Alternativer til dyreforsøg for øjenirritation. 

6. Evaluering af alternativer til øjenirritationstesten

På baggrund af de opnåede resultater af EU/Home Office studiet er det blevet vurderet, at alternative metoder til erstatning af Draize testen for øjenirritation først vil kunne etableres efter år 2005 (Purchase, 1997). Endvidere blev resultaterne af både EU/Home Office studiet og COLIPA studiet karakteriseret som skuffende i EU Kommissionens rapporter om alternativer til erstatning af dyreforsøg til testning af kosmetik (EU Kommissionen, 1995 og 1996b). På dette grundlag er forbudet mod dyreforsøg til kosmetiske produkter i EU’s kosmetikdirektiv blevet udskudt til januar, 2000.

Der er dog fornyligt opnået enighed om mere optimistiske synspunkter vedrørende alternativer til øjenirritationsforsøg på workshops arrangeret af COLIPA (Bruner et al., 1998) og EU kommissionens center for validering af alternative metoder (ECVAM)(Balls et al., 1999). På begge workshops blev det understreget, at det er væsentligt at forstå de biologiske mekanismer bag øjenirritation, når in vitro forudsigelsen af in vivo reponset skal forbedres og følgende forskningsområder er foreslået:

• bedre karakterisering af skader på øjets væv, omfattende udvikling af tidlige markører for øjenskade,
• øget forståelse for effekter af kemiske stoffer på tårefilmen, og af konsekvenser af beskadigelse af tårefilmen,
• karakterisering af akut og medium/kronisk øjenbetændelse,
• validering af areal og dybde af hornhindeskader som markører for øjenskade,
• udvikling af metoder til bedømmelse af sårheling, smerter og kinetik i øjets respons, og
• udvikling af metoder til bedømmelse af persistens og reversibilitet af øjeneffekter.

På COLIPA workshoppen var der enighed om, at Draize testens evne til akkurat påvisning af øjenskade for mennesker er begrænset, og at testen har begrænset værdi som basis for udvikling af alternativer. Behovet for anvendelse af data om det humane øjenirritations respons blev derfor understreget. Det blev anbefalet at identificere et reference sæt på 10-20 modelstoffer, om muligt udvalgt på basis af humane øjenirritationsdata, til brug ved udvikling af mekanismebaserede in vitro tests. Det blev tillige anbefalet, at revurdere de tilgængelige in vitro tests på basis af bedre in vivo data, og at udvikle og forfine mekanismebaserede in vitro metoder til øjenirritationstesting. De mest relevante tilgængelige in vitro metoder blev identificeret som:

• cytotoksicitets assays (inklusive flerlagede vævsmodeller),
• assays for ændringer i epithelfunktioner (fluorescein lækage testen),
• organotypiske tests, som BCOP testen og tests med isolerede øjne fra kyllinger eller kaniner,
• CAM tests som modeller for primære skader på øjets bindehinder, og
• langtidsmodeller for hornhinden (f. eks. hornhinder i kultur).

En ny strategi for validering af in vitro tests for øjenirritation baseret på brug af reference standarder (postive kontrolstoffer) blev foreslået på ECVAM workshoppen. ECVAM planlægger videre validering af en test med isolerede kyllingeøjne, BCOP testen, kombineret anvendelse af HET-CAM testen og neutralrødtoptagelsestesten , samt EpiOcular^TM vævsmodellen. Tillige blev det anbefalet at sammenligne resultaterne fra EU/Home Office og COLIPA studierne med øjenirritationsklassifikationer, og at evaluere potentialet af teststrategier (kombinationer af in vitro tests) til at forudsige øjenirritation.

Muligheder for fremskridt med hensyn til erstatning af øjenirritationstests

Idag er der opnået en meget stor mængde information vedrørende forskellige alternativer til øjenirritationstestning. Forskellige vævsmodeller med direkte påføring af teststoffer har vist sig at være meget gode til at forudsige et bredt spektrum af Draize test MMAS værdier, og modellerne har indtil videre kunnet bruges til test af alle typer af ingredienser og færdige produkter. Foreløbige resultater peger endvidere på, at vævsmodeller vil kunne bruges til forudsigelse af øjenskaders reversibilitet. Anvendeligheden af kulturer af celler, der dyrkes i monolag og doseres med teststoffer opløst i kulturmediet, er begrænset til test af vandopløselige stoffer. Med denne type tests er der generelt fundet gode overensstemmelser til øjenirritationsdata for tensider. Resultater fra forskellige metoder med isolerede øjne eller hornhinder har i flere undersøgelser vist sig at give gode overensstemmelser til øjenirritationsdata eller -klassificering. HET-CAM testens anvendelse er begrænset til identifikation af visse stærkt irriterende stoffer, men testen er i flere tilfælde vist at være mindre reproducerbar end dyreforsøgene. EYTEX testen er tillige vist at være uegnet til generel forudsigelse af øjenirritation i flere undersøgelser.

De fleste alternative metoder til øjenirritationstestning er dog vist at være betydeligt mere reproducerbare end in vivo øjenirritationstests. På denne baggrund bør der lægges betydeligt mere vægt på vurdering af de alternative metoders evne til at forudsige in vivo responset end på evalueringer af metodernes reproducerbarhed. Test af en mindre gruppe af stoffer og produkter udgør en tilstrækkelig basis for vurdering af metodernes reproducerbarhed i de enkelte laboratorier og mellem laboratorier. Rigide krav til valideringen af in vitro metoder kan både medføre, at egnede alternativer bliver overset og at uegnede tests bliver accepterede.

På øjenirritationsområdet har evalueringen af de opnåede informationer om alternative tests været betydeligt mere kompliceret end forventet. En ny, uafhængig revurdering af de eksisterende data på line med IRAG evalueringen i 1997 vil formentlig være meget værdifuld. Det er afgørende, at der etableres gode forudsigelsesmodeller før valideringsstudier påbegyndes, hvis der skal opnås anvendelige forudsigelser af in vivo responset. For de fleste alternative til bedømmelse af øjenirritation vil der kunne etableres bedre forudsigelses-modeller ved brug af avancerede regressionsanalyser af relationerne mellem historiske in vitro og in vivo data.

Forbuddet mod dyreforsøg til kosmetiktestning i EU’s kosmetik direktiv er blevet betragtet som en drivkraft for udvikling og validering af alternative tests. Denne hensigtserklæring udgør dog også en væsentlig hindring for accepten af alternativer: Et EU forbud mod produkter, der har været testet i bestemte dyreforsøg kan udløse betydelige hindringer for handelen med kosmetik mellem EU’s medlemsstater og andre lande. Det specifikke forbud mod dyreforsøg med kosmetiske produkter og deres indholdsstoffer forekommer endvidere at være overflødigt, da egnede alternative metoder skal bruges i stedet for dyreforsøg i henhold til EU’s direktiv om dyreforsøg. Et effektivt skridt på vejen mod forbedrede muligheder for at opnå en generel accept af alternativer til dyreforsøg til vurdering af sikkerheden af kosmetiske produkter vil formentlig være at fjerne hensigtserklæringen om forbud mod dyreforsøg ved en kommende revision af EU’s kosmetikdirektiv.