Vandprøve til kvantitativ toksicitetstest og toksinanalyse

Vandprøven udtages i en ren plastdunk (2.5–5 l), som skylles med vand fra prøveområdet, inden prøven udtages. Vandprøven udtages under overfladen, idet flasken sænkes ned i vandet med åbningen ned af og vendes i "albuedybde", hvorfra den fyldes. Der udtages minimum 5 liter, hvis mængden af toksiner, der er opløst i vandet, skal bestemmes, da denne type måling normalt kræver en opkoncentrering. Ved høje koncentrationer af giftige alger kan prøvemængden nedsættes til 1 liter. Prøven skal ikke konserveres.

Hvis det ikke er muligt at overholde "leveringstiden" på 24 timer, anbefales det at foretage en første prøveforberedelse af prøver til pigment- og toksinanalyser med HPLC. En delprøve afmåles og filtreres ned på et GF/C-glasfiberfilter. Vandvolumenet skal være så stort, at filteret får en synlig grøn eller brun farve. Sædvanligvis filtreres mellem 50-500 ml. Filteret foldes på langs, pakkes i et stykke mærket sølvpapir og nedfryses i –20 °C indtil analyse på HPLC. Koncentrerede prøver (f.eks. sammenskyl, netprøver) kan frysetørres inden de leveres til et laboratorium, hvis man har mulighed for dette.

Det anbefales at aftale procedurer med det laboratorium, der skal måle prøverne.

Automatiske målestationer (bøjer) giver kontinuerte målinger, som via kommunikationssystemer sendes direkte til en server på land. Afhængigt af formålet kan stationen instrumenteres simpel (ét instrument) eller med en række som fluorometer eller spektroradiometer, der måler alge-indikatorer som klorofyl og pigmenter og CTD, autoanalyser, ADCP etc. til måling af parametre som salinitet, næringsstoffer, strøm m.m. Data kan, alt efter hvordan systemet bygges op, give den ansvarlige myndighed løbende information, direkte eller ved integration i dynamiske modeller. Samme information kan præsenteres for borgerne på hjemmesiden. Løsningen er især relevant, hvor der kan ske en kobling mellem badevandskontrollen og den almindelige recipientovervågning.

Kortlægning af en algeopblomstring i havet kan ske på flere måder. Den hyppigst anvendte strategi er at observere og tage prøver fra skibe. Er algerne samlet i tætte koncentrationer ved overfladen, er "remote sensing" (jordobservation) en effektiv metodik, som giver et hurtigt overblik over store områder. Flyovervågning har været brugt med succes ved kortlægning af blågrønalgeopblomstringer langs Østersø-kysterne. Et problem ved almindelig flykortlægning, hvor der tages still foto eller videofilm, er imidlertid, at det ikke er muligt at identificere algerne fra luften. Der opstår også ofte tvivl om der reelt er tale om alger eller om sediment. Brug af farve-scannere monteret på fly eller satellitter kan delvist afhjælpe det sidste problem, idet de giver mulighed for at skelne mellem alger og sediment. Bortset fra blågrønalger er denne teknik derimod ikke brugbar til at identificere de enkelte algegrupper på nuværende tidspunkt. Fly-overvågning skal derfor kombineres med prøvetagning fra skib eller fra kysten. Satellitovervågning er på grund af den ringe opløsning endnu kun effektiv i større åbne havområder som Østersøen, Kattegat og Nordsøen, men nye sensorer med bedre opløsning er for nyligt sendt i kredsløb, og flere er på vej, så det bliver muligt at også analysere mere kystnære områder.

Bearbejdede satellit-billeder vil ofte være tilgængelige på internettet under store opblomstringer af blågrønalger i Østersøen.

På internettet kan der ligeledes løbende findes information fra "ships-of-opportunity" målinger af algesituationen i Østersøen.

6.2 Algeundersøgelser i laboratoriet

Screening for giftige alger. Screeningen skal fokusere på, om enkelte arter er ved at blive dominerende, og i givet fald hvilken algegruppe de tilhører. Der skal være speciel opmærksomhed på dominans af furealger og blågrønalger. Med hensyn til blågrønalgerne bør dominans af gruppen som helhed (og ikke nødvendigvis af enkelt arter) give anledning til ekstra vurdering af situationen.

Screening af algeprøver for forekomst af giftige arter og vurdering af koncentrationen af alger kan gennemføres af ikke-eksperter efter en tilbundsgående oplæring. I tilfælde af tvivl, bør eksperter konsulteres (se nedenfor).

Ved screening af prøver bruges ved tynde prøver (niveau A i Tabel 2-2) et 10 ml's sedimentationskammer, der fyldes med den indsamlede lugol-prøve, efter at prøveflasken er vendt op og ned flere gange (se Teknisk Anvisning for Marin Overvågning, Fytoplankton. DMU). For mere tætte prøver anvendes et celletællekammer. Tællekammeret har den fordel, at prøverne ikke skal sedimentere, og der kan anvendes ukonserveret prøvemateriale.

Det noteres, hvilke algegrupper og hvis muligt arter der dominerer samfundet. For at kunne følge udviklingen, bør prøverne oparbejdes af den samme person hver gang, og der kan laves en semikvantitativ vurdering efter følgende skala:

Kvantitativ prøvebearbejdning. Nøjere undersøgelser inklusiv kvantitative opgørelser kan kun udføres af eksperter og bør følge de tekniske anvisninger til det nationale overvågningsprogram. I den aktuelle sag afgøres det, om oparbejdning skal ske til celleantal eller volumen/biomasse, samt hvor detaljeret bestemmelsen af organismer skal være.

Klorofylanalyser måles iflg. DS. Analysen er rutine-ydelse hos danske miljøanalyselaboratorier.

Pigmentanalyser. Der findes ikke en DS metode for måling af pigmenter. Det anbefales at følges Schlüter & Havskum (1997).

Mikroskopering af vandprøve for screening af algesammensætning. Forudsat at der sker en oplæring, kan screeningen foretages af teknikere på de laboratorier, der udfører den almindelige badevandskontrol. Prøvetagning kan ske i forbindelse med den eksisterende badevandskontrol. Fordel: Kan udføres hurtigt og uden avanceret udstyr. Negativt: Laboratorierne har ikke algeeksperter, som kan hjælpe i tvivlstilfælde. Det kan undgås ved at sende prøverne til algeanalyselaboratorier.

Mikroskopering af vandprøve for kvantitativ bestemmelse af algesammensætning. Sikker artsbestemmelse og kvantificering kræver ekspertviden. For blågrønalger kan artsbestemmelse og kvantificering være vanskelig. På basis af erfaringer om sammenhæng mellem forekomst af enkelte arter og forekomst af algetoksin kan kvantificeringen i nogle tilfælde begrænses til udvalgte arter. Fordel: Giver indikationer om, hvilke arter der er problematiske, hvilket er af værdi for planlægning af screening og af fremtidig overvågning. Negativt: Da algetoksinerne kan optræde hos flere arter, kan det ikke generelt anbefales at fokusere ensidigt på enkelte arter.

Klorofylanalyse. Udfra eksisterende erfaringer kan der fastlægges en grænseværdi, som udløser undersøgelse af algesammensætningen og skærpet opmærksomhed om algeudviklingen. Analysen indgår allerede i recipientovervågningen, så oplysningen kan "lånes" herfra, såfremt der findes en repræsentativ station i nærheden af badestranden, og målingerne sker hver fjortende dag eller hyppigere. I tabel 2-2 er der foreslået en grænse på 10 m g klorofyl pr liter. I tilfælde med dominans af for eksempel blågrønalger (trin B og C) kan klorofylanalyse kombineret med screening for algesammensætning give tilstrækkeligt grundlag til at vurdere situationen. Fordel: Rutinemetode på laboratorierne. Mange prøver kan analyseres samtidig. I nogle tilfælde måles klorofyl allerede på nærliggende station. Negativt: Resultat foreligger først den følgende dag.

Pigmentanalyse. Udfra pigmentsammensætning kan man identificere de dominerende algegrupper og estimere deres biomasse udtrykt som klorofyl-ækvivalenter. For blågrønalger vil et sådan mål for gruppen som helhed give en god indikation for tilstedeværelse af cyanotoksiner (over 90% af alle blågrønalgeopblomstringer producerer toksin, se kapitel 7). Hvis andre algegrupper bliver dominerende og/eller deres biomasse øges markant, er en mikroskopisk analyse nødvendigt for at afgøre, om der er tale om dominans af en giftig art. En undtagelse er G.-mikimotoi-gruppen, der danner giftige opblomstringer i havet. Denne gruppe kan identificeres på forekomsten af markør-pigmentet gymnodiaxanthin. Fordel: Giver et kvantitativt mål, der ikke kræver special- kendskab til algearter. Mange prøver kan analyseres samtidigt. Negativt: Kræver avanceret udstyr (HPLC). Resultat foreligger den følgende dag.

6.3 Toksicitetstest og toksinanalyser

Til identifikation og kvantificering af algetoksiner og deres toksicitet eksisterer der i dag flere testmetoder (Boks 6-1). Metoderne varierer i sensitivitet og selektivitet (Figur 6-1), hurtighed og pris. Af de mest anvendte metoder er: bioassay på en udvalgt organisme (f.eks. mus, krebsdyr og bakterier), ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) og enzym-inhiberingsassays samt detektion ved højtrykskromotografi (HPLC). Der findes derudover en række andre metoder efter de samme principper, men disse er ikke implementerede på danske laboratorier. Generelt giver bioassay et billede af den samlede toksicitet, mens de øvrige metoder mere eller mindre præcist identificerer specifikke toksiner.

Toksicitetstest og toksinanalyser skal udføres på laboratorier med erfaring inden for denne type analyser (se Appendix B).

Boks 6-1.
Metoder til identifikation af algetoksinproblemer

Vurdering ud fra artssammensætningen. Det er under alle omstændigheder det første trin i vurderingen af den potentielle sundhedsfare i forbindelse med større algeforekomster i badevand Bioassays og biokemiske assays. Traditionelt anbefales musetest, fordi denne metode giver et samlet udtryk for toksiciteten overfor pattedyr og ikke kræver et forhåndskendskab til toksintypen. Denne metode anbefales, når der er begrundet mistanke om forekomst af toksiner, og man ønsker at få et samlet billede af toksiciteten. Har man begrundet formodning om, hvilke toksiner der er tale om (f.eks. ud fra tidligere undersøgelser eller ud fra artssammensætningen) kan man i stedet bruge mere specifikke og præcise metoder. Denne type metode er dog kun udviklet/testet til en begrænset antal toksiner. Kemisk analyse. Traditionelt bruges HPLC. Kemiske analyser kræver, at man ved præcist, hvilke toksiner man leder efter, og at der findes standarder. Metoden anbefales, hvis der ønskes en præcis identifikation af udvalgte toksiner. Metoden giver mulighed for analyse af et stort antal prøver på kort tid.

Figur 6-1.
Sammenligning af sensitivitet og selektivitet af forskellige metoder til detektion af toksicitet og toksiner

Kommentarer til toksicitetstest og toksinanalyser

Da der ikke eksisterer én testmetode, som er i stand til at måle for alle naturligt forekommende algetoksiner, skal der tages stilling til, hvilket præcisions- og identifikationsniveau der ønskes, før der vælges testmetode. I det følgende gives en kort beskrivelse af metodikkerne.

Bioassays giver i princippet et uspecifikt mål for toksiciteten uden hensyn til toksinsammensætningen.

Musetest er den internationalt anerkendte og mest anvendte metode til detektion af algetoksiner i fødevarer (primært muslinger). Det har længe været diskuteret om musetest kan tillades set fra et dyreetisk synspunkt, men der er stadig ikke fundet en brugbar alternativ metode. Musetest er derfor stadig den internationalt anerkendte metode, når potentielle humantoksiske effekter af algetoksiner skal vurderes. Metodens styrke er, at testorganismen er et pattedyr, hvis reaktion ligner menneskers, samt at den registrerer tilstedeværelsen af alle (slags) toksiner, og man behøver dermed ikke kende toksinprofilen. Metoden giver således, til forskel fra de kemiske analyser, et udtryk for den totale toksicitet. Udfra musenes reaktion får man indikation af, hvilke typer toksiner der er tilstede (levertoksiner, nervetoksiner osv.), men man skal være opmærksom på, at effekten af én type kan dække over andre typer. Metodens svaghed er, at den ikke er særlig følsom (Figur 6-1). Se Bilag B.

Af andre bioassays kan nævnes test med invertebrater, bl.a. saltsørejen Artemia salina og Daphnia, bakterier (Microtox assay) og levende celler. Fælles for disse test er, at deres anvendelighed kan variere med toksinsammensætningen, hvilket man skal være opmærksom på, når resultaterne vurderes.

Immunologiske assays er udviklede til specifikke toksiner, men krydsreagerer med beslægtede forbindelser, herunder derivater. Man skal således være opmærksom på forekomst af falsk positive. Reaktion med derivater er normalt ikke problematisk, da assays hyppigst er udviklet mod de mest giftige typer toksin.

ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) er en hurtig, følsom (Figur 6-1) og let-håndterbar metode, der ikke kræver dyrt udstyr at gennemføre. Der er fremstillet antistoffer for de mest almindeligt forekommende microcystiner, bl.a. microcystin-LR. Detektionsgrænsen er ned til 100 pg pr liter. Antistoffer kryds-reagerer med andre microcystin-varianter og nodularin i forskellig grad, hvilket i nogle tilfælde kan medføre en underestimering af toksinkoncentrationen, som udtrykkes i microcystin-LR ækvivalenter. Ydermere kan der forekomme microcystin-varianter, der ikke kan detekteres ved denne metode pga. manglende binding imellem toksinet og de anvendte antistoffer. På nuværende tidspunkt findes der kommercielt tilgængelige ELISA's til detektion af microcystiner.

Biokemiske assays. Den mest benyttede enzym-test er proteinfosfatase inhiberingsassay (PPI-assay), som benyttes til detektion af levertoksiner, bl.a. microcystiner og nodularin. Toksiciteten af levertoksiner kan tilskrives deres specifikke hæmning af de celleregulerende enzymer proteinfosfatase. Denne egenskab udnyttes ved proteinfosfatase inhiberingsassayet, hvor hæmningen af proteinfosfatase benyttes til kvantificering af toksinerne. Denne metode er, ligesom ELISA-metoden, hurtig, følsom (detektionsgrænsen er ca. 100 pg pr liter) og let-håndterbar, mens den ikke er i stand til at skelne imellem forskellige microcystin-varianter. Den giver således et samlet udtryk for vandprøvens indhold af levertoksiner.

Der eksisterer ydermere et Acetylcholinesterase inhiberingsassay, der kan benyttes til detektion og kvantificering af nervetoksinet anatoxin-a(s).

Kemiske analyser. Til detektion og kvantificering af specifikke toksiner er Højtryksvæskekromatografi (HPLC) i dag den mest benyttede metode; eventuelt koblet sammen med et massespektrometer (MS). Der findes standardmetoder til analyse for alle de almindeligt kendte toksiner. HPLC-metoden til kvantificering af levertoksinerne microcystin og nodularin er identisk, mens der skal bruges andre HPLC-metoder til kvantificering af nerve- og saxitoksiner. Det er derfor vigtigt, at man ved, hvilke toksiner man forventer at finde i vandprøven, inden HPLC-kørslen påbegyndes. Fordelen ved HPLC er, sammenlignet med de ovenstående beskrevet metoder, at den er selektiv og giver et præcist overblik over tilstedeværende toksiner. Detektionsgrænsen for HPLC-metoden (ca. 400 ng pr liter) er lavere end for musetesten, men højere end for ELISA og enzyminhiberingstesten. En ulempe ved metoden (og andre kemiske metoder) er, at en sikker detektion og kvantificering kræver at standarder for hver enkelt toksin, dvs. man skal vide, hvilke toksiner man leder efter og standarder skal være tilgængelige. For microcystin er der i dag identificeret over 50 derivater, mens der kun er tilgængelige standarder for et begrænset udvalg. Problemet omgås ved at bruge en tilgængelig standard, normalt det højtoksiske microcystin-LR. På den måde fås en koncentration, der svarer til den værst tænkelige situation.

Selve HPLC-udstyret er en dyr investering, men når apparaturet og rutinen er indkørt, er det en billig, hurtig og objektiv metode til detektion og kvantificering af kendte toksiner i alger og vand.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |