Økologisk byfornyelse og spildevandsrensning, 45 – Overlevelse af enterokokker og protozoen Cryptosporidium parvum i urin fra mennesker

Overlevelse af enterokokker og protozoen Cryptosporidium parvum i urin fra mennesker

Sammenfatning og konklusioner

Baggrunden for undersøgelserne i denne rapport var resultater fra et tidligere projekt finansieret af Miljøstyrelsen: "Vurdering af muligheder og begrænsninger for recirkulering af næringsstoffer fra by til land – Mikrobiologiske undersøgelser af lagret urin fra separationstoiletter" (Dalsgaard og Tarnow, 2001), som indikerede at nogle indikatorbakterier kunne udvise vækst i separeret lagret human urin. Der fandtes endvidere få protozoæg af Cryptosporidium parvum i enkelte urinopsamlingstanke som overlevede selv efter lang tids lagring, ligesom sådanne æg også kunne give infektion af mus. På denne baggrund ønskede Miljøstyrelsen at få disse problemstillinger yderligere belyst i kontrollerede laboratorieforsøg med henblik på at indhente data som ville kunne bruges til fastsættelse af hygienekrav og lagringstider for human urin som eventuelt påtænkes anvendt til landbrugs- og havebrugsformål.

Undersøgelserne bestod af to dele; dels en bakteriologisk del som adresserede spørgsmålet om mulig eftervækst af enterokokker og kimtal ved 37ºC i lagret separeret urin fra mennesker og dels en parasitologisk del som undersøgte spørgsmålet om protozoen C. parvum's overlevelse i lagret separeret urin fra mennesker.

Bakteriologisk del

Der blev udtaget urin fra 4 forskellige lokaliteter, repræsenterende dels tættere boligbyggeri (Lokalitet 1 og 2) og dels kolonihavehusstande (Lokalitet 3 og 4). Urinen blev lagret ved 4, 10 og 20ºC i 6 måneder. Med ca. 1 måneds intervaller blev pH og ammoniumkoncentration målt samtidig med at den mikrobiologiske kvalitet blev bedømt udfra antallene af indikatorbakterierne enterokokker, kimtal ved 37ºC og suspekte termotolerante coliforme.

pH holdt sig stabilt omkring en værdi på 8,5 til 9, men var højest i urin fra lokalitet 3 og 4 hvor der havde været mindst tilblanding af vand fra toiletskyl. Ammoniumkoncentrationen var ligeledes stabil og højest ved Lokalitet 3 og 4 (ca. 8 ppm for åben tank og 16-17 ppm for lukket tank). Det højere pH og ammoniumniveau i den relativt mere koncentrede urin fra lokaliteterne korrelerede med lavere startkimtal og dårligere kimtalsoverlevelse.

Efter en generel reduktion i antal enterokokker til under detektionsgrænsen (1 cfu per ml.) efter 1-4 måneders lagring, blev der efter 5-6 måneders lagring observeret en svag stigning i antal enterokokker efter lagring ved 4, 10 og 20ºC. Denne stigning tyder på en øget overlevelse og/eller evne til multiplikation af enterokokker ved langvarig lagring af urin ved flere temperaturer. Enterokokker syntes derfor uegnede som indikatorer på fækel forurening i urin, idet deres forekomst kan indikere en længere overlevelse af eventuelt tilstedeværende patogene bakterier end hvad der reelt er tilfældet. Det bør istedet overvejes at anvende E. coli som indikator da denne syntes mere følsom i urin sammenlignet med enterokokker.

Da andre bakterieslægter og arter end Enterococcus eventuelt kan vokse på Slanetz & Bartley agarplader var det vigtigt at få bestemt slægt og art af de bakteriekolonier som voksede på agarpladerne. Det var endvidere også vigtigt at få fastlagt om det var enkelte bakteriestammer (kloner) eller mange forskellige stammer som kunne overleve og opformeres i lagret urin. Dette blev fastlagt ved Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE; "DNA fingeraftryk") typning af bakterieisolaternes DNA.

Der blev ialt udvalgt 34 bakterieisolater fra Slanetz & Bartley agarplader, som alle kunne identificeres som tilførende slægten Enterococcus ved traditionel biokemisk karakterisering og PCR. Langt hovedparten af testede isolater fra Lokalitet 1 var E. faecium, som havde identisk PFGE type A. Dette indikerer, at disse isolater er tæt beslæget, eksempelvis kan de stamme fra samme person og/eller de er klonalt relateret som følge af opformering i urinen. Det ser således ud til at en identisk E. faecium stamme udviste øget overlevelse og/eller evne til multiplikation i urinflaskerne ved de tre temperaturer. E. faecium betragtes normalt som en strikt fækal enterokokart, som kun i yderst begrænset omfang kan forekomme og overleve i det eksterne miljø.

Typning af E. faecium isolater fra Lokalitet 2 viste tre forskellige PFGE typer. Der forekom således flere forskellige E. faecium stammer i urinen som overlevede længere tids lagring og/eller havde evnen til at kunne opformeres. I urin fra Lokalitet 2 blev alle 12 bakterieisolater bestemt som E. gallinarum, en enterokokart som normalt forekommer hos fjerkræ. E. gallinarum blev isoleret fra såvel åben og lukket tank ved de tre undersøgte temperaturer og havde alle en identisk PFGE type F. Det ser således ud til at en identisk E. gallinarum stamme udviste øget overlevelse og/eller evne til multiplikation i urinflaskerne ved de tre temperaturer. Det er uvist om E. gallinarum stammen er blevet tilført urinopbevaringsbeholderne via afføring eller fra jordmiljøet, eksempelvis via utætheder i beholderne.

Der blev kun påvist en begrænset reduktion i kimtal ved 37ºC i løbet af 6 måneders lagring af urin og også for denne parameter fandtes der tegn på genvækst. Anvendelse af kimtal ved 37ºC til vurdering af den hygiejniske kvalitet af lagret urin syntes således begrænset på grund af genvækst.

Parasitologisk del

Der blev udtaget urin fra 2 forskellige lokaliteter, repræsenterende tættere boligbyggeri (Lokalitet 1 og 2). Urinen blev lagret ved 4, 10 og 20ºC og med ca. en måneds interval måltes der pH, ammoniumkoncentration samtidig med at den mikrobiologiske kvalitet blev bedømt udfra antallene af indikatorbakterierne enterokokker, kimtal ved 37ºC og suspekte termotolerante coliforme. Semipermeable kapsler indeholdende æg af protozoen C. parvum blev tilsat og udtaget efter 14 dage, 1 måned og 2 måneder. Æggene (oocysterne) blev dernæst undersøgt for deres levedygtighed (viabilitet) og smitsomhed (infektivitet) i mus.

Oocyster af C. parvum overlevede relativt kort tid i human urin, <14 dage ved 20ºC og 1-2 måneder ved 10 og 4ºC, ligesom ingen mus kunne inficeres med oocyster fra urin der havde været lagret 14 dage ved 20ºC, 1 måned ved 10ºC og 2 måneder ved 4ºC. Der var således god overensstemmelse mellem resultater fra viabilitetsundersøgelser og podningsforsøg. Bestemmelse af manglende levedygtighed (<2% viable æg) med den anvendte cellefarvningsmetode til differentiering af levende og døde æg syntes således at kunne bruges som indikator for æggenes manglende smitsomhed .

I modsætning til tidligere danske undersøgelser, men i overensstemmelse med svenske undersøgelser, fandtes det derfor at urin der har været lagret i minimum 2 måneder var fri for levedygtige (viable) og smitsomme (infektive) æg af C. parvum. En lagring på to måneder ville også betyde elimination af Giardia æg, idet denne protozo vides at være mere følsom overfor miljøpåvirkninger end Cryptosporidium. Der er derfor ikke lavet forsøg med overlevelse af Giardia i dette projekt.