a Det er sandsynligt, at der vil kunne benyttes større prøvemængder, men det er ikke verificeret.
^b Afhængig af det brugte instrument, da flere versioner forefindes.
^c De brugte forkortelser er: pen = pentan, cyc = cyclohexan og ace = acetone.

4 Interferenser

Da mange PAH-forbindelser har identisk molekylevægt og struktur samt fysisk-kemiske egenskaber, der ligner hinanden meget, er det vanskeligt fuldstændig at undgå interferens i bestemmelsen af PAH (Bjørseth et al., 1985). Det er derfor af stor vigtighed, at laboratoriet ved GC-MS-bestemmelsen benytter optimale kromatografiske betingelser for at opnå størst mulig separation mellem muligt interfererende forbindelser (Hyver et al., 1989).

Da forskellige kromatografiske kolonner har forskellig separation af individuelle PAH-forbindelser, og da separationen desuden er stærkt afhængig af det brugte temperaturprogram, er det op til det enkelte laboratorium at sikre mindst mulig interferens i bestemmelserne. I de tilfælde, hvor interferens ikke kan undgås, bør der angives en sum af de individuelle forbindelser samt klart angives, hvilke forbindelser det drejer sig om. De bedst kendte interferenser på normale GC-kolonner er chrysen og triphenylen samt benzo(b)fluoranthen, benzo(j)fluoranthen og benzo(k)fluoranthen (Bjørseth et al., 1985). Disse forbindelser angives normalt som en sum af benzo(b+j+k)fluorenthen og chrysen/triphenylen.

5 Princip

En jordprøve ekstraheres ved hjælp af en af fire alternative ekstraktionsmetoder: Traditionel rystemetode ved brug af en blanding af pentan:acetone, Soxtec, Accelerated Solvent Extraction (ASE) eller Mikrobølgeekstraktion (MAE). Den traditionelle rystemetode betragtes som hovedmetoden, da den ikke forudsætter specielt udstyr, mens de tre moderne metoder kan benyttes som ligeværdige alternativer.

En homogeniseret jordprøve opslemmes i vand, og der tilsættes en blanding af pentan:acetone (1:1), hvorefter prøven kort gives ultralyd og ekstraheres på rystebord. Ekstraktet centrifugeres, dekanteres og tørres efterfulgt af inddampning til passende volumen.

Ekstraktet analyseres ved GC-MS SIM (single ion monitoring). Indholdet beregnes ud fra responset af den specificerede primære ion, og resultatet korrigeres med genfindelsen af de tilsatte surrogatstandarder. Identiteten kontrolleres ved det relative respons af den specificerede sekundære ion.

6 Reagenser og standarder

6.1 Generelt

Alle brugte reagenser skal være af analytisk renhedsgrad og velegnede til formålet. Renheden af reagenser og opløsninger kontrolleres ved analyse af reagens- og procedure blind i hver analyseserie.

6.2 Kemikalier

6.3 Stamopløsninger

Fremstil stamopløsninger ved afvejning af omkring 0,0100 g rent stof (6.2.7). Opløs stoffet i acetone eller cyclohexan (6.2.2) og fortynd til 10 mL i en målekolbe (1000 mg/L). Hvis renheden af stoffet er 96% eller større, kan den afvejede mængde bruges uden korrektion til beregning af koncentrationen i stamopløsningen. Kommercielt tilgængelige stamopløsninger kan bruges, hvis de er certificerede af leverandøren eller en uafhængig kilde.

Overfør stamopløsningerne til glasflasker med PTFE-forede skruelåg eller til glasampuller, der lukkes. Opbevares i mørke ved –18°C, eller som leverandøren anbefaler.

Stamopløsninger er normalt holdbare 1 år (afhængig af laboratoriernes kvalitetskrav). Hvis kontrolanalyser i henhold til laboratoriernes interne kvalitetskontrol indikerer et problem, skal stamopløsningerne erstattes tidligere.

6.4 Kalibreringsstandarder

Autentiske PAH-standarder for de 16 (18) EPA PAH eller de 7 jordkvalitet PAH (se afsnit 3 og 6.2.7) sammenblandes og fortyndes til fem eller seks kalibreringsopløsninger i intervallet 0,05 til 10 mg/L. Det er vigtigt at benytte det samme solvent, som ekstraktionen ender op i, for at undgå diskriminering i GC-injektionen.

6.5 Surrogatstandarder

Surrogatstandarder, fortrinsvis i acetone eller et andet letflygtigt og polært solvent, sættes til prøver inkl. kontrol- og blindprøver inden ekstraktion, svarende til en koncentration i prøven på 0,5 - 1 mg/kg (5-10 µg pr. surrogat PAH til 10 g prøve). Tilsætningen foretages minimum 10 min. inden ekstraktionen for at lade opløsningsmidlet fordampe og surrogatstandarderne absorberes i prøven.

Surrogatstandarden skal indeholde følgende forbindelser:

6.6 Sprøjtestandarder

Tilsætningen af sprøjtestandard er frivillig i denne metode, men anbefales for at kunne skelne mellem problemer ved ekstraktion og GC-MS-bestemmelse (Means, 1998).

Anthracen-d₁₀ opløst i acetone eller cyclohexan afhængig af ekstraktionssolvent sættes til ekstrakter og standarder til en slutkoncentration i ekstraktet på 3 mg/L, f. eks. 50 µL af en opløsning på ca. 60 mg/L til 1,00 mL ekstrakt.

6.7 Kontrolanalyser

6.7.1 Blindprøver

Der skal analyseres mindst to blindprøver i forbindelse med hver analyseserie. Blindprøverne skal indeholde samtlige elementer af analysen startende med punkt 8.4

6.7.2 Kontrolprøver

I hver analyseserie skal medanalyseres to kontrolprøver bestående af det af Miljøstyrelsen krævede referencemateriale til beregning af nøjagtighed samt s_W og s_B. Desuden laves et kontrolforsøg ved tilsætning af PAH til en ren jordprøve på et niveau mindre end 10 gange detektionsgrænsen for at bestemme genfindingen. Endvidere skal der udføres en dobbeltbestemmelse på en af prøverne til beregning af CV_W på naturlige prøver i henhold til Miljøstyrelsens krav i NOVA 2003 moniteringsprogrammet.

7 Apparatur

7.1 GC-MS, gaskromatografi med massespektrometrisk detektion

Et gaskromatografisk system med temperaturstyring, kapillarkolonne og splitless injektion (pulsed splitless injektor samt trykstyring af bæregassen anbefales for bedre reproducerbarhed). On-column injektion ved hjælp af en deaktiveret forkolonne kan også benyttes, blot det sikres, at ekstrakterne har tilstrækkelig renhed, og de kromatografiske betingelser er tilpasset denne injektionsteknik.

Et massespektrometer med mulighed for SIM (single ion monitoring) og tilkoblet datasystem, der tillader dataopsamling og lagring af alle data, der optages i det kromatografiske forløb. Massespektrometre, der fungerer efter ion-trap-princippet, kan også benyttes, såfremt tilstrækkelig følsomhed og specificitet kan dokumenteres. Datasystemet skal kunne søge datafilerne for ioner med specifikke masser og skal kunne udskrive ionresponset i forhold til tiden eller scan-nummer. Datasystemet skal kunne integrere såvel som re-integrere signalet for ethvert ekstraheret ion.

Kapillarkolonne med 5% phenyl methyl silicone eller tilsvarende apolær fase samt høj temperaturstabilitet og lav blødning anbefales for at sikre tilstrækkelig stort signal/støj forhold. Kolonnekrav er minimum 25 – 30 m længde og maksimum 0,25 mm indre diameter med en fasetykkelse på 0,1 – 0,25 µm.

7.2 Rysteapparat

Til ekstraktion af prøver i ekstraktionsglas. Ekstraktionsglassene skal kunne fastspændes i liggende position, og der skal kunne ekstraheres i langsgående retning. Minimum 250 ryst pr. minut.

7.3 Soxtec-ekstraktor

Sammenkoblet, automatiseret eller manuel, Soxhlet-instrument med lavt solventforbrug. I det indledende ekstraktionstrin er prøven nedsænket i det kogende solvent for at sikre effektiv kontakt mellem prøven og solventet, hvilket sikrer hurtig ekstraktion af de organiske forbindelser. Herefter løftes prøvehylstret op af solventet og skylles ved reflux som ved Soxhlet. I det tredie trin begyndes inddampning af solventet automatisk for at reducere volumen. Der er to principielle forskelle fra traditionel Soxhlet: Prøven er nedsænket i det kogende solvent og begyndende inddampning, som sker i forbindelse med ekstraktionen. Herved nedsættes analysetiden til ca. 2 timer, og solventforbruget sænkes.

7.4 Accelerated Solvent Extractor

Accelerated Solvent Extractor med 11 mL ekstraktionsceller af rustfrit stål eller andet materiale, der kan modstå de krævede tryk på ca. 2000 psi. Ekstraktionsceller af andre størrelser kan også benyttes, blot det sikres, at cellen fyldes helt enten med prøvemateriale eller med et inert materiale, som begrænser dødvolumen. Andre tilsvarende systemer, som kan demonstrere den nødvendige ydeevne for ekstraktion af PAH i jord, vil principelt også kunne anvendes (Schantz et al., 1997; Heemken et al., 1997; (Fisher et al., 1997).

7.5 Mikrobølgeekstraktor

En mikrobølgeovn med lukkede ekstraktionsceller, der har kemiske, resistente overflader, og som er gennemtrængelige for mikrobølger, så solventet kan absorbere mikrobølge-energien. Mikrobølgeovnen skal være forsynet med en temperaturstyring, så temperaturen i ekstraktionscellerne kan kontrolleres. Ekstraktionen foregår under forhøjet temperatur og tryk. Andre tilsvarende systemer, som kan demonstrere den nødvendige ydeevne for ekstraktion af PAH i jord, vil også kunne anvendes. Der har således været demonstreret gode ekstraktionsevner for instrumenter, der benytter såkaldt fokuserede mikrobølger i åbne systemer med brug af en refluxkondenser (Dupeyron et al., 1999; Letellier et al., 1999). Dette instrument vil også kunne bruges, såfremt ekstraktionseffektiviteten demonstreres.

7.6 Ekstraktionsglas

Det i metoden anvendte glasudstyr skal være renset efter laboratoriets interne regler fulgt af glødning ved 450ºC i minimum 16 timer. Til rystemetoden skal anvendes 500 mL red cap-flasker (eller tilsvarende glasflasker med teflonforet låg).

8 Fremgangsmåde

8.1 Prøveudtagning

Prøveudtagning foretages i henhold til Vejledning fra Miljøstyrelsen: Prøvetagning og analyse af jord nr. 13, 1998.

8.2 Opbevaring af prøver

Jordprøver opbevares i en lufttæt beholder i køleskab ved 4° C i mørke, indtil igangsættelse af analysen. Ved længere tids opbevaring af prøver (over en uge) er det ofte en fordel at fryse disse ned ved – 20° C for at undgå mikrobiel aktivitet.

8.3 Forbehandling

Jordprøver findeles og lufttørres i stinkskab i ca. 18 – 24 timer. Herefter homogeniseres prøverne grundigt og sigtes gennem en 2 mm si for at fjerne træstykker, sten og andet prøven uvedkommende materiale. Opmærksomheden rettes dog på det forhold, at indhold af klumper af tjære i prøven må definere denne som værende forurenet. I tvivlstilfælde homogeniseres tjæreklumperne sammen med jordprøven.

Ved den ovenfor omtalte lufttørring burde restvandindholdet i prøven ligge på omkring 10%. Hvis tørstofbestemmelsen indikerer, at jorden stadig indeholder signifikant større mængder vand, lufttørres prøven yderligere eller blandes grundigt med en passende mængde vandfrit Na₂SO₄ eller MgSO₄ (6.2.1) for at sikre en bedre ekstraktionsoverflade og undgå, at prøvens naturlige indhold af vand nedsætter ekstraktionseffektiviteten (gælder primært for de alternative ekstraktionsmetoder ASE og MAE). Tørstofbestemmelse foretages i alle tilfælde ved 105ºC indtil konstant vægt.

I de tilfælde, hvor det kræves, at prøverne analyseres hurtigere, end ovenstående procedure tillader, vil prøveforberedelsen kunne foregå på følgende måde, blot laboratoriet i forvejen har verificeret sammenligneligheden:

Til den udtagne prøve tilsættes vandfrit Na₂SO₄ eller MgSO₄ (6.2.1) i tilstrækkelig mængde til at sikre, at prøven ved en efterfølgende grundig homogenisering fremtræder tør, løs og uden klumper. I modsat fald gentages tilsætningen af tørringmiddel, indtil tilstrækkelig tørhed er opnået.

8.4 Ekstraktion

8.4.1 Traditionel rystemetode

Der afvejes ca. 10 g prøve i en 500 mL red cap-flaske, og der tilsættes surrogatstandard (6.5). Efter mindst 10 min. henstand tilsættes 40 mL H₂O (6.2.5), og der justeres til pH 10-12 med 4M NaOH. Der tilsættes 150 ml acetone:pentan (6.2.3), og prøven behandles 5 min. på ultralydsbad fulgt af 2 timer på rystebord (250 ryst/min.). Derefter centrifugeres prøven i 5 min. (1500 RPM). Væskefasen overføres til skilletragt, og den organiske fase filtreres gennem faseseperationsfilter med 25 – 30 g glødet Na₂SO₄ (6.2.1) til en rundbundet kolbe. Ekstraktet inddampes til ca. 5 mL på rotationsfordamper eller andet egnet opkoncentreringsudstyr. Ekstraktet overføres til 10 mL målekolbe, og der fyldes efter til mærket med acetone (6.2.2). Heraf udtages 1,00 mL ekstrakt, som overføres til en GC-vial og der tilsættes evt. en sprøjtestandard (6.6) før analyse på GC-MS.

8.4.2 Soxtec-ekstraktion

Ekstraktion: "Boiling" (ekstraktionshylster neddyppet i solvent) 1 time
Ekstraktion: "Rinsing" (solvent drypper ned i ekstraktionshylsteret) 1 time
Ekstraktionshylster: 33 x 80 mm
Inddampning: til omkring 10 mL (ca. 5 min.).
Ekstraktionsmiddelmængde: 50 mL acetone:cyclohexan (6.2.4)

Der afvejes ca. 10 g prøve i ekstraktionshylster, som blandes med ca. 10 g vandfrit Na₂SO₄ (6.2.1), og der tilsættes surrogatstandard (6.5). Derefter tilsættes 50 mL acetone:cyclohexan (6.2.4) og ekstraktionshylstret anbringes i Soxtec-apparatet. Prøverne koges 1 time ved 160°C, hvorefter der skylles 1 time (reflux), og opløsningsmidlet inddampes i ca. 5 min. til omkring 10 mL.

Efter ekstraktion inddampes prøven forsigtigt under påblæsning af nitrogen til ca. 5 mL. Ekstraktet overføres kvantitativt til 10 mL målekolbe, og der fyldes op til mærket med cyclohexan (6.2.2). Heraf udtages 1,00 mL ekstrakt, som overføres til en GC-vial, og der tilsættes evt. en sprøjtestandard (6.6) før analyse på GC-MS.

8.4.3 Accelerated Solvent Extraction

Læg et filter i bunden af en ekstraktionscelle på 11 mL. Cellen fyldes helt med tørret prøve (8-10 g) og tilsættes surrogatstandard (6.5). Cellen lukkes, strammes og anbringes i ASE instrumentets karrusel.

Der ekstraheres med følgende betingelser:

Efter ekstraktion overføres prøven, efter inddampning under nitrogen, til henholdvis 10 mL målekolbe (10 g prøve). Der fyldes efter til mærket med cyclohexan (6.2.2). Heraf udtages 1,00 mL ekstrakt, som overføres til en GC-vial, og der tilsættes evt. en sprøjtestandard (6.6) før analyse på GC-MS.

Hvis ekstraktet indeholder H₂O, tørres dette med glødet Na₂SO₄ (6.2.1) inden inddampning.

8.4.4 Mikrobølgeekstraktion

10 g prøve afvejes direkte i ekstraktionsbeholderen og tilsættes surrogatstandard (6.5). Derefter tilsættes 2 mL vand (6.2.5) og 25 mL acetone:pentan (6.2.3), hvorefter beholderen lukkes forsvarligt og ekstraktionen igangsættes.

Efter ekstraktion afventes nedkøling af ekstraktionscellerne i ca. 30 min., således at trykket igen er gået af ekstraktionscellerne, og prøven tørres med ca. 10 g vandfrit Na₂SO₄ (6.2.1). Herefter overføres prøven kvantitativt, efter inddampning med nitrogen, til en 10 mL målekolbe. Der fyldes efter til mærket med acetone (6.2.2). Heraf udtages 1,00 mL ekstrakt, som overføres til en GC-vial, og der tilsættes en evt. sprøjtestandard (6.6) før analyse på GC-MS.

8.5 Gaskromatografiske betingelser

Ekstraktet analyseres ved gaskromatografi med massespektrometrisk detektion ved anvendelse af single ion monitoring (GC-MS-SIM) (VKI, 1996).

For hver komponent moniteres 2 ioner. Primær-ionen anvendes ved beregning, sekundær-ionen anvendes ved verifikation af identiteten.

Eksempel på gaskromatografiske betingelser:

Bemærk: Det er vigtigt, at benytte en starttemperatur der svarer til det solvent, som benyttes til injektionen, for at opnå de bedst mulige kromatografiske betingelser. Hvis der ikke benyttes elektronisk trykstyring af bæregassen, er det af afgørende betydning for separationen af de enkelte PAH-forbindelser at sikre sig, at der holdes et starttryk ved lav temperatur, som resulterer i en bæregashastighed på over 20 cm/s ved sluttemperaturen.

Det kan ofte være en fordel at benytte biphenyl d₁₀ som surrogat for naphtalen i stedet for Naphtalen d₈, specielt for de alternative ekstraktionsmetoder ASE og MAE.

9 Resultater

9.1 Kalibrering

Der analyseres kalibreringsopløsninger for alle komponenter inkl. surrogatstandarder. Der skal som minimum anvendes 5 niveauer, da standardkurven ofte ikke er lineær ved GC-MS. Hvis linien er ret og går gennem (0,0), kan der anvendes lineær regression ved beregningerne. Ellers anbefales det at bruge ikke-lineær kalibrering.

Efter kalibreringen kontrolleres denne ved genberegning af de brugte standarder. Afvigelsen fra den teoretiske koncentration bør efter genberegning ikke overstige 10% generelt og må ikke overstige 25% i hele det beregnede interval.

Laboratoriet skal sikre sig, at koncentrationerne i de analyserede ekstrakter ligger inden for det valgte kalibreringsinterval. Ellers skal ekstrakterne fortyndes og analyseres på ny.

9.2 Beregning

Stofferne identificeres ved deres retentionstid, ved de karakteristiske ioner for stoffet, samt den relative respons mellem de 2 benyttede ioner. Hovedionen anvendes til kvantificering. De kvantitative beregninger udføres i alle tilfælde ud fra toppenes arealer.

Koncentrationen af PAH i ekstraktet beregnes efter laboratoriets interne beregningsmetoder med korrektion for genfindelsen af surrogat standard og evt. sprøjtestandard, under hensyntagen til instrument- og softwareproducentens retningslinier.

Koncentrationen i prøven beregnes efter følgende formel:

          C_{ext, korr} * V * 100
C_pr = -----------------------
               g_pr * % TS

Hvis det ved blindprøverne viser sig, at der er et blindbidrag, fratrækkes det ved anvendelse af følgende udtryk:

Hvis ekstrakterne skal fortyndes mere end 5 gange for at bestemme høje indhold af PAH, kan responset fra surrogatstandarderne ikke benyttes længere, hvorfor genfindelsen af surrogatstandard skal bestemmes i en ikke-fortyndet eller en mindre end eller 5 ganges fortynding.

Ved fortynding af ekstrakter vurderes det, om en evt. sprøjtestandard skal tilsættes på ny.

9.3 Resultatangivelse

Resultaterne angives i mg/kg TS med to betydende cifre, og for resultater mindre end 0,10 mg/kg med et betydende ciffer, som f.eks.:

9.4 Præcision, nøjagtighed og detektionsgrænse

Præcision og nøjagtighed afventer en interlaboratorie-metodeafprøvning.

Detektionsgrænser og genfinding for rystemetoden bestemt ud fra seksdobbelt tilsætningsforsøg på lavt niveau (5 x detektionsgrænsen).

I de tilfælde, hvor laboratorierne har problemer med at opnå tilstrækkelig følsomhed, kan det opnåede ekstrakt inddampes yderligere, blot surrogatstandardmængden tilpasses den ekstra opkoncentrering eller ligger inden for surrogatstandardernes kalibreringsområde.

Detektionsgrænsen er desuden foreløbigt bestemt ud fra blindbidraget fra de enkelte metoder og kan ses i nedenstående tabel.

10 Analyserapport

Analyserapporten bør som minimum indeholde følgende:

	koncentrationer i mg/kg TS af alle enkelt-PAH, der er bestemt, og sum af alle enkelt-PAH, der er bestemt, samt sum af de 7 PAH, som indgår i jordkvalitetskriteriet
	nøjagtig identifikation af den anvendte metode (ekstraktions- og GC-MS-betingelser)
	nøjagtig prøvemærkning
	angivelse af tidspunkt for prøvernes modtagelse på laboratoriet
	enhver afvigelse fra denne standard, såsom afvigende opbevaringsbetingelser, skal anføres i analyserapporten
	henvisning til denne metode

11 Litteratur

Bjørseth, A., Ramdahl, T. (editor) (1985). Handbook of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, Volume 2. Marcel Dekker inc., New York,.

Hyver, K.J., Sandra, P. (editor) (1989) High Resolution Gas Chromatography, 3. Ed. Hewlett-Packard Co., Delaware.

Means, J.C. (1998). Compound-Specific Gas Chromatographic/Mass Spectrometric Analysis of Alkylated and Parent Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Waters, Sediments, and Aquatic Organisms. Journal of AOAC International, 81 s. 657- 672.

Schantz, M.M., Nichols, J.J., Wise, S.A. (1997) Evaluation of Pressurized Fluid Extraction for the Extraction of Environmental Matrix Reference Materials. Analytical Chemistry, 69, 1997, s. 4210-4219.

Heemken, O.P., Theobald, N.,. Wenclaviak, B.W (1997). Comparison of ASE and SFE with Soxhlet, Sonication, and Methanolic Saponification Extractions for the Determination of Organic Micropollutants in Marine Particulate Matter. Analytical Chemistry, 69, 1997, s. 2171-2180.

Fisher, J.A., Scarlett, M.J., Stott; A.D. (1997). Accelerated Solvent Extraction: An Evaluation for Screening of Soils for Selected U.S. EPA Semivolatile Organic Priority Pollutants. Environmental Science and Technology, 31, 1997, s. 1120-1127.

Dupeyron, S., Dudermel, P-M., Couturier, D., Guarini, P., Delattre, J-M. (1999). Extraction of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons from Soil: A Comparison Between Focused Microwave Assisted Extraction , Supercritical Fluid Extraction, Subcritical Solvent Extraction and Soxhlet Techniques. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 73, 1999, s. 191-210.

Letellier, M., Budzinski; H. (1999). Influence of Sediment Grain Size on the Efficiency of Focused Microwave Extraction of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. The Analyst, 124, 1999, s. 5-14.

Bestemmelse af PAH i jord og vand ved GC-MS, VKI-metode 0-32. 3. udgave, 20/10-96.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |