| Til bund | | Forside |

Miljøprojekt, 827

Metodeafprøvning af metode til analyse af kationiske detergenter

Indholdsfortegnelse

Forord

Detergenter, anioniske og kationiske, anvendes i store mængder i danske husholdninger og i industriprodukter, primært i vaske- og rengøringsprodukter. Derfor er belastningen i spildevandet og af renseanlæggene stor. I overvågningsprogrammet for vandmiljøet, NOVA 2003, er det ønsket at vurdere, hvilken belastning der er på miljøet fra renseanlæggene. Derfor er det nødvendigt på afløb fra renseanlæggene at kunne måle for såvel kationiske som anioniske detergenter.

Der anvendes mange forskellige typer af kationiske og anioniske detergenter. Derfor er en ikke-specifik metode ønskelig for først at konstatere, hvad det totale indhold af detergenter er i prøven. Hvis der findes detergenter med den ikke-specifikke metode, kan prøven evt. efterfølgende analyseres med en specifik metode.

En metode til opkoncentrering og separation af kationiske detergenter fra anioniske og nonioniske detergenter i afløbsspildevand blev udviklet på baggrund af et litteraturstudierne af J. Merry et al, (1999) /1/, A. Favrbo et al (2002) /2/ samt analyseforarbejdet af K.-H. Theil (2001) /3/. Metoden bygger på princippet beskrevet af Kloster et al (1994) /4/ og N. Buschmann et al (1992) /5/.

Princippet i den udviklede metode er, at detergenterne i prøven opkoncentreres ved, at de tilbageholdes på en PPL-kolonne. Herefter elueres med 50:50 metanol/ethylacetat i 10 mM ammoniumacetat, efterfulgt af en inddampning og genopløsning i ethylacetat. Nonioniske, kationiske og anioniske detergenter kan derefter separeres ved en fastfaseekstraktion på en alumina-kolonne. Detergenterne elueres med forskellige organiske solventer i den nævnte rækkefølge. Kationiske detergenter elueres med 95:5 metanol/trifloureddikesyre og bestemmes spektrofotometrisk ved 628 nm ved en detektionsmetode svarende til DIN 38409 Teil 20 (1989) /8/. De enkelte deltrin er undersøgt og optimeret separat /2/.

Den udviklede metode skulle opfylde krav svarende til kvalitetsklasse 3 i bekendtgørelse 637 (Miljø- og Energiministeriet, 1997) /6/ samt have et måleområde mellem 10 µg/L og 200 µg/L.

Den udviklede metode blev valideret af A. Favrbo et al (2002) /2/ efter principperne i ”Håndbog for metodevalidering for miljølaboratorier” /7/. Her blev fundet, at metoden var lineær til 200 µg/L. Detektiongrænseundersøgelsen viste, at en detektionsgrænse på 10 µg/L var realistisk. Den relative standardafvigelse blev fundet til at variere mellem 8,2 og 12,5%. Dette var højere end kravet på ±7% til kvalitetsklasse 3. Da kravet i bekendtgørelsen bygger på en beregning af mere end 20 kontrolprøvepar, og der i denne undersøgelse kun indgik 4-5 prøvepar, vil kravet formentligt kunne overholdes, når antallet af bestemmelser stiger også som følge af en større rutine.

Genfindingen af middelværdien for kontrolprøver må i kvalitetsklasse 3 højst variere ± 5% (for prøver over 5 gange detektionsgrænsen). Resultaterne fra valideringsforsøgene viste, at vi generelt fandt 8,7% til 12,6% mindre end det forventede. Metodeafprøvningen i denne rapport skal derfor være med til at belyse, om det er nødvendigt at korrigere for dette tab, enten ved at spike en af prøverne eller ud fra en medanalyseret syntetisk prøve. Endvidere skal metodeafprøvningen belyse, om den udviklede metode er generelt anvendelig til analyser af kationiske detergenter i spildevand, og om analysekvaliteten er tilstrækkelig god, til at analysen kan indgå i overvågningsprogrammet.

En speciel tak til Henning Fallesen (Steins Laboratorium A/S) og Torben Knudsen (ROVESTA Miljø I/S) for deltagelsen i denne metodeafprøvning og for den konstruktive feedback før, under og efter metodeafprøvningen.

1 Metodeafprøvning

1.1 Program og begrænsninger

12 danske, 1 finsk, 1 norsk og 1 svensk laboratorium blev inviteret med i metodeafprøvningen, der var gratis. Kun 2 eksterne danske laboratorier (ROVESTA Miljø I/S og Steins Laboratorium A/S) ønskede at deltage. Det blev derfor besluttet, at Eurofins A/S laboratoriet i Hørsholm også skulle deltage og indgå i metodeafprøvningen.

I metodeafprøvningen var det et mål at undersøge både syntetiske og naturlige matricer i hele metodens dynamiske måleområde. Det begrænsede antal deltagere gjorde, at antallet af frihedsgrader i de statistiske tests var meget få, og antallet af bestemmelser på de enkelte prøver måtte øges. Da laboratoriet i Hørsholm skulle deltage, var det nødvendigt at designe afprøvningen, så den samtidigt kun teste, om prøverne var homogene. Da kapaciteten af metoden gør, at der maksimalt kan analyseres 16 prøver/dag, blev følgende afprøvningsprogram opstillet og gennemført.

Tabel 1-1
Program for metodeafprøvningen.
A) For at kunne teste homogeniteten med det maksimale antal frihedsgrader, sendes ens prøvepar ud til dobbeltbestemmelse for alle prøverne. Derved fås 2 dobbeltbestemmelser. B) Blindprøve- og kontrolprøveresultaterne stammer fra laboratoriernes egne bestemmelser (jf. afsnit 6,3 i bilag A) C) Her var spildevand 1 (Hårslev renseanlæg (Fyn), afløb) og spildevand 2 (Havndal renseanlæg i Mariager, afløb). Begge blev filtreret med 0,45 µm membranfilter inden spikening. D) Indholdet blev bestemt ud fra de tilsatte mængder af ADMBAC. Ved tidligere undersøgelser (ikke gengivet her) blev det vist, at indholdet af kationiske detergenter i spildevand 1 og 2 ikke var detekterbart.

I metodeundersøgelsen blev alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (ADMBAC) benyttet til spikening af prøverne, da erfaringen viser, at denne er væsentligt mere stabil end disteryldimethylammoniumchlorid (DSDMAC), som blev benyttet som standardstof i metoden.

De to analysedage var henholdsvis torsdag den 23. og 30. oktober. Prøverne blev fremstillet henholdsvis mandag den 21. og 28. oktober 2002. Prøverne blev aftappet i specielt rensede glasflasker og fremsendt til laboratorierne i køletasker.5 Metoden blev udsendt til laboratorierne inden analysedagene. Metoden, der blev udsendt til laboratorierne er gengivet i bilag A. Metodevalideringen i /2/ gav anledning til nogle små ændringer i metoden. Ændringerne var hovedsageligt en justering af mængderne af reagenser, der skulle fremstilles. Disse ændringer blev markeret med ”Track Changes”–funktionen i bilag A. Korrespondancen, der fulgte prøverne, er gengivet i bilag H.

1.2 Resultater

De deltagende laboratoriers resultater er gengivet i bilag C.

Der blev observeret en klar tendens til, at laboratorierne fandt systematisk forskellige resultater, således at laboratorium 1 fandt højere resultater end laboratorium 2, som igen fandt højere resultater end laboratorium 3. Brugtes resultaterne i bilag C til en homogenitetstest med programmet ISO 5725 (bygger på robusthedsstatistik fra bl.a. DS/ISO 5725-5 /9/), blev prøverne fundet homogene. Dette skyldes, at variationen mellem laboratorierne var meget stor sammenlignet med variationen mellem prøveparrene inden for laboratorierne.

Tendensen gik igen for alle prøver og også for kontrolprøverne. For at få belyst denne tendens blev der sendt et spørgeskema til de deltagende laboratorier.

1.3 Spørgeskemaundersøgelse

Det udsendte spørgeskema fremgår af bilag D. Svarene fra de 3 laboratorier er gengivet i bilag E.

Laboratorium 3 skrev til spørgsmålet om kuvettestørrelse ”5 cm (ikke nok prøve til 10 cm kuvette)”. I afsnit 6.1 i metoden skrives, at der skal anvendes en 10 mm kuvette. Denne afvigelse fra metoden vil der blive korrigeret for gennem brugen af kalibreringskurven.

I spørgsmål 3 har laboratorium 3 skrevet, at de ”afvejer 100 mg/500 mL, som de fortynder til 10 mg/L”. Da dette laboratorium har opnået afvigende resultater fra de to andre, vil denne ændring ikke indgå i den reviderede metodeforskrift (bilag B).

Af svarene omkring brugen af standard- og kontrolstoffer fremgik det, at laboratorium 1 og 2 brugte samme fabrikat for begge stoffer. Denne forskel kan tænkes at medføre en systematisk påvirkning af resultater mellem laboratorierne.

Spørgeskemaundersøgelsen viste endvidere, at der var forskellige måder at udregne resultaterne på. Derfor blev alle resultaterne genberegnet ud fra absorbanserne i originaldata. Dette gav en væsentlig forskel for laboratorium 3.

I disse beregninger er benyttet følgende udregninger for prøverne. Disse nye formler implementeres i metodeforskriften for at sikre en ensartet udregning:

hvor:

X er resultatet i µg/L
Aprøve er absorbansen ved 628 nm for prøven
Ablindprøve er gennemsnittet af absorbanserne ved 628 nm for blindanalyserne, der er analyseret sammen med prøverne 6
Volprøve er volumenet i mL af prøve benyttet til analysen
á er hældningen af standardkurven fra punkt 6.2 i metodeforskriften Til udregning af blindværdierne blev benyttet:

hvor:

X er resultatet i µg/L
Ablindprøve er absorbansen ved 628 nm for de medanalyserede blindprøver Ablindstandard er absorbansen ved skæringen af standardkurven med y-aksen Volblindprøve er volumenet i mL af blindprøven benyttet til analysen
á er hældningen af standardkurven fra punkt 6.2 i metodeforskriften.

Endelig skal resultatet af kalibreringskontrollen beregnet efter:

hvor:

X er resultatet i µg
A kalibreringkontrol er absorbansen ved 628 nm for kalibreringskontrollerne A blindstandard er absorbansen ved skæringen af standardkurven med y-aksen
á er hældningen af standardkurven fra punkt 6.2 i metodeforskriften.

De genberegnede resultater findes i bilag F. Efter metodevalideringen /2/ blev det på grund af en lav genfinding (87-91 %) besluttet at undersøge om en korrektion med en medanalyseret kontrolprøve kunne forbedre denne genfinding. Derfor er der i bilag F også gengivet resultaterne efter en sådan korrektion. Denne blev foretaget ud fra laboratoriernes resultater fra kontrolprøve 100.

1.4 Homogenitetstest

De genberegnede data blev benyttet til en homogenitetstest med programmet ISO 5725 (version 3.31, september 2002). Nøgletallene fra homogenitetstesten findes i bilag G. For at validere, om prøveparrene var homogene, divideredes spredningen fra homogeniteten (s2(H)) med spredningen mellem laboratorierne (s2(L)). Denne teststørrelse blev sammenlignet med en F-test værdi (95%-niveau). Da s2(H)/ s2(L) var mindre end 1 for alle prøvepar (både ikke-korrigeret og korrigeret) var de homogene på et 95%-niveau. Derfor kan resultaterne for prøvepar A og B, prøvepar C og D, prøvepar E og F samt resultaterne fra prøvepar G og H pooles således, at der kan opnås bedre estimater for de statistiske nøgleparametrene.

1.5 Vurdering af metoden

Tabel 1-2 viser en oversigt over statistiske nøgleparametre udregnet både med og uden korrektion for den medanalyserede kontrolprøve.

Tabel 1-2
Generel analysekvalitet for kationiske detergenter bestemt med og uden korrektion for medanalyseret kontrolprøve 100. Originaldata findes i bilag F og G.

I de næste afsnit undersøges korrekthed, præcision (repeterbarhed og reproducerbarhed) og detektionsgrænse.

1.5.1 Korrekthed (genfinding)

Genfindingen af prøverne og den tilsatte spike-opløsning er vist nedenfor i Tabel 1-3.

Klik på billedet for at se html-version af "Tabel 1-3".

Middelgenfindingen, når der korrigeres med kontrolprøve 100, er fundet til 105%, hvilket er bedre end hvis der ikke bliver korrigeret (108%), men forskellen er ikke stor. Sammenlignes middelgenfindingerne med en parret t-test, er der ikke signifikant forskel på de to (95%-signifikansniveau). Der er derfor intet i disse tal der tyder på at en korrektion med kontrolprøve 100 giver en signifikant bedre genfinding.

Genfindingerne uden korrektion varierede i intervallet 99-127%. Genfindingerne på spildevand 2 (Havndal renseanlæg i Mariager, afløb), findes generelt for højt (113 og 127%). Råspildevandet blev undersøgt i forundersøgelserne og ved metodeudviklingen /2/. Her blev der ikke detekteret et indhold af kationiske detergenter, der kunne forklare den højere genfinding. Da detektionsgrænsen for metoden forventes at være 10 µg/L kan der godt være et indhold af kationiske detergenter i prøven under de 10 µg/L. Dette kan forklare de lidt høje genfindinger. Denne teori understøttes af at forskellen mellem prøvepar G/H og E/F var 49,8 µg/L, hvilket var en 100% genfinding af et spike på 50 µg/L. Ved at se på forskellen negligeres bidraget fra prøven. Genfindingen varierer derfor mellem 99-101 %. Denne konklusion skal tages med et stort forbehold, da spredningen på gennemsnittet er af en betydelig størrelse (se afsnit 1.5.2).

Kravet til genfindingen af middelværdien af interne kontrolprøver i kvalitetsklasse 3 er ±5%. Dette krav overholdes for nogle prøver (A/B og C/D) og for splittet mellem G/H og E/F. 98 Sammenhængen mellem nominel værdi og laboratoriernes måleværdier er vist i figur 1-1.

 

Figur 1-1  
Sammenhæng mellem nominel værdi og målt værdi.

Som det fremgår af figuren, var der en lineær sammenhæng mellem de nominelle og de målte værdier. Figuren viser også tendens til, at metoden giver større resultater end de nominelt fastsatte værdier og viser en betydelig spredning for hvert målepunkt. Ligningen fundet ved regressionsanalysen var Y=1,15X-1,8. Altså ca. 15% højere resultater end den nominelle værdi. En regressionsanalyse for resultaterne korrigeret med kontrolprøve 100 gav ligningen Y=1,17X-1,2, altså tilsvarende for højt. En korrektion med genfindingen af en medanalyseret kontrolprøve (kontrolprøve 100) giver derfor ikke en bedre middelgenfinding.

Det er ønskeligt, at den udviklede metode opfylder kravene i kvalitetsklasse 3 i bekendtgørelse 637 /2/. Her er kravet til ekstern kvalitetskontrol (præstationsprøvninger), at enkelt prøver højst må afvige 30% fra den nominelle værdi.

Klik på billedet for at se html-version af "Tabel 1-4".

Tabel 1-4 viser, at antallet af prøvepar, der overholdt kravet til bekendtgørelse 637 er markant større, når der korrigeres for kontrolprøvens genfinding. Med korrektion kan laboratorium 1 og 2 overholde kravet for 32 ud af 34 analyseresultater mod kun 23 uden korrektion.

I næste afsnit undersøges, om korrektionen giver anledning til en bedre præcision i form af bedre reproducerbarhed for metoden.

1.5.2 Præcision (repeterbarhed og reproducerbarhed)

Præcisionen opnået med og uden korrektion med genfindingen af en medanalyseret kontrolprøve ses i tabel 1-5.

Klik på billedet for at se html-version af "Tabel 1-5".

Tabel 1-5 viser for repeterbarhedsstandardafvigelsen (sr) dels, at der ikke skete en entydig stigning af sr med stigende koncentration, og dels, at sr uden korrektion er sammenlignelig med sr for de korrigerede resultater. I modsætning hertil viser reproducerbarhedsstandardafvigelsen (sR) stigning med stigende koncentration for

begge rækker af analyseresultater. Dette er illustreret med figur 1-2.

Figur 1-2 Reproducerbarhedsstandardafvigelse (sR) for resultaterne med og uden

korrektion med genfindingen af en medanalyseret kontrolprøve (her kontrolprøve 100).

I præstationsprøvninger viser erfaringen /10/, at hvis sr (eller CVr) fundet ved præstationsprøvningen er større end kravet i bekendtgørelse 637, kan det med sikkerhed konkluderes, at kravet ikke er opfyldt. Det kan imidlertid ikke konkluderes modsat, at krav til standardafvigelse kan overholdes, såfremt sr, henholdsvis CVr, er mindre end kravet i Bekendtgørelse nr. 637, idet laboratoriernes dag-til-dag variation ikke belyses ved en præstationsprøvning. Hvis man projekterer denne viden over på denne metodeafprøvning, ses ud fra tabel 1-6, at kravet til standardafvigelsen på ±7% ikke er overholdt for prøvepar C/D og E/F, mens kravet er overholdt (med ovenstående forbehold) for de resterende prøvepar.

CV_r er forventeligt overensstemmende med og uden korrektion.

Tabel 1-6
Præcision med og uden korrektion fra tilsat standard.

1.5.3 Detektionsgrænse

Detektionsgrænsen er her defineret som

DL = t_0,995(df) * s_r

hvor sr er standardafvigelse for repeterbarhed for prøver med koncentration tæt på den forventede detektionsgrænse, t0,995 er Student‘s t-værdi på 99,5% konfidensniveau, og df er antallet af frihedsgrader for sr (jf. Miljøstyrelsens anbefalinger). Til udregning af detektionsgrænsen benyttes prøverne mindre end 5 gange den ønskede detektionsgrænse. Her benyttes prøvepar A/B. Repeterbarhedsstandardafvigelsen (s_r) for prøveparret A/B var 3,1 µg/L (jf. Tabel 1-5). Antallet af frihedsgrader er her (4-1)+(4-1)+(3+1) = 8, og ved tabelopslag blev t_0,995 fundet til 3,355.

Detektionsgrænsen blev derfor udregnet til 10 µg/L, hvorfor metoden opfylder det opstillede krav om en detektionsgrænse på 10 µg/L.

1.5.4 Vurdering af korrektion med genfinding af kontrolprøve

I den ovenstående tekst er det forsøgt at klarlægge, om der skal korrigeres med en genfinding af en kontrolprøve i metoden for at opnå en bedre genfinding. I afsnit 1.5.1 er det fundet, at denne korrektion ikke ændrede middelgenfindingen signifikant. Ligeledes er der ikke signifikant forskel på ligningerne i regressionsanalysen for sammenhængen mellem nominel værdi og den analyserede værdi. For at metoden skal overholde kravene til ekstern kontrol i kvalitetsklasse 3 /2/, må resultaterne for enkeltprøver kun afvige 30% fra den nominelle værdi. Korrektionen påvirker ikke resultaterne fra laboratorium 3, mens med korrektion kan laboratorium 1 og 2 overholde kravet for 32 ud af 34 analyseresultater mod kun 23 uden korrektion.

I afsnittet om præcision (1.5.2) er det fundet, at reproducerbarhedsstandardafvigelsen (s_R) er væsentligt højere for prøver med høje koncentrationer for det tilfælde, hvor der er korrigeret med genfindingen af en medanalyseret kontrolprøve.

Konklusion er, at korrektionen giver en bedre genfinding, når der ses på enkelte resultater, mens reproducerbarhedsstandardafvigelsen er dårligere. Det er vurderet, at stigningen af reproducerbarhedsstandardafvigelsen (s_R) er værre end gevinsten ved den forbedrede genfinding af den nominelle værdi, samt at en korrektion med genfindingen af en medanalyseret kontrolprøve vil gøre metoden endnu tungere. Derfor er denne korrektion ikke indført i metoden.13

2 Konklusioner og anbefalinger

Metodeafprøvningen viste, at den udviklede metode til bestemmelse af kationiske detergenter i afløbsvand var egnet til formålet. Denne konklusion skal dog tages med et forbehold på grund af det meget begrænsede deltagerantal, kun tre inklusiv Eurofins A/S. Det blev på baggrund af resultaterne konkluderet, at der ikke skal korrigeres i metoden med genfindingen af en medanalyseret kontrolprøve. Metodeafprøvningen viste kvalitetsparametre for metoden som anført nedenfor.

Korrekthed:
Middelgenfinding 108%, varierende fra 100 til 127% (4 prøvepar og 1 prøvepar med spike).

Repeterbarhed:
3,1 – 11 µg/L ved koncentrationer op til og med 5 gange detektionsgrænsen 50 µg/L (3 prøvepar).
5% i koncentrationsområdet over detektionsgrænsen på 50 µg/L (1 prøvepar).

Reproducerbarhed:
13-17 µg/L ved koncentrationer op til og med 5 gange detektionsgrænsen 50 µg/L (3 prøvepar).
27 % i koncentrationsområdet over detektionsgrænsen på 50 µg/L (1 prøvepar).

Detektionsgrænse:
Ud fra standardafvigelsen for repeterbarhed ved lav koncentration (mindre end 5 gange detektionsgrænsen) blev fundet, at en detektionsgrænse på 10 µg/L kan overholdes.

Detektionsgrænsen er her defineret som

DL = t_0,995(df) * s_r

hvor s_r er standardafvigelse for repeterbarhed for prøver med koncentration tæt på den forventede detektionsgrænse, t_0,995 er Student‘s t-værdi på 99,5% konfidensniveau, og df er antallet af frihedsgrader for s_r.

Det anbefales at udgive metoden, som anført i bilag B, som metode fra

Miljøstyrelsens referencelaboratorium for kemiske miljøanalyser og afprøve den i en præstationsprøvning med henblik på udpegning af laboratorier til analyse af kationiske detergenter under overvågningsprogrammet. Metoden i bilag B svarer til metoden (bilag A) udsendt i metodeafprøvningen, dog med ændringer i afsnit 6.4 og 6.5.

Den relativt store variation mellem laboratorierne kan formentlig forklares med, for det første, at det er en ny og relativt kompliceret metode og, for det andet, det meget beskedne deltagertal i metodeafprøvningen. Det anbefales at opsamle yderligere data om variation mellem laboratorierne efter den anbefalede præstationsprøvning. Såfremt disse data giver grundlag herfor, revideres metodens angivelse af reproducerbarhed.

3 Referencer

Bilag A: Metodeforskrift – udkast til metodeafprøvningen –

Bestemmelse af kationiske overfladeaktive stoffer i spildevand

Oktober 2002

5 Anvendelsesområde

Følgende metode kan anvendes til bestemmelse af opløste disulfinblåtaktive stoffer i spildevand, her specielt kationiske detergenter. Metodens kan anvendes til bestemmelse af kationiske detergenter i koncentrationsområdet 10-1000 µg/L. Det endelige koncentrationsområde fastlægges efter en metodevalidering.18

6 Princip

En kendt mængde vandprøve (maksimum 500 mL) filtreres og sættes på en PPL-kolonne. Herved opkoncentreres detergenterne i prøven, og interfererende komponenter i grundprøven fjernes. De kationiske detergenter separeres fra de nonioniske og anioniske detergenter på basiske aluminiumoxid-kolonner. Kvantificering udføres med en kolorimetrisk metode, der benytter disulfinblåt til dannelse af farvede komplekser. Absorbansen måles ved en bølgelængden 628 nm.19

7 Metodeoversigt

8 Udstyr og kemikalier

8.1 Spe-udstyr

Bond Elut, PPL-kolonner, 3 mL, 500 mg kolonnemateriale.

Mega BE-AL-B, alumina-kolonner, 6 mL, 1 g kolonnemateriale. Begge typer kolonner er straight barrel fra Varian.

SPE-kolonnerne anbringes på en VAC ELUT SPS 24 vacuum manifold fra Varian.

Slangesystemet består af 1/8” Teflon tubes, tube adapters (3 mL) og stainless steel weights fra Supelco.

8.2 Filtrering

Ved filtreringen anvendes 0,45 µm membranfilter, med en diameter på 47 mm af typen HVLP (Durapore) fra Millipore eller tilsvarende. Filtreringen udføres på en 1 L sugekolbe.

8.3 Kemikalier

Methanol, Merck, LiChrosolv Ethylacetat, Merck, LiChrosolv Chloroform, Merck, Pro Analysi 1-Butanol, Merck, Pro Analysi Trifluoreddikesyre, Merck, for synthesis.

1 B447 Disulfinblau, Chroma-Geselschaft. Ammoniumacetat, Merck, Pro Analysi

8.4 Reagenser

Det anvendte vand skal enten være demineraliseret, destilleret eller Milli-Q vand. Følgende reagenser fremstilles:

8.4.1  0,05 M H2SO4

Tilsæt forsigtigt og under omrøring 2,75 mL koncentreret svovlsyre, H₂SO₄

(densitet 1,84 g/mL) til ca. 500 mL vand. Afkøl til stuetemperatur og fortynd til 1000 mL.

8.4.2  1 M NaOH

40,00 g NaOH opløses i 1000 mL vand.

8.4.3 Disulfinblåt-stamopløsning

60 mg disulfinblåt overføres til en 100 mL målekolbe og opløses i 10 mL ethanol. Fortyndes til 100 mL med vand. Denne opløsning har 1 måneds holdbarhed.21

8.4.4 95:5 v/v chloroform/butanol-opløsning

50 mL butanol anbringes i en 1000 mL målekolbe. Fortyndes til 1000 mL med chloroform.

8.4.5 0,04 M citrat-buffer

21 g citronsyre monohydrat anbringes i en 1 l målekolbe, efterfulgt af 200 mL 1 M NaOH (4.4.2). Fortynd til 1000 mL med vand.

80 mL af denne opløsning blandes med ca. 120 mL 0.05 M H₂SO₄ (4.4.1). Den endelige pH skal være ca. 3. Denne opløsning har 1 uges holdbarhed.

8.4.6 Disulfinblåt-farvereagens

100 mL disulfinblåt-stamopløsning (4.4.3) blandes med 200 mL citrat-buffer (4.4.5) i en 500 mL skilletragt. Blandingen vaskes ved udrystning i skilletragt 3 gange med 50 mL butanol/chloroform-opløsning (4.4.4).

8.4.7 Renseopløsning

4500 mL 99% ethanol op til 5000 mL med koncentreret HCl (36%).

8.5 Standarder og kontroller

8.5.1 Stamopløsning 10,0 mg/L ADMBAC

Opløs 10,0 mg ADMBAC (benzalkoniumchlorid, alkyldimethylbenzylammoniumchlorid) i 1000 mL vand.

8.5.2 Stamopløsning 10,0 mg/L DSDMAC

Opløs 10,0 mg DSDMAC (distearyl-dimethyl-ammoniumchlorid) i 1000 mL methanol

8.6 Elueringssolventer

8.6.1 50:50 v/v methanol/ethylacetat med 10 mM ammoniumacetat

0,77 g ammoniumacetat overføres kvantitativt til en 1000 mL målekolbe med 500 mL methanol. Når alt ammoniumacetat er opløst tilsættes 500 mL ethylacetat.

8.6.2 95:5 v/v ethylacetat/methanol

5 mL methanol fortyndes op til 100 mL med ethylacetat.

8.6.3 95:5 v/v methanol/trifluoreddikesyre

5 mL trifluoreddikesyre fortyndes op til 100 mL med methanol.

8.7 Glausudstyr

50 mL høje bægerglas Urglas (50 mm)

10 mL graduerede spidsglas (graduering på 100 µL) 50 mL målekolber22 Små glastragte 500 mL skilletragte

Standard laboratorieglasudstyr

8.7.1 Vaskeprocedure

Alt glasudstyr vaskes i renseopløsningen ( 4.4.7) og skylles i Milli-Q vand 3 gange. Tørres i varmeskab (105° C).

8.8 Apparatur

Fotometrisk udstyr til måling ved en bølgelængde på 628 nm.

Magnetomrørerbord med plads til mindst 6 stk. 50 mL bægerglas.

9 Fremgangsmåde

9.1 Prøveudtagning og opbevaring

Prøverne udtages i Pyrex 1 L Blue Cap flasker. Prøverne skal analyseres staks.

9.2 Prøvefiltrering

Alle prøver filtreres før applikation med 0,45 µm membranfilter (4.2)

9.3 Opkoncentrering af detergenter i prøve

9.3.1 Klargøring og konditionering af PPL-kolonner

9.3.2 Applikation (opkoncentrering)

Prøven anbringes på PPL-kolonne med lav flowhastighed (minimum 45 min for 500 mL, hvilket er ca. 30 dråber per 10 sek.). Prøven overføres fra målekolber til kolonne med PTFE-slangesystem (Supelco). Kolonne tørres ved at sænke trykket til 0.5 bar. Kolonnen er tør når adsorbenten er blevet lys.

9.3.3 Eluering

Der elueres med 10 mL af 50:50 v/v methanol/ethylacetat med 10 mM ammoniumacetat (4.6.1). Elueringssolventet anbringes i målekolben hvor prøven var og siderne skylles grundigt. Derpå suges det over gennem slangesystemet og kolonnen.

Eluatet opsamles i et spidsglas(Efter dette trin er det muligt at gemme eluatet til næste dag i køleskabet) og der inddampes til et restvolumen på 200 µL.

9.4 Separation af de kationiske detergenter

9.4.1 Klargøring og konditionering af BE-AL-B kolonne

Kolonnen (Mega BE-AL-B) konditioneres med methanol og ethylacetat. Det er vigtig, at kolonnematerialet er i kontakt med methanolen i længere tid (min. 30 min.):

9.4.2 Genopløsning og applikation

Prøven (200 µL) genopløses i 5 mL ethylacetat og anbringes på ultralydsbad i 5 min.

Efterfølgende anbringes prøverne på vandbad ved 40°C.

Prøven overføres kvantitativt til kolonnen med pasteurpipette. Spidsglasset skyldes grundigt med 2 mL ethylacetat ved at trække solventet op i en pasteurpipette 10 gange og mellem hver gang lade det løbe ned langs siderne på spidsglasset. De 2 mL anbringes kvantitativt på kolonnen.

Til applikation anvendes ikke undertryk. Kolonnen må ikke løbe tør.

9.4.3 Eluering (isolering)

Elueringen udføres i to trin. I første trin fjernes de nonioniske detergenter. Denne fraktion kasseres. Herpå eluereres de kationiske detergenter.

a) Fjernelse af nonioniske detergenter

Eluer kolonnen med 6 mL eluent (4.6.2). Kolonnen må løbe tør.

b) Isolering af kationiske detergenter

Eluer kolonnen med 6 mL eluent (4.6.3). Opsaml eluatet i et 10 mL spidsglas.

På kolonnen findes stadigt anioniske detergenter. Denne fraktion kan eluereres med 6 mL 75:25 v/v methanol/2M HCl.

10 Kvantificering

10.1 Udfarvning af kationiske detergenter

Fraktion med de kationiske detergenter, anbringes i et 50 mL bægerglas.

Spidsglasset skyldes med kvantitativt med 4 mL methanol. . Inddampes i vandbad ved 50° C, under en svag nitrogen strøm. Efter en fuldstændig inddampning anbringes 10 mL disulfinblåt-farve i bægerglasset (4.4.6), 25 mL chloroform/1-butanol (4.4.4) og en magnet tilsættes. Urglasset placeres oven på bægerglasset. Blandingen omrøres kraftigt i 5 min, så vortex når ned til bunden i glasset.

Vand fjernes fra chloroformfraktionen ved at filtrere den igennem en tragt med en tot glasuld i bunden. Overføringen udføres med en 5 mL finpipette. Tragten er anbragt i en 50 mL målekolbe. Der måles direkte på filtratet. Der måles ved 628 nm med en 10 mm kuvette.

10.2 Standardkurve

Der kvantificeres ud fra en 4 punkts kalibreringskurve, med koncentrationer i intervallet 0-75 µg. Af DSDMAC-standarden (4.5.2) med en koncentration på 10,0 mg/L udtages 0; 2,5; 5,0 og 7,5 mL (svarende til 0; 25; 50 og 75 µg) som anbringes i 50 mL bægerglas. Disse behandles som de inddampede prøver (6.1). En kalibreringskurve fremstilles ud fra de sammenhørende værdier af mængder og absorbanser.

10.3 Kontrolprøver

Der fremstilles 2 stk. kontrolprøver ved at fortynde 5,0 mL ADMBAC-standard (4.5.1) op til 500 mL med vand. Disse analyseres identisk med spildevandsprøver. (5) Ligeledes medanalyseres 2 blindprøver. Blindprøverne er 500 mL Milli-Q vand.

Der fremstilles 2 stk. kalibreringskontrolprøver. Hver kontrolprøve fremstilles ved at udtage og anbringe 5,0 mL ADMBAC-standard (4.5.1) i et 50 mL bærerglas. Herefter behandles de som de indampede prøver (6.1).

10.4 Resultat

Ud fra prøvens nettoabsorbans (prøvens absorbans minus blindprøvernes absorbans) aflæses af kalibreringskurven den målte opløsnings indhold af kationiske detergenter. Beregn indholdet i den originale prøve ved

hvor X = prøvens indhold af kationiske detergenter, µg/L

A = indholdet af kationiske detergenter aflæst af kalibreringskurven, µg B = rumfang prøve taget i arbejde, L (normalt 0,50 L)

11 Sikkerhed

Alt arbejde med organiske opløsningsmidler foregår i stinkskab. Ved arbejde med chloroform anvendes 4H sikkerhedshandsker (PLUM Hudsikkerhed) eller tilsvarende. Vandige fraktioner, der har været i kontakt med chloroform, bobles igennem i stinkskabet natten over. Glasudstyr, der har været i forbindelse med chloroform, damper af natten over i stinkskab.

12 Litteraturliste

Theil, K.-H., (2002). Bestemmelse af ioniske og nonioniske detergenter i slam og spildevand. Speciale ved Københavns Universitet

Kloster, G., Schoester, M. Prast, H., (1994). Entwicklung eines einheitlichen trennungsganges zur anreicherung aller drei tensidklassen aus umweltproben. Tenside Surf. Det., 31(1), 23-28.

DIN 38409 Teil 20 (1989). Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrößen (Gruppe H) – Bestimmung der disulfinblau-aktiven Substanzen (H 20). 

Bilag B: Metodeforskrift