| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Overlevelse af enterokokker og protozoen Cryptosporidium parvum i urin fra mennesker

1 Indledning og baggrund for undersøgelserne

Resultaterne af en tidligere undersøgelse finansieret af Miljøstyrelsen (Dalsgaard og Tarnow, 2001) indikerede, at kimtal 37ºC og antal enterokokker, efter et markant fald efter 1-2 måneders lagring af separeret human urin, blev øget ved en efterfølgende 3-6 måneders lagring. Resultaterne tillod dog ikke en sikker vurdering af om der var tale om en reel vækst af kimtal 37ºC og antal enterokokker.

Den samme undersøgelse viste også, at der forekom æg (oocyster) af parasitterne Cryptosporidium parvum og Giardia spp. i flere opsamlingstanke med human urin. Begge parasitter er protozoer og vigtige årsager til tarminfektioner hos mennesker. Deres udbredelse er dog ukendt i Danmark. Undersøgelserne viste endvidere, at æg af C. parvum var levende og medførte infektion i mus. Antal æg i urinprøverne var dog for lavt til gennemførsel af regelrette infektionsundersøgelser i mus.

Der var således et behov for at få fastlagt om antal kim ved 37ºC og enterokokker vil kunne øges ved lagring af separeret urin. En eventuel vækst af disse bakteriegrupper vil kunne indikerer, at egentlige bakterielle smitstoffer også vil kunne vokse i lagret urin, ligesom en kimtalsvækst ville kunne stille spørgsmål ved anvendeligheden af de to parametre som bakterielle hygiejne indikatorer i urin. Trods påvisningen af C. parvum og Giardia spp. i separeret urin er det dog usikkert hvor længe parasitæggene kan overleve og opretholde deres infektivitet efter eksponering i lagret urin.

Projektet havde følgende formål:

Bakteriologisk del, projekt 1:

• at fastlægge om antal kim ved 37ºC og enterokokker øges ved lagring af separeret urin
• at arts- og type (DNA-fingeraftryk) bestemme bakterieisolater som giver anledning til vækst/eftervækst.

Parasitologisk del, projekt 2:

• at fastlægge viabilitet af C. parvum og Giarida spp. æg i lagret separeret human urin
• at fastlægge infektiviteten af C. parvum og eventuel Giradia spp. æg ved podningsforsøg med mus.

1.1 Mikroorganismer og smitstoffer i urin og fækalier

1.1.1 Urin

Hos raske personer er urinen i urinblæren samt den øvre del af urinrøret steril. Ved transport af urinen i og ud af urinrøret blandes urinen med forskellige typer hudbakterier og når urinen forlader kroppen indeholder den typisk <10.000 bakterier per ml (Jönsson et al., 2000).

1.1.1.1 Urinvejsinfektion
Ved urinvejsinfektion udskilles urin med høje koncentrationer( > 105 per ml) af patogene (smitsomme) bakterier (Thaysen et al., 1986), der i 80% af tilfældene er E. coli. Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella-Enterobacter gruppen og enterokokker findes dog også som årsag til urinvejsinfektioner hos mennesker (Murray et al., 1995). Det er usikkert i hvor stor udstrækning, at disse patogene mikroorganismer overlever og spredes i miljøet (Jönsson et al., 2000). Der findes andre smitstoffer som kan spredes fra mennesker med urinen, herunder bakterierne Leptospira og Salmonella typhi/paratyphi, hvor spredning først er muligt når infektionen bliver systemisk, samt parasitten Schistosoma spp. som forårsager bilharziose hos mennesker. Disse sygdomme er dog meget sjældne under danske forhold, og man må formode at sandsynligheden for at finde disse smitstoffer i urin fra mennesker er lav.

1.1.2 Fækalier

I et urinseparerende toilet er den største risiko for tilførsel af smitstoffer til urinen forurening med fækalier. Risikoen synes størst, når brugerne er børn eller ved diarrétilfælde, men toiletudforming og brugererfarenhed har også betydning for tilblanding af urinen med fækalier. Diarrétilfælde, hvor smitstoffer findes i afføringen i høje koncentrationer (>107 bakterier pr. gram), repræsenterer den største risiko for tilførsel af smitstoffer til urinen.

1.1.2.1 Bakterier
De vigtigste bakterier som forårsager mave-tarminfektioner under danske forhold og som kan forventes at findes i fækalt-forurenet urin tilhører slægterne Salmonella, Campylobacter, Yersinia samt visse typer af E. coli. Andre smitstoffer som kan findes i fækalier inkluderer slægterne Listeria, Clostridium og Bacillus. Disse bakterier er dog relativt sjældne årsager til sygdom hos mennesker. Under tropiske forhold er også Vibrio cholerae og Shigella typiske årsager til diarré hos mennesker. Ved diarré forårsaget af smitsomme bakterier vil et menneske i den akutte sygdomsfase typisk udskille >107 bakterier per gram fæces. Bakterier vil dog også blive udskilt i varierende tidsperioder før og især efter sygdomssymptomer optræder.

1.1.2.2 Virus
De vigtigste virus der kan spredes med humane fækalier er enterovirus (poliovirus, coxsackie virus), Hepatitis A, Norwalk like-virus (calicivirus), adenovirus og rotavirus (B. Böttiger, Statens Serum Institut, personlig meddelelse) (Murray et al., 1995). Ved diarré forårsaget af virus vil et menneske typisk udskille 107-1010 vira per gram fæces. Selvom der forekommer begrænset viden om hyppigheden af mavetarm-infektioner forårsaget af virus, bl.a. grundet mangelfulde påvisningsmetoder, menes virus at være en hyppig årsag til sådanne infektioner. Virus må derfor forventes at være tilstede i fækalt-forurenet urin.

1.1.2.3 Parasitter
De vigtigste parasitter der kan tilføres urin i Danmark tilhører grupperne rundorme, bændelorme og protozoer. De hyppigste forekomne arter er: Ascaris lumbricoides (spolorm), Enterobius vermicularis (børneorm), Taenia saginata (bændelorm), Dipyllobotrium latum (menneskets brede bændelorm), samt protozoerne Cryptosporidium parvum og Giardia duodenalis. Mennesker kan smittes med spolorm og børneorm direkte ved kontaktsmitte eller ved oral indtagelse af fækalt forurenede fødevarer. C. parvum og G. duodenalis kan smitte via fækalier fra dyr og mennesker. Betegnelsen Giardia diskuteres stadig i fagkredse, men der synes enighed om anvendelse af betegnelsen Giardia duodenalis (før benævnt Giardia lamblia eller intestinalis), og denne betegnelse vil efterfølgende blive brugt i rapporten. Æggene fra bændelorm skal optages og udvikles i en mellemvært (pattedyr eller fisk), før en infektion kan viderebringes til et andet menneske.

Hvis en person som benytter et separationstoilet udskiller parasitter med fækalier, kan disse tilføres urinen gennem fækal forurening. Selvom parasitter kan forårsage sygdomssymptomer, vil mennesker ofte have parasitinfektioner uden at vise sygdomstegn og den udskilte parasitmængde (æg) hos sådanne individer varierer betydeligt.

Forekomsten af rundorme, bændelorm og protozoer er ukendt, men menes lav i den danske befolkning.

1.2 Indikatorer til undersøgelse for forekomst af smitstoffer

1.2.1 Bakterielle indikatorer

Enterokokker
Enterokokker anvendes i flere sammenhænge som indikator på fækal forurening. Enterokokker er Gram-positive, katalase-negative kokker, der optræder parvis eller i korte kæder.

Definitionen af slægten Enterococcus omfatter nu 23 arter herunder arterne: E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum og E. malodoratus (Facklam et al. 2002). Enterokokker udgør en del af gruppen af fækale streptokokker som inkluderer S. bovis, S. suis, og S. equinus. Analyse for enterokokker foretrækkes i dag i stedet for analyse for fækale streptokokker. De to betegnelser anvendes ofte synonymt, selvom dette ikke er helt korrekt.

Enterokokker findes i menneskers og dyrs tarmkanal og udviser generelt større resistens overfor udtørring, varme og andre ydre påvirkninger end E. coli, Salmonella og de fleste andre Gram-negative sygdomsfremkaldende bakterier. Ved at anvende enterokokker som indikatorbakterium synes der at være en god sikkerhed for, at henfaldet af disse modsvares af et tilsvarende eller hurtigere henfald af sygdomsfremkaldende bakterier.

Coliforme bakterier
Gruppen af coliforme bakterier er Gram-negative, stavformede, ikke-sporedannende bakterier som er laktose fermenterende ved 35-37ºC med produktion af syre og gas. Bakterier der opfylder disse betingelser tilhører familien Enterobacteriaceae, som inkluderer E. coli, samt medlemmer af slægterne Enterobacter, Klebsiella og Citrobacter (Hurst et al., 1997). Værdien af coliforme bakterier som fækale indikatorbakterier er tvivlsom, da bakterierne kan stamme fra andre miljøer end menneskers og dyrs mavetarmkanal, eksempelvis ikke-fækalt materiale tilført komposttoiletter. De er derfor mindre egnede som indikatorer for fækal forurening.

Termotolerante coliforme (fækale coliforme) bakterier
Gruppen af termotolerante coliforme bakterier opfylder alle kriterierne i definitionen af totale coliforme bakterier. De skal endvidere kunne fermenterer laktose med produktion af syre og gas ved 44,0oC. Ved optælling af bakteriekolonier uden efterfølgende test for produktion af syre og gas kan disses antal angives med betegnelsen suspekte. Disse udvidede testkriterier sammenlignet med gruppen af coliforme bakterier betyder, at bakterierne næsten udelukkende stammer fra menneskers og dyrs tarmkanal. En undtagelse er dog slægten Klebsiella, der er blevet isoleret fra miljøprøver uden fækal forurening (Hurst et al., 1997). Termotolerante coliforme er således en bedre og mere specifik indikator for fækal forurening end totale coliforme bakterier.

E. coli
E. coli tilhører gruppen af termotolerante coliforme og findes udelukkende i dyrs og menneskers tarmkanal. Dette gør E. coli til den bedste indikator for fækal forurening i gruppen af coliforme bakterier. E. coli adskilles fra andre termotolerante coliforme ved mangel på urease enzymet og tilstedeværelse af enzymet beta-glucuronidase. Som indikatorbakterium er E. coli således velegnet til indikation på en frisk fækal forurening. E. coli overlever oftest kortere tid end enterokokker i det ydre miljø.

Antal udskilte indikatorbakterier i fækalier

I fækalier findes høje koncentrationer af de nævnte indikatorbakterier. Et raskt menneske udskiller i alt ca. 107-109 indikatorbakterier pr. gram fæces med nogen variation mellem de enkelt indikatorer.

Kimtal ved 37ºC
De hyppigste anvendte metoder til påvisning af det totale antal af bakterier, som kan vokse ved 37ºC, vil påvise enterokokker, E. coli og flere andre fækale indikatorbakterier, dog undtaget slægten Clostridium, som kun vokser ved strikt anaerobe forhold (iltfrie forhold). Bakterier, som vokser ved 37ºC, vil dog også tilhøre en række andre slægter, der findes i fækalier, hvoraf flere kan forårsage sygdom hos mennesker. Kimtal ved 37ºC anvendes derfor som en generel indikator for tilstedeværelsen af smitstoffer, ligesom et øget antal også kan indikerer en eventuel bakteriel vækst i lagret urin.

1.2.2 Virale indikatorer

Bakteriofager er virus som kun inficerer bakterier. Fagernes overlevelse i miljøet anvendes i stigende grad til at studere overlevelsen af sygdomsfremkaldende virus i miljøet. Flere forskellige bakteriofager har været foreslået som indikatorer bl.a. F-specifikke bakteriofager og colifager (Lewis, 1995; Tree et al., 1997; Armon et al., 1995). F-specifikke bakteriofager er især aktuelle som indikatorer, da de udviser stor resistens i miljøet og kan påvises ved relative simple og billige laboratoriemetoder. Betegnelsen F henviser til fagernes affinitet for bakteriers flageller.

Salmonella typhimurium fag 28B (Lilleengen 1948) har p.g.a. en relativ høj overlevelsesevne i miljøet sammenlignet med andre fager været anvendt i sporingsstudier til påvisning af forurening mellem afløb og rentvandsreservoir (Stenström 1996) og til at spore forurening af grundvand ved vanding med afløbsvand (Carlander et al. 2000, Johansson et al. 1998). S. typhimurium fag 28B har desuden været anvendt som hygiejneindikator ved kontrollering af termofile processer f.eks. ved vådkompostering (Eller 1995, Norin et al. 1996) og pasteurisering (Sahlström et al. 2003). Fag 28B er 60 nm i diameter og resistent overfor høje pH-værdier.

1.2.3 Parasitære indikatorer

I dette projekt blev Cryptosporidium parvum benyttet som indikator på protozoers overlevelse i lagret urin fra mennesker. Protozoer er små encellede parasitter som udvikles i tarmkanalen af fugle og pattedyr, inklusive mennesket. Der findes forskellige undertyper af Cryptosporidium hvoraf C. parvum og C. hominis kan smitte mennesker. C. parvum er en relativ almindelig infektion i kvægbruget, som især giver sygdomsproblemer hos spædkalve (Enemark, 2002). Da Giardia æg er mere følsom overfor miljøpåvirkninger end Cryptosporidium er der ikke lavet forsøg med overlevelse af Giardia i dette projekt.

C. parvum blev første gang sat i forbindelse med infektion hos mennesker i midten af 70'erne og der er siden da rapporteret et stigende antal tilfælde af infektion med denne parasit både i udviklingslande og i den industrialiserede del af verden. Udbrud i den industrialiserede del af verden skyldes ofte en forurening af vandreservoirer og overfladevand som benyttes til drikkevand, hvorimod en forurening af grundvand med denne parasit ikke anses for at være særlig sandsynlig. Til de største udbrud af C. parvum-infektion hører et udbrud i 1994 i Milwaukee i USA, hvor mere 400.000 mennesker blev angrebet af diarré (Mac Kenzie et al., 1994).

I Danmark blev der i 2002 diagnosticeret i alt 38 tilfælde af cryptosporidiose ved Statens Seruminstitut (Anonymous, 2003). Tidligere undersøgelser har vist at i ca. 80% af diagnosticerede tilfælde af cryptosporidiose er der tale om infektioner erhvervet i udlandet.

Hos mennesket er infektionen problematisk og i visse tilfælde livstruende hos individer med et svækket immunforsvar (specielt AIDS patienter). Hos voksne raske individer er infektionen derimod selvbegrænsende med en inkubationstid på 2-10 dage samt et sygdomsforløb på op til 2 uger med vandig diarré, mavekramper og let feber. Hos nogle individer ses et symptomløst forløb.

C. parvum er en obligat intracellulær parasit, som gennemgår sin ukønnede og kønnede formering inden i tarmslimhindecellerne. Livscyklus, som er skitseret i figur 1, består kort af de følgende faser. De angivne numre og bogstaver i parentes henviser til figuren:

• oocyster/æg af C. parvum optages via fækalt forurenet vand eller fødevarer (3)
• i mavetarmkanalen frigiver æggene såkaldte sporozoiter, som er i stand til at fastgøre sig til tarmslimhindecellerne og smitte disse
• ukønnet formering som producerer merozoiter der kan smitte flere tarmslimhindeceller (c, d, e)
• kønnet formering som resulterer i produktion af nye æg indeholdende de smitsomme sporozoiter (f, g, h, i, j, k).
• de smitsomme æg udskilles dernæst med værtsdyrets/menneskets fækalier (1)

Perioden fra de smitsomme æg optages til nye æg kan findes i det smittede individs fækalier benævnes præpatensperioden og er for C. parvums vedkommende 2-14 dage afhængig af hvilken dyreart eller menneske der er vært for infektionen.

Figur 1 C. parvum livscyklus.

Nærmere detaljer af livscyklus er beskrevet i teksten ovenfor.

Fra hjemmesiden for: Division of Parasitic Diseases, Center for Disease Control and Prevention, USA [ad2]; http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/image_library.htm

C. parvum har en relativ god overlevelse i miljøet. Overlevelse i vand har vist sig at være op til ca. seks måneder ved temperaturer omkring 4ºC (Fayer et al., 1998; Olsson et al., 1999), hvorimod overlevelsen i urin ifølge svenske undersøgelser er markant kortere, nemlig omkring to måneder ved 4ºC (Höglund og Stenström, 1999). Danske undersøgelser fra 2001 har dog peget på en noget længere overlevelse af æg af C. parvum i lagringstanke til urin fra mennesker, nemlig op til seks måneders overlevelse ved temperaturer under 10ºC (Dalsgaard og Tarnow, 2001). Udover temperatur er koncentrationen af ammoniak også af betydning for C. parvum æggenes overlevelse i miljøet. Således overlever æggene kortere tid ved høj temperatur og ammoniak koncentration i det omgivende miljø.

I dette projekt blev mus benyttet til podningsforsøg for med stor sikkerhed at kunne fastlægge at æg af C. parvum som var fundet ikke levende i et farveassay heller ikke var smitsomme. Den anvendte metode til at teste om æggene er smitsomme ved podningsforsøg i museunger er almindelig anerkendt og beskrevet i rapportens metodeafsnit. Det skal dog bemærkes, at man i nær fremtid forventes at kunne udføre testen for ægs smitsomhed med større sikkerhed i celle assays. Assays baseret på forskellige cellelinier bliver i disse år udviklet og vil i vid udstrækning kunne reducere brugen af levende forsøgsdyr.

1.2.4 Valg af måleparametre

1.2.4.1 Mikrobiologiske måleparametre
Med henvisning til projekternes formål beskrevet i forordet og kapitel 1, blev overlevelse af følgende mikrobiologiske parametre i separeret lagret human urin undersøgt:

• Enterokokker
• Kimtal ved 37ºC
• Æg (oocyster) af protozoen C. parvum

Protozoer af arten Giardia spp. blev ikke undersøgt for deres overlevelse i human urin, idet C. parvum anses for at være repræsentativ for protozoers overlevelse i urin. Tidligere sammenlignende undersøgelser af disse to protozoers overlevelse har vist, at Giardia er langt mere følsom overfor miljøpåvirkninger end Cryptosporidium (Olson et al., 1999). Det må derfor antages, at Cryptosporidium er en bedre indikator end Giardia til fastlæggelse af overlevelsestider for protozoer.

1.2.4.2 Fysisk-kemiske måleparametre
Følgende fysisk-kemiske måleparametre blev målt i den separerede lagrede human urin:

• pH
• Ammonium

Disse parametre vides at være af betydning for mikroorganismers overlevelse i forskellige medier, inklusiv i urin.

I urinlagringstanke vil pH relativt hurtigt stabilisere sig på omkring 9, idet kvælstof bundet i urea frigøres som ammonium-ioner der så igen vil frigøres som ammoniak (NH₃). Der etableres derefter hurtigt en ligevægt mellem ammoniak og ammonium (NH₄⁺). Ved at måle ammonium koncentration i urinen får man et indirekte mål på den aktuelle ammoniak-koncentration, som er relativt stabil ved et pH på ca. 9.

Det er vist, at C. parvum æg og bakteriers overlevelse i urin ikke alene er bestemt af pH men også af ammoniak koncentrationen (Höglund et al., 1999), samt at den negative effekt af ammoniak på overlevelsen af C. parvum æg er større ved høje temperaturer (Jenkins et al., 1998).

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Januar 2004, © Miljøstyrelsen.