|
Optimering og validering af metode til påvisning af Cryptosporidium og Giardia i drikkevand SammendragFormålet med dette projekt var at optimere og validere en metode til opkoncentrering, oprensning og efterfølgende identifikation af protozoerne Cryptosporidium og Giardia i henholdsvis råvand og rent vand. Baggrund Interessen for at kende status for vandets indhold af protozoerne er bl.a. baseret på beskrivelsen af omfattende vandbårne epidemier forårsaget af Cryptosporidium og Giardia i drikkevand. Herved er opstået en stigende interesse for udvikling og optimering af metoder til påvisning af disse zoonotiske parasitter i forskellige materialer, herunder råvand og drikkevand. Cryptosporidium parvum og Giardia lamblia (syn. G. intestinalis og G. duodenalis) er encellede parasitter, der kan inficere mavetarm-kanalen hos såvel mennesker som dyr. Parasitterne er ubikvitært forekommende i naturen og blandt de almindeligste ikke-bakterielle årsager til diarré. Cryptosporidier udskilles via fæces som oocyster og i meget store mængder. Oocysterne er straks infektive og endvidere modstandsdygtige overfor alle almindeligt anvendte desinfektionsmidler herunder klor i koncentrationer, der kan anvendes til behandling af drikke- / badevand. I køligt, fugtigt miljø kan oocysterne overleve flere måneder. Smitte finder sted ved direkte kontakt (person-person, dyr-menneske) eller indirekte via optagelse af oocyster fra bl.a. drikkevand, badevand og levnedsmidler forurenet med fækalier. Giardiasis hos mennesker forårsages af arten G. lamblia, der i lighed med C. parvum har et meget bredt værtsspektrum. Livscyklus omfatter to stadier: Trophozoit stadiet, som er det infektive stadium og cyste stadiet, som er den resistente form, der udskilles med fæces. Cysten kan overleve op til 2 måneder udenfor værten. For begge protozoer er få (oo)cyster tilstrækkeligt til at give sygdom. Metoden I det nærværende studie er en metode til påvisning af Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster blevet optimeret og valideret. Metoden er valideret via bestemmelse af genfindelsesprocenten ved tilsætning af kendte mængder oocyster og cyster i forskellige koncentrationer til vandprøverne. Til valideringen er anvendt 6 vandprøver af forskellig kvalitet: Tre rentvandsprøver fra hhv. Kingosvej, Mørkskov og Regnemark vandværk, samt 3 råvandsprøver fra Kingosvej og Mørkskov vandværk tillige med Ejby råvandsboring. For hver vandprøve er der foretaget 10 filtreringer à 10 liter med hver af de følgende cyste/oocyste koncentrationer: 100, 1000 og 10.000. For hver 10. filtrering blev der medtaget en positiv kontrol (5 l milli-Q eller ionbyttet vand tilsat det samme antal cyster/oocyster som de forudgående vandprøver: 100, 1000 eller 10.000) og en negativ kontrol(5 l milli-Q eller ionbyttet vand). Vandprøverne er blevet filtreret gennem et 2 µm membranfilter, opkoncentreret vha. centrifugering og immunomagnetisk separation (IMS), og sluttelig farvet og aflæst vha. immunofluorescens. I forbindelse med projektet blev metoderne til opkoncentrering og detektion af Cryptosporidium og Giardia i vandprøver optimeret på forskellige punkter: Ved filtreringsprocessen sikredes udskiftning af gummislanger så disse var garanteret protozo-fri. Ved frigørelse af oocyster/cyster fra filtret i den anvendte 'pulsifier' justeredes vandmængde og procedure for at minimere tab af ocyster/cyster. Filtratopkoncentrering foregik ved ændret indstilling af centrifugeringen - og mikroskoperingsprocessen justeredes efter prøvens indhold af (oo)cyster. Som led i valideringen blev det undersøgt, hvorvidt der var interaktion mellem Giardia og Cryptosporidium, idet eksempelvis høj koncentration af den ene art kunne tænkes at påvirke genfindelsen af den anden art. Disse forsøg blev udført i postevand, der blev tilsat hhv. 10.000 af den ene parasit og 100 af den anden og vice versa. For hver kombination blev der lavet 5 filtreringer. Desuden blev resultaterne af de positive kontroller, fra forsøg tilsat 10.000 af hver parasit, sammenlignet med interaktionsforsøgene, for at vurdere hvorvidt en samtidig høj koncentration af begge parasitter havde en negativ effekt på genfindelsesprocenten. Forsøg med råvand viste, at der ikke var den forventede genfindelse af Cryptosporidium oocyster. For at verificere at oocysterne blev fanget i filtret, blev der efter nogle enkelte filtreringer og inden IMS udtaget 50 µl af prøven på et objektglas. Prøven blev farvet efter fabrikantens forskrifter og aflæst i fluorescens mikroskop. I alle tilfælde kunne der påvises oocyster i prøven efter filtrering. Resultater Genfindelsesprocenten af cyster/oocyster blev ikke påvirket negativt ved høje koncentrationer af den ene eller begge parasitter, og var således ikke signifikant forskellig ved de forskellige koncentrationer af hhv. Giardia og Cryptosporidium. Denne observation muliggjorde en vurdering af genfindelsesprocenten for hver parasit i de undersøgte vandtyper uden korrektion for en evt. interaktion. For bedst muligt at kunne beregne genfindelsesprocenten for de to protozoarter i de respektive vandtyper blev den tilsatte mængde protozocyster hhv. -oocyster kontrolleret ved undersøgelse af 3 stikprøver for hver podningsdosis. Resultaterne af disse kontroltællinger varierede meget, men var ikke signifikant forskellig mellem de to protozoer. Genfindelsen af Giardia i råvand varierede mellem 39,3-77,3 % med et gennemsnit fra 54,6-62,3 %, og med størst variation i prøver med lav koncentration. Farvningen af Giardia cysterne var utilfredsstillende i alle råvandsprøverne. Genfindelsesprocenten for Giardia cyster i rent vand varierede mellem 26,8-63,4 % med et gennemsnit fra 41,5-52,8 % (figur 6). Variationen i genfindelsesprocenten var størst i prøverne med den laveste koncentration. Kun for Kingosvej prøver tilsat hhv. 1000 og 10.000 cyster var der en signifikant forskel (P < 0,05) sammenlignet med de øvrige rentvandsprøver, som i øvrigt ikke var forskellige fra hinanden. Udelades resultaterne for Kingosvej rent vand, som tydeligt lå lavere end resultaterne for de øvrige to rentvandstyper var genfindelsen mellem 48,9-59,4 %. Genfindelsen af Cryptosporidium i råvand varierede mellem 0,1-6,0 % med et gennemsnit fra 0,2-3,2 %. Variationen i genfindelsesprocenten var størst i prøver tilsat 100 oocyster. Genfindelsen af Cryptosporidium oocyster var for de tre rentvandstyper inden for et interval af 25-51,1 % med et gennemsnit fra 37,0-38,7 %. Den største variation i genfindelsesprocenten sås i prøver tilsat 100 oocyster, hvorimod standardafvigelsen i prøver tilsat 10.000 oocyster var mindre. Som det fremgår af ovenstående gjaldt det for både råvand og rent vand, at genfindelsen af Giardia var større end genfindelsen for Cryptosporidium. Dette kan skyldes, at Giardia cysterne er større og derfor lettere bliver opfanget af filtret. Desuden er det i henhold til producenten af IMS-kittet, Dynal Biotech, vist, at bindingen mellem Giardia og Dynabeads anti-Giardia er stærkere end bindingen mellem Cryptosporidium og Dynabeads anti-Cryptosporidium. Dette kan være årsagen til, at der i råvand genfindes mange Giardia cyster men ingen eller kun få Cryptosporidium oocyster. Det er et kendt problem, at Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster har en tendens til at klumpe sammen og bundfælde, hvilket besværliggør en nøjagtig podning af prøverne. Generelt må det antages, at den store standardafvigelse i protozo-genfindelsen ikke mindst i prøver tilsat få oocyster/cyster er forårsaget af såvel en variation i mængden af tilsatte protozoer som en metode relateret (filtrering, IMS, fluorescens) variation. Råvandets kemiske og biologiske sammensætning udskiller sig på de fleste punkter ikke meget fra det rene vand. Der er dog en del jern især i Ejby råvand (3,7 mg/l), og selv i Kingosvej råvand (0,05-0,09 mg/l), som indeholder mindst af jern af de tre råvandstyperne, er der mere end i nogen af rentvandstyperne. For alle råvandstyper er der også betydeligt mere ammonium end i det rene vand. Derudover ser det ud til, at der i råvandet er mere bikarbonat og svovlilte end i det rene vand, men for disse parametre foreligger ikke værdier for alle vandtyperne. I modsætning til Giardia var der stort set ingen genfindelse af Cryptosporidium i råvand. Cryptosporidierne var påvist i prøven efter filtrering, hvorfor det må konkluderes at være IMS-opkoncentreringen, der ikke fungerede i råvand. Dette kunne evt. skyldes mængden af jern i råvandet eller den forholdsvis store mængde bundfald, selvom denne dog ikke overskrider Dynals forskrifter. Bindingen mellem Cryptosporidium oocysterne og Dynabeads anti-Cryptosporidium er ikke kraftig, og det kan tænkes, at stoffer i bundfaldet svækker bindingen yderligere. Der er ikke bestemt en nedre grænse for, hvad metoden kan detektere, men baseret på den fundne genfindelse for Cryptosporidium oocyster på minimum 25 % forventes det, at metoden kan detektere 2-3 oocyster i prøver med kun 10 oocyster. For Giardia kan metoden detektere 4-6 cyster ud af prøver med kun 10 cyster. Der er ved metodevalideringen ikke påvist en øvre begrænsning i antallet af oocyster/cyster, der kan detekteres, men denne er først og fremmest afhængig af IMSprocessen.
|