Bioremediering ved hjælp af planter og gensplejsede bakterier
Sammenfatning og konklusioner
Sammenfatning
Et langsigtet forsknings- og udviklingsprojekt blev gennemført under Miljøstyrelsens "Teknologiprogrammet for jord- og grundvandsforurening" i forbindelse med EU’s bioteknologiprogram. Formålet med projektet var at udvikle fytoremedieringsteknologi for PCB-forurenede grunde ved at genmodificere bakterier så de nedbryder PCB samtidig med at de bliver vedligeholdt og fordelt i jorden ved hjælp af planterødder. Projektet opnåede at udvikle denne type bakterier. En af bakterierne blev sikkerheds-testet i laboratoriet og er klar til en sikkerhedsmæssig afprøvning i felten. Undersøgelser af bakteriernes evne til at lave fytoremediering mere effektiv er ikke blevet afsluttet. Arbejdet fortsætter under et nyt EU-projekt.
Hovedkonklusioner
Det blev påvist, at man ved gensplejsning kan lave rodkoloniserende bakterier, der kan nedbryde lavt-klorerede PCB’er i jord. Det er dog endnu ikke lykkedes konkret at påvise oprensningseffekten i forurenet jord.
De gensplejsede bakterier kan anvendes ved at pode dem på frø eller stiklinger.
En gensplejset bakterie blev påvist at være sikker i laboratorie-eksperimenter og er klar til den sikkerhedsmæssige afprøvning i felten.
De vigtigste delkonklusioner
 | I jordforsøg med lucerne (Medicago sativa) koloniserede bakteriestamme Pseudomonas fluorescens F113rifpcb planterødder med en høj densitet. Der blev målt bakteriedensiteter mellem 105 cfu/g og 106 cfu/g fugtig rod, og den totale aerobe bakteriepopulation bestod af op til 10% af den gensplejsede stamme. |
| Den mest effektive måde for podning af lucerne rødder med stammen Pseudomonas fluorescens F113rifpcb i ikke-steriliseret jord er ved at anvende alginat kapsler der indeholder bakteriestammen. |
| Genafsnit på begge sider af bph genkompleksen i den genmodificerede stamme Pseudomonas fluorescens F113rifpcb blev sekventeret og dernæst blev der udviklet en PCR (polymerase kædereaktion)-baseret metode for påvisning og kvantificering af bakteriestammen i jord. |
| Tilsvarende blev der udviklet en metode for stammen Pseudomonas fluorescens F113lacZY, som er baseret på en unik sekvens i overgangen mellem det indførte genkomplex og kromosomet af vildtypen. |
| Genmodificerede derivater af stammen Pseudomonas fluorescens F113 er blevet konstrueret med om-regulerede bph genkomplekser. Konstruktioner med pNODD4 og pEX promotorer, som induceres af rodeksudater, er blevet testet. Nogle af disse stammer er også blevet evalueret med hensyn til kolonisering af lucernerødder i ikke sterile jordmikrokosmer. |
| Et delmål af projektet var udviklingen af bakteriestammer med begrænset overlevelse (biologisk indeslutning). Der er blevet fremstillet en Pseudomonas fluorescens F113 stamme med et gacA gen, der reguleres af pEX promoteren. gacA genet sikrer bakteriens naturlige overlevelse i jord. Den nye konstruktion medfører, at bakterierne kun udviser god overlevelse i en rodzone. Forsøget viser, at biologisk indeslutning på basis af rodeksudater er principielt muligt. |
| Et specielt bæremateriale blev udviklet og påvist effektivt i anvendelse med stammen Pseudomonas fluorescens F113 på pilestiklinger og plantefrø. |
| En nem protokol for overflade-sterilisering af pil samt et system for steril hydroponisk dyrkning af pil, blev udviklet. Systemet kan anvendes til mere præcise studier af metabolismen af forurenings-stoffer i pileplanter. |
| Bakteriestammen Pseudomonas fluorescens F113 var i stand til at etablere sig i rhizosfæren af pil samt i jord uden pil. Bakterietallet var signifikant højere i rhizosfæren end i bulk jorden. Efter planterne var blevet dræbt ved brug af et herbicid, var bakteriestammen i stand til at overleve i rodzonen og derefter at etablere sig igen i rhizosfæren af nye pileplanter, efter disse var blevet plantet i den samme jord. |
| Den genmodificerede stamme Pseudomonas fluorescens F113rifpcb, som indeholder bph-genkomplexet, var i stand til at nedbryde bifenyl og flere PCB-kongenere til CO2. Men uden tilførelse af ekstra kulstof (udover PCB’erne) var nedbrydningsraterne særdeles langsomme, sandsynligvis fordi nedbrydningen er cometabolisk og kræver en ekstra energikilde. |
| Det var ikke muligt, at vise forbedret nedbrydning af 4-PCB i jord som effekt af inokulering af pileplanter med den genmodificerede stamme Pseudomonas fluorescens F113rifpcb med bph-gener. Dette skyldes sandsynligvis, at bakteriernes nedbrydnings-aktivitet var lavere end optagelses-hastigheden i planterne. |
| Reporter konstruktioner af stammen Pseudomonas fluorescens F113rifpcb viste, i forbindelse med confocal laser scanning mikroskopi, at stammen koloniserede hele rhizosfæren, inklusive rod-spidserne af lucerne og pil. Koloniseringsgraden var uafhængig af tilstedeværelsen af 4-PCB. Alt tydede på, at aktiviteten af bakterierne i rhizosfæren var lav, og kun omkring 1 procent af bakteriecellerne viste en målbar omsætning af 4-PCB til 4-klorbenzoat. |
| Nyere konstruktioner af stammen Pseudomonas fluorescens F113, med kraftigere gen-regulatorer, er endnu ikke blevet testet i disse detaljer. |