600 Frederikssund.
LKE Esbjerg, 6705 Esbjerg Ø.
Miljøcentret, 4700 Næstved.
MiljøConsult FYN A/S, 5700 Svendborg.
Miljø- og LevnedsmiddelCentret, 4300 Holbæk.
Miljø- og Levnedsmiddelcentret, 4200 Slagelse.
Miljø- og LevnedsmiddelCentret I/S, 8700 Horsens.
Miljø- og Levnedsmiddelcenter Sjælland Øst I/S, Tigervej 39.
Miljø- og Levnedsmiddelkontrollen, 7000 Fredericia.
Miljø- og Levnedsmiddelkontrollen, 3400 Hillerød.
Miljø- og Levnedsmiddelkontrollen, 4800 Nykøbing F.
Miljø- og Levnedsmiddelkontrollen, 6760 Ribe.
Miljø- og Levnedsmiddelkontrollen, 6800 Varde.
Miljø- og Levnedsmiddelkontrollen, 8800 Viborg.
MLK FYN I/S, 5220 Odense SØ.
MLK Randers, 8900 Randers.
MLK Thisted, 7700 Thisted.
MLK Vendsyssel Vest I/S, 9800 Hjørring.
MLK Vestjylland I/S, 7400 Herning.
MLK Østjylland I/S, 8200 Århus N.
Nordøstvendsyssels Levnedsmiddel- og Miljøkontrol, 9900 Frederikshavn.
R. Dons, Vandanalytisk laboratorium, 2850 Nærum.
Steins Laboratorium A/S, 6650 Brørup.
 

Bilag 2
Fremstilling af analysemateriale.

6 prøver var parvis identiske, således at prøve 1 = prøve 2, prøve 3 = prøve 4 og prøve 5 = prøve 6. Analysematerialet bestod desuden af 2 prøver (7 og 8), hvor prøve 8 bestod af sterilt vand.

De enkelte prøver indeholdt nedennævnte bakteriestammer og antal.

Prøvepar 1 og 2

Prøvepar 3 og 4

Prøvepar 5 og 6

Prøve 7

^*) tilsendt fra Fælleskommunal Levnedsmiddelkontrol, Glostrup.

Bilag 3
Beskrivelse af de anvendte bakterier.

( ): Angiver meget svag reaktion.
^*) tilsendt fra Fælleskommunal Levnedsmiddelkontrol, Glostrup.
 

Bilag 4
Temperaturmåling.

Labo-rato-riernes betegnelse.	Temperaturen i analyse-materialet ved laborato-riernes åbning af forsendelsen ved måling af temperaturen i transportmediet i plastrøret, mærket med rød tape.	Temperaturen i analyse-materialet ved laborato-riernes påbegyndelse af analyse af den sidste prøve ved måling af temperaturen i transportmediet i plastrøret, mærket med rød tape.
Lab. nr.	°C	°C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32	2,0 2,0 2,3 1,5 4,5 1,7 0,5 0,3 1,2 1,2 1 2,8 3,1 1,9 1,0 1,8 4,0 2,2 1,4 2 1,1 1,9 2,1 2,7 1,1 2,9 1,7 1,2 2,7 1,6 1,7 0,4	1,8 0,7 2,3 3,2 4,5 1,7 0,4 10,2 2,7 0,9 0,6 2,7 1,0 5,2 3,4 0,1 3,0 2,2 1,0 1,5 0,7 1,2 1,9 4,1 0,4 2,9 3,0 3,0 10,0 2,4 2,6 0,3

 

Bilag 5
Kontrolanalyse.

Prøvepar 1 og 2. Kim/ml ved 55°C

Rør nr.	Kim/ml	log (kim/ml)
1	80.000	4,9031
2	75.000	4,8751
3	77.000	4,8865
4	67.000	4,8261
5	66.000	4,8195
6	51.000	4,7076
7	60.000	4,7782
8	49.000	4,6902
9	70.000	4,8451
10	59.000	4,7709
m	65.000	4,8102
s		0,0728

Prøvepar 3 og 4. Kim/ml ved 37°C

Prøvepar 5 og 6. Kim/ml ved 55°C

Prøve 7. Kim/ml ved 55°C

Rør nr.	Kim/ml	log(kim/ml)
1	60	1,7782
2	68	1,8325
3	79	1,8976
4	64	1,8062
5	74	1,8692
m	69	1,8367
s		0,0478

 

Bilag 6
Resultater af 12. metodeafprøvning.

Kim/ml ved 37°C

IR: Ingen resultatangivelse

Kim/ml ved 44°C

IR: Ingen resultatangivelse

Kim/ml ved 55°C

IR: Ingen resultatangivelse

Kim/ml ved 65°C

IR: Ingen resultatangivelse
 

Bilag 7
Laboratoriernes bemærkninger til metodeforslaget.

Lab. nr. 2

Bemærk at det ikke er lykkedes at bestemme 44°C kimtallet i prøve 3 og prøve 4. Det er ikke tale om en simpel forbytning mellem 10⁰ og 10 ^-1 - pladerne, så resultaterne er noteret, som de foreligger.

Lab. nr. 3

Angivelse af kimtal:

1. Ingen synlige kolonier bør angives" <10 gange laveste fortyndings-faktor/ml".
2. Hvorfor gå tilbage til simpelt gennemsnit - vægtet gennemsnit som angivet af Miljøstyrelsen synes mere "retfærdigt".
3. I regneeksemplet angives antal talte kolonier med to decimaler.

Vi har anvendt petriskåle uden ribber indpakket i plastposer. Der var ikke problemer med udtørring.

Lab. nr. 4

Fortyndingsvæske: Pepton 1 g, NaCl 8,5 g
Demineraliseret vand 1000 ml. pH indstillet på 7,2 før auto.

Lab. nr. 6

1. Alle ca. tal er beregnet ud fra ¼ talt plade.
2. Alle plader v/65°C var delvis tørret ud, men det var stadig muligt af aflæse.

Alle plader har været pakket ind i 2-3 poser samt fået et sterilt filter i låget.

• pH blev indstillet til 7,7 ± 0,2 efter autoclavering, da den ikke passede.
• Alle resultater er beregnet ud fra tælletal mellem 10 og 250.

Der er på dette område ikke helt overensstemmelse mellem forskellige angivelser i metodeforslaget. En specificering under pkt. 8.1, 1. linie og pkt. 8.1, regneeksemplet er således ønskeligt.

Lab. nr. 7

Dyrkningssubstrat R2A-agar
pH i substratet, som har været anvendt, er målt til 7,2
Ved en misforståelse er substrat ikke blevet fremstillet med pH 7,7

Lab. nr. 8

Dyrkningssubstrat: pH ville efter flere forsøg ikke højere op end 7,47 efter autoklaveringen.

Lab. nr. 9

Dyrkningssubstrat: pH i det færdige substrat er målt til 7,33, trods indstilling af pH til 7,74 før autoklavering.

Beregning og angivelse af kimtal.
Der er talt på alle plader med kolonital fra 10 til 250.
Det er uklart i forskriften hvilke kimtal der skal tælles.

1. Der tælles på alle plader med kolonital op til 250.
2. Tælletal mellem 1 og 10: angives <10.

Kimtallet er udregnet "vægtet" i forhold til den udsåede mængde.
Laboratoriet har således ikke anvendt den beregningsmetode som er anvist i 7.1.

Lab. nr. 10

Laboranterne havde problemer ved fremstilling af substratet, idet de havde overset, at pH skulle indstilles til 7,7 ± 0,2.
Dette blev så gjort efter autoklavering og kan være den mulige årsag til forureningen af prøverne.
Denne fejl kan undgås ved at substratet har det rette pH fra fabrikantens side. Så vil usikkerheden mellem laboratorierne også blive mindre.

Et andet problem var udtørring af pladerne. Pladerne var indpakket i plastposer.
Der blev dagligt, nogle gange to gange dagligt, hældt vand i bunden af varmeskabene for at opretholde en vis fugtighed.
Da laboratoriet ikke har week-end vagter, blev dette ikke udført lørdag/søndag.

Lab. nr. 11

Dyrkningssubstrat: R2 agar blev indstillet på pH 7,80 før autoklavering.
pH efter autoklavering var 7,41.
Der hældes mindst 15 ml agar på skålene.

Lab. nr. 12

Pkt. 8.1 Beregning og angivelse af kimtal

A

Tekst "Tælletal"	- tolket som
Ingen synlige kolonier	Alle plader
Mellem 1 og 10	Sum af kolonier, alle plader
Mellem 10 og 250	Én plade

B
Det kan undre, at kimtal fra flere plader med tælletal 10-250 opgøres som det aritmetriske gennemsnit og ikke som det vægtede gennemsnit, som angivet i NMKL Rapport nr. 5, 1994.

Lab. nr. 13

Dyrkningssubstrat:

Forskelle:
Slut pH	= 7,2
Pepton	= 0,75 g/l
MgSO4	= 0,024 g/l
Trypton	= 0,25 g/l
Magnesium pyruvat	= 0,3 g/l

306 58977 indeholder ikke Casamino acids

Lab. nr. 14

Dyrkningssubstrat: R₂A pH 7,2 +/- 0,2
Temperaturen i 65°C termostat har været mellem 63 og 65°C. (altså 64,0 +/- 1°C).

Lab. nr. 16

Dyrkningssubtrat: Indhold af Natriumpyrovat = 0,3 g/1000 ml.

• Lidt problemer med kondensvand ved inkubering ved 65°C. Kan evt. afhjælpes ved at lægge sterilt trækpapir i låget?
• Ønskes pH = 7,7 i R₂A-agar, er det et stort ønske, at substratet findes kommercielt tilgængeligt med denne pH-værdi. Det har ved denne metodeafprøvning været vanskeligt at indstille til den ønskede pH-værdi.
• Dybdeudsæd, som foreslået i denne metode, er klart at foretrække fremfor overfladeudsæd, som angivet i tidligere forslag.

Lab. nr. 18

Dyrkningssubstrat:

• som angivet i 5.2, dog 0,3 g Sodium Pyruvat i stedet for 0,5 g

Fortyndingsvæske:
• som angivet i 5.1.1, dog + dinatriumhydrogenphosphat 0,3 g

Lab. nr. 19

Dyrkningssubstrat: Afvigelser på pH:
Anvendt pH: 7,15
Anbefalet pH: 7,7 ± 0,2
Sodium Pyrovate i anv.subst:. 0,3 g
Sodium Pyrovate i anb.subst. 0,5 g
Fortyndingsvæske:
Anvendt autoklavering: 115°C/15 min.
Anbefalet autoklavering: 121°C/15 min.

Lab. nr. 21

Dyrkningssubstrat: pH kun 7,33
Der konstateredes stærk udtørring af pladerne inkuberet ved 65 grader.
Pladerne var ikke helt indtørrede, og kolonierne var lette at tælle.

Pladerne var lagt i plastposer, der var foldet en gang - ikke klæbet til.
Der var ikke blæser i termostatskabet.

Lab. nr. 25

Fortyndingsvæske: pH = 7,0 ± 0,2 før autoklavering
Dyrkningssubstrat: pH 7,2 ± 0,2 efter autoklavering.
Bem. til punkt 5.1 pH i fortyndingsvæske efter autoklavering er ikke opgivet.
Bem. til punkt 6.1. Temperatur 46°C ± 1°C !
Alle øvrige laboratoriehenvisninger er 45°C ± 1°C.

Lab. nr. 26

Dyrkningssubstrat: Difco's R2A agar indeholder 0,3 g.
Natriumpyruvate pr. ltr. og ikke som anført i metoden (pkt. 5.2) 0,5 g/l.

De anvendte store plastposer til indpakning af pladerne under inkuberingen havde en tykkelse på 0,008 mm, hvilket ikke har været tilstrækkeligt til at undgå uønsket fordampning. Substratet på enkelte plader inkuberet ved 55°C var udtørret i let grad, mens både substrat og kolonier på flere plader inkuberet ved 65°C var udtørret i svær grad. Kolonierne kunne aflæses, men det vurderes, at en sådan udtørring kan påvirke resultatet.

Det bør i metoden være nævnt, at plastposerne skal have en tilstrækkelig tykkelse, f.eks. 0,07 mm som stomacherposer eller 0,02 mm som frostposer. Ved rekvirerede prøver til undersøgelse for Thermus bakterier (65°C/4 døgn), hvor kun få plader inkuberes, anvender vi stomacherposer uden problemer med udtørring.

Til opsamling af kondensvand anvender vi med god erfaring ved rekvirerede prøver filterpapir i låget på petriskålen, men som følge af udtørringen har dette princip ikke haft virkning ved metodeafprøvningen.

I de tilfælde, hvor der er anvendt 2 plader til beregning af resultatet, er kimtallet udregnet for hver plade, hvorefter der er taget et simpelt gennemsnit, jf. kap. 8.1 i metoden. Denne beregning virker imidlertid lidt paradoksal i en tid, hvor vi ved andre nye forskrifter bliver præget til at beregne kimtallet ved addition af kolonitallene og division med udsædsmængden, hvorved kolonitallet fra en højere fortynding tillægges mindre værdi. Følgende resultater, hvor den sidstnævnte beregningsmetode er anvendt, skal anføres:

• prøve 1, 44°C: 9300,
• prøve 4, 37°C: 1200,

Det er uhensigtsmæssigt, at der skal ændres på pH ved fremstillingen af R2A agar. Fabrikantens anvisning er 7,2 +/- og metoden anfører 7,7 +/- 0,2.

Lab. nr. 27

Dyrkningssubstrat: Der er 0,2 g Sodium Pyrovat mindre end forskriften anbefaler.
Der sker en stor fordampning ved 65°C, selv om skålene inkuberes i plastposer.

Lab. nr. 28

Dyrkningssubstrat:
Substratet indeholder: Tryptone 0,25 g + pepton 0,75 g istedet for :
Proteose pepton3 - 0,5 g + Casamino Acid 0,5 g
Natrium pyruvat: 0,3 g i stedet for: 0,5 g
Magnesiumsulfat: 0,024 g i stedet for: 0,05 g

Lab. nr. 29

Dyrkningssubstrat: Substrat lånt af MLK, Odense.

Lab. nr. 31

Pladerne kunne nemt tælles op til 300 kolonier. Det er nemmere at tælle på dybdeudsæd end på overfladeudsæd.

Lab. nr. 32

Dyrkningssubstrat: Slut pH ved 25°: 7,63.
Fortyndingsrække: Der er anvendt ionbyttet H₂O med ledningsevne <1 mS/cm