Alternativer til dyreforsøg for øjenirritation. 

I Draize testen bliver det kliniske respons i cornea (hornhinden), conjunctiva (øjets bindehinder) og iris (regnbuehinden) observeret indtil øjnene igen er normale eller op til 21 dage. Den lange observationsperiode medfører, at det kan bestemmes om teststoffer kan give permanente øjenskader. Dette forhold er kritisk i klassificeringen af øjenirriterende stoffer. I EU anvendes de gennemsnitlige scoringsværdier fra Draize testen for observationer foretaget 24, 48 og 72 timer efter doseringen med teststof som grundlag for klassificering af stoffer med R36 (irriterer øjnene) eller R41 (risiko for alvorlig øjenskade). Varigheden af øjenirriterende effekter indgår i bedømmelsen, således at tilstedeværelse af respons i øjets væv ved 72 timers observationen eller vedvarende farvning af øjet udløser R41 klassifikationen (EU, 1996). Varigheden af øjenirriterende effekter indgår også i klassificeringen af øjenirriterende stoffer i USA, hvor tilstedeværelse af effekter på øjets væv i mere end 7 eller 21 dage tildeles afgørende vægt (Gupta et al., 1993).

Stort set alle in vitro systemer for øjenirriterende effekter har hidtil kun været designet til at bedømme den akutte effekt af teststoffer, og tidligere har det ikke været muligt at demonstrere en overensstemmelse mellem effekten af teststoffer over tid i in vitro systemer og resultater fra øjenirritationsforsøg. Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi har som led i projektet udviklet en model til vurdering af bedring (recovery) fra øjenirritation ved brug af SKIN² ZK1200 væv (Espersen et al., 1997). Der blev testet 9 materialer med in vivo data fra ECETOCs øjenirritations databank (ECETOC, 1998) (se tabel 4.1).

4.1 Metode

Forsøgene blev udført med SKIN² ZK1200 væv. Recovery forsøgene blev udført før identiteten af COLIPA undersøgelsens teststoffer var kendt. For alle teststoffer blev der derfor udført et indledende forsøg for at etablere omtrentlige eksponeringstider for nedsættelse af cellernes viabilitet med 35-65%. Vævene blev i 1 til 3 replika påført en fast dosis på 25 ml af hvert teststof, og viabiliteten blev bestemt med MTT testen. I hovedforsøget blev triplika af væv påført 25 ml af hvert test-stof, og de eksponeringstider, der blev fastlagt i forforsøget, blev anvendt (se tabel 4.1).

Både udoserede og doserede væv blev MTT testet umiddelbart efter eksponeringen og efter inkubationsperioder, der svarede til Draize testens observationstider. Tiden for recovery af in vitro responset blev defineret som antallet af inkubationsdage, der var nødvendige for at opnå MTT test værdier i de eksponerede væv, som ikke var signifikant forskellige fra de tilsvarende kontrolvæv.

Udoserede væv og væv, der blev eksponeret for 1% benzalkoniumklorid, 3% natriumlaurylsulfat og 5% Triton X-100, blev undersøgt histologisk. Vævene blev fikseret i formalin, indstøbt i paraffin, snittet og farvet med haematoxylin og eosin. Vævene blev derefter undersøgt for antal af tilstedeværende lag af epithelceller og for dermal/epidermal degeneration og nekrose.

Tabel 4.1

*: Gennemsnit af 2 Draize tests.

Der blev anvendt en ensidig variansanalyse til at sammenligne resultaterne af MTT målingerne. Analyser af lineær korrelation blev brugt til sammenligning af in vitro og in vivo recovery data.

4.2 Resultater

MTT aktiviteten af ueksponerede SKIN² ZK1200 væv i kultur var relativt stabil i op til 14 dage, men efter 21 dage sås et markant fald i vævenes viabilitet. Mildt irriterende stoffer som 100% glycerol og 0.1% cetylpyrimidinbromid inducerede ikke signifikante fald i vævenes cellulære viabilitet efter 60 minutters eksponering, men signifikante fald i MTT aktiviteterne blev observeret efter 2 til 3 dage i kultur. Væv, der blev eksponeret for 3% natriumlaurylsulfat og 5% Triton X-100, opnåede MTT aktiviter på kontrolniveauet efter 1 dag, mens væv eksponeret for 1% natriumhydroxid, 100% isopropanol og 100% methylacetat opnåede kontrol MTT værdier indenfor 7 dage. Væv, der blev eksponeret for forskellige koncentrationer af benzalkoniumklorid, vendte dog ikke tilbage til kontrolniveauets viabilitet på en stabil måde. MTT aktiviteten af væv, der blev påført 1% benzalkoniumklorid i 5 sekunder var upåvirket efter 1 dag, men signifikant lavere MTT værdier blev opnået på dag 3, 7, 10 og 14. Væv, der blev eksponeret for den samme opløsning af stoffet i 10 sekunder opnåede ikke kontrol MTT niveauet gennem en 7 dage lang observationsperiode, og væv eksponeret for 10% benzalkoniumklorid i 1 sekund opnåede ikke fuld viabilitet efter 21 dage

Antallet af inkubationsdage, der var nødvendige for at opnå en fuld viabilitet in vitro og Draize MMAS værdier for teststofferne er vist i tabel 4.1 sammen med gennemsnit og medianværdier af antallet af dage, der skulle til før responset i Draize testene forsvandt. Gode lineære korrelationer blev fundet mellem dage for recovery in vitro og dage for recovery in vivo ved brug af gennemsnitsværdier (r = 0.92, p < 0.001) og medianværdier (r = 0.91, p < 0.001).

Resultaterne af den histologiske analyse er vist i tabel 4.2. Der fandtes moderat til stærk degeneration af epithelceller og stromaceller i alle eksponerede væv efter 7 dage i kultur, og en speciel stærk reaktion fandtes i væv påført 1% benzalkoniumklorid. Der blev ikke observeret konsistent cellulær regeneration i vævene. I kontrolvævene sås en svagere cellulær degeneration på dag 7 og 10.

Histologisk analyse af antallet af lag af epithelceller og af cellulær degeneration og nekrose i SKIN² ZK1200 væv.

Histomorfologisk analyse af kontrol og eksponerede SKIN² ZK1200 væv. Dermal/epidermal degeneration/nekrose: (+) spor, + mild, ++ moderat, +++ stærk, ++++ meget stærk. n.d.: ikke analyseret.

4.3 Diskussion

Ved de histologiske analyser fandtes ingen konsistente cellulære ændringer i vævet før dag 7 efter doseringen, og dette tyder på at måling af MTT aktiviteten i vævene er en mere sensitiv markør for vævenes viabilitet end de histologiske resultater. Dette er i overensstemmelse med resultater af histologiske analyser og målinger af MTT reduktion i organkulturer med isoleret hud (van de Sandt & Rutten, 1995).

SKIN² ZK1200 modellen må på baggrund af de opnåede resultater anses for at have et godt potentiale for forudsigelse af vedvarende øjenirritation. Vævets viabilitet var stabil i 2 uger, og modellen kunne anvendes til at påvises en øget toksicitet af forskellige koncentrationer af benzalkoniumklorid gennem obser-vationsperioden, der er parallel med stoffets in vivo effekter i hornhinden. Desuden fandtes der gode korrelationer mellem in vitro og in vivo recovery data. Dette er ikke tidligere opnået med andre alternative tests (Espersen et al., 1997).