Påvisning af virus i vand og toskallede bløddyr

BILAG 11

Detektion af hepatitis A virus i miljøprøver ved antigen capture RT-PCR (46)

I dette studie beskrives en antigen capture RT-PCR metode til detektion af hepatitis A virus i miljøprøver og toskallede bløddyr. Der er her fokuseret på antigen capture RT-PCR på toskallede bløddyr.

Processing:

Østers og muslinger blev tilsat virus, afskallet og hakket. Der blev tilsat kold 0,09 M Glycin i 0,01 NaOH buffer (pH 8,8) og blandet i 1-2 min.. Cat-Floc blev tilsat. Efter blanding inkuberedes i 15 min. ved 4⁰ C. Der blev filtreret gennem Whatmanpapir efterfulgt af filtrering gennem 0,2 µm filter. Filtratet var da klar til analyse ved plaque assay ( infektiøse virus, PFU, i cellekultur) og antigen capture RT-PCR . Ved plaque assay var det nødvendigt at benytte en hurtigt voksende cytolytisk hepatitis A virus variant, da vildtype hepatitis A virus vokser meget langsomt eller slet ikke i cellekulturer.

Antigen-capture:

Sterile 0,5 ml polypropylen mikrocentrifugerør blev coated med anti-hepatitis A virus IgG ved inkubering i 4 timer ved 37 ⁰ C. Ikke-bundet IgG blev fjernet og 1 % bovinserum tilsat. Efter inkubering 1 time ved 37 ⁰ C vaskes 3x med PBS indeholdende Tween. Skaldyrsfiltratet blev tilsat, og der blev inkuberet natten over ved 40 ⁰ C, efterfulgt af vask 6 x i buffer bestående af 20 mM Tris (pH 8,4) + 7,5 mM KCl + 2,5 mM MgCl ₂.

Primere:

Der blev benyttet to primere, der flankerer et meget konserveret område kodende for carboxyl- enden af kapsidprotein VP3 og amino-enden af protein VP1.

Reverse transkriptase:

48 µl reaktionsblanding indeholdende PCR-buffer II, 4 mM MgCl _2, deoxyribonukleotider (dNTP) i en koncentration på 0,4 mM og 1,2 µM hepatitis A virus-primer 2. Efter denaturering i 5 min. ved 95 ⁰ C blev der afkølet på is. 1 µl RNase inhibitor (20 U/µl) og 1 µl Moloney murin leukæmivirus revers transkriptase (50 U/µl) blev tilsat. Der blev inkuberet i 30 min. ved 42⁰ C, 5 min. ved 99⁰ C og 5 min. ved 5⁰ C. Produktet er første streng cDNA.

PCR:

Til ovenstående reaktion tilsættes 50 µl af en PCR-blanding bestående af 1x PCR-buffer II, 1,2 µM HAV-primer 1 og 2,5 U Taq DNA-polymerase. Efter opvarmning til 95⁰ C i 2 min. fulgte 35 PCR- cykler af denaturering ved 95⁰ C i 1 min., annealing og extension ved 60⁰ C i 1 min. Afslutningsvis var der 7 min. extension ved 60⁰ C. Dernæst analyseres PCR-produktet (247 basepar) på agarosegel.

Resultater:

Ud fra sensitivitetsstudier på spildevandsprøver fandtes, at antigen capture RT-PCR metodes detektionsgrænse var på 0,053 PFU for en hepatitis A virusstamme (HM175/18f en hurtigt voksende cytolytisk variant), hvorimod detektionsgrænsen ved plaque assay var 1 PFU pr. 0,5 ml podestof (inoculum). Sensitiviteten er altså ca. 20 gange større for antigen capture RT-PCR end for plaque assay. For at estimere hvad en PFU svarede til i viruspartikler, lavede de cDNA-RNA hybridisering og målte optisk densitet (OD). Viruspartikel/PFU ratio fastslås til 79:1. Ud fra dette ræsoneredes, at detektionsgrænsen var på 4 viruspartikler ved antigen capture RT-PCR. Sensitiviteten af antigen capture RT-PCR var af samme størrelsesorden som konventionel RT-PCR.

Forsøg på detektion af virus i toskallede bløddyr ved antigen capture RT-PCR viste sig at være lige så sensitiv som plaque assay forsøg på toskallede bløddyr, når der, vel at mærke, blev anvendt en laboratoriestamme af virus, der gror i cellekultur.

Konklusion:

Sensitiviteten af antigen capture RT-PCR var af samme størrelsesorden som konventionel RT-PCR, men en egentlig detektionsgrænse blev ikke beskrevet i dette studie.