| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Pesticiders påvirkning af planter og alger i vandmiljøet

3 Giftigheden af herbicider i vand

• 3.1 Materiale og Metoder
  • 3.1.1 Andemads-test
  • 3.1.2 Alge-test
  • 3.1.3 Litteratur-studie
• 3.2 Resultater og Diskussion
  • 3.2.1 Laboratorie tests på 10 herbicider
  • 3.2.2 Database-analyse

Hvor giftige er herbicider i vandmiljøet i forhold til det terrestriske miljø? Som nævnt, kunne man forestille sig at de havde en større effekt i vand end på land, da eksponeringen kan vare i længere tid, og da hele den neddykkede del af planten er omgivet af herbicidet modsat situationen i det terrestriske miljø, hvor kun dele af planten rammes af sprøjtevæsken. Omvendt bliver herbicidet meget fortyndet, når det udsprøjtes på en vandoverflade. Man kunne derfor forestille sig, at optagshastigheden, som er diffusiv og dermed bestemt af bl.a. herbicid-koncentrationsforskellen mellem vand/dråbe og plantevæv, i vandmiljøet vil være så langsom, at planten kan nå at afgifte det optagne herbicid, inden det når at påføre nogen skade.

3.1 Materiale og Metoder

Vi testede den akvatiske toksisitet af 10 forskellige herbicider, der repræsenterer fire forskellige fysiologiske virkemåder, på flydebladsplanten Lemna minor, liden andemad, og grønalgen Pseudokirchneriella subcapitata, tidligere kendt som Selenastrum capricornutum. Vi testede både de tekniske produkter og de formulerede produkter, som bruges og usprøjtes af jordbruget. Dosis-responskurverne blev sammenlignet med de målte herbicid-koncentrationer i vandmiljøet. Derudover lavede vi en litteratursøgning i The e-Pesticide Manual (Tomlin, 2002) på de ca. 150 herbicider, hvor der fandtes akvatiske toksisitetsdata.

3.1.1 Andemads-test

Lemna minor stammer fra en dam på Frederiksberg og er blevet steriliseret med hypochlorit (Landolt & Kandeler, 1987). Testen tager udgangspunkt i OECD's guideline for Lemna-tests (OECD guideline for testing of chemicals, 2000). Den sterile kultur dyrkes i autoklaveret K-medie (Maeng & Khudairi, 1973), ved pH 5, i Ehrlenmeyer kolber lukket med en tot vat ved 24°C og en konstant lysintensitet på ca. 100 mol m^-2 s^-1 (PAR). Ved forsøgets start overføres en plante, frond, til 10 ml medie tilsat herbicid. Planterne fotograferes med et digitalt kamera og placeres i vækstskab under overnævnte vækstforhold (Figur 2). Efter 7 dage fotograferes planterne atter, og start og slut overfladeareal bestemmes ved digital billedbehandling i Photoshop 7.0. Plantenes relative vækstrate bestemmes ved: (ln A_slut-ln A_start)/T, hvor A_start er arealet ved forsøgets start, A_slut er arealet ved forsøgets afslutning og T er det tidsrum hvori planterne har vokset angivet i dage. I disse forsøg har vi anvendt 6 kontrolplanter og 6 til 8 doseringer i 3-6 replika. Planternes vækstrate som funktion af herbicid-koncentrationen beskrives med en log-logistisk dosis-respons model (Streibig et al., 1993):

Hvor U er plantens respons, i dette tilfælde vækstrate, d og c er den øvre og nedre grænse for plantens respons ved henholdsvis nul og en uendelig stor herbicid koncentration, EC₅₀ er den herbicid koncentration, der skal til for at halvere responsen mellem den øvre og nedre grænse, og b er proportionel med hældningen i punktet EC₅₀.

Figur 2. a) Placering af bakker med Lemna minor i klimaskab. Hver bakke indeholder 6 uafhængige brønde med hver en plante. b) Fotografering af start-planter sammen med en standard cm².

3.1.2 Alge-test

Algetesten er beskrevet af Arensberg et al., 1995 og Mayer et al., 1997 og er i overensstemmelse med ISO's standard test for alger (International Organization for standardization, 1989). Forsøget startes ved, at man tilsætter alger fra en stamkultur til 4 ml ISO Standard 8692 vækstmedie (pH 8) i en 20 ml vial tilsat herbicider. Der er i hvert forsøg anvendt 2 replika af 8 herbicid koncentrationer og 6 kontrol uden herbicid. Algerne tilsættes i en koncentration på ca. 10 000 alger ml^-1. Koncentrationen på stamkulturen er bestemt spektrofotometriskt. Til måling af start pigmentindhold udtages der straks 400 l af algesuspensionen (Figur 3) til et reagensglas med skruelåg, hvortil der tilsættes 1,6 ml acetone mættet med MgSO₄ (12 g l^-1). Prøverne stilles mørkt. Vialene med alger og vækstmedie placeres på et rystebord belyst nedefra med en intensitet på ca. 80 μmol m^-2 s^-1 (PAR). Rystebordet indstilles til 300 omdrejninger min^-1, hvilket sikrer god omrøring af algerne. Der udtages prøver på dag 1 og dag 2, som beskrevet, hvorefter forsøget afsluttes og slut pH måles. pH varierer aldrig mere end 0,5 pH enheder. På dag tre kan algernes pigment fluorescens (primært klorofyl a) måles på et fluorometer med en exitations-bølgelængde på 420 nm og en emmisionsbølgelængde på 670 nm. Algernes vækstrate udregnes ved at udføre en liniær regresion på ln til fluorescensen på dag 0, 1 og 2 og angives i enheden d^-1. Kontrol vækstraterne ligger mellem 1,6 og 2,0 d^-1. Dosis respons forløbet beskrives med en log-logistisk model (Streibig et al., 1993.)

Figur 3. Der udtages prøver fra algesuspensionen ved start og de to følgende dage, så væksten i algernes biomasse kan følges. Algernes biomasse estimeres ud fra fluorescensen af pigmenterne, (primært klorophyl a) ekstraheret i acetone. Der er et lille hul i låget til vialen, der sikrer kulstofligevægt mellem luft og algemediet.

3.1.3 Litteratur-studie

Samtlige herbicider i The e-Pesticide Manual med toksisitetsdata på alger blev udvalgt. Udover toksisiteten på alger blev stoffernes virkemåde (klassificeret efter The Herbicide Resistance Action Committee (HRAC) classification (2000) (Boutsalis, 2000)), molekylvægt, K_ow, opløselighed, pK_a, anbefalet minimum og maximum markdosis og optagelses sted (jord versus blad-herbicid) noteret. I de tilfælde, hvor K_ow og opløselighed var opgivet ved forskellige pH, blev værdier ved pH 7 eller tæt ved valgt. I de tilfælde, hvor toksisitetsdata for flere forskellige arter var opgivet, blev data på Selenastrum anvendt og ellers Scenedesmus, da langt de fleste tests, hvor kun en art var opgivet, var udført på Selenastrum. Toksisiteten var normalt opgivet som EC₅₀ og i enkelte tilfælde (<5 %) som NOEC (No Observable Effect Level). NOEC-værdier blev konverteret til EC₅₀ ved at gange med en faktor 10. Dette er et konservativt estimat for EC₅₀, da forholdet mellem mellem NOEC defineret som EC₁₀ eller EC₂₅ og EC₅₀ varierer mellem 2 og 9 for dosis-responskurver med hældnings koefficienter på mellem 1 og 2 for den logistiske responskurve. Hældningskoefficienter i dette interval var dækkende for over 85% af 106 stoffer testet på alger (Faust & Scholze, 2004). Sammenhængen mellem herbicidernes toksisitet overfor alger og virkemåde blev testet med en variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en Tukey-test. Sammenhængen mellem toksisitet, K_ow og opløselighed blev testet med en simpel regressionsmodel. SAS blev anvendt for samtlige analyser.

For at kunne vurdere toksisiteten af herbicider i vand sammenlignet med toksisiteten på terrestriske planter, har vi indført begrebet: Herbicidets Relative Toksisitet. Dette er herbicidets akvatiske toksisitet relativt til stoffets terrestriske toksisitet angivet som den gennemsnitlige markdosis. Vi ved at markdosis i grove træk er bestemt ud fra et kriterie om at slå ca. 90% af målgruppe-ukrudtet ned (kudsk, 1993). Markdosis er derfor et groft udtryk for stoffernes terrestriske toksisitet overfor målgruppe-arter. For at kunne sammenligne en dosis i det terrestriske miljø med en koncentration i det akvatiske miljø, er man nødt til at omregne den terrestriske dosis per overfladeareal til en koncentration i vandmiljøet. Dette gøres ved at antage, at man sprøjter en fuld markdosis ud på 30 cm vand, som er den dybde, man i EU-sammenhæng har bestemt er standard for et vandløb eller en grøft. Denne koncentration er også hvad man i risikovurderings-sammenhæng kalder den værst tænkelige koncentration i miljøet (Predicted Environmental Concentration, PEC)(Miljøstyrelsen, 1999). Herbicidets Relative Toksisitet har vi defineret ved: EC₅₀ akvatiske planter/ markdosis omregnet til koncentration (PEC). En relativ toksisitet på 1 betyder derfor, at en fuld markdosis opblandet i 30 cm vand vil kunne reducere væksten af test-alger med 50%. Er den relative toksisitet >1, vil en fuld markdosis reducere væksten med mindre end 50%, og er den <1, vil en fuld markdosis reducere væksten med mere end 50%. I reguleringssammenhæng kaldes EC₅₀/PEC for Toxicity Exposure Ratio (TER) (Miljøstyrelsen, 1999).

Sammenhængen mellem herbicidernes relative toksisitet og parametrene i databasen blev undersøgt parallelt med den faktiske toksisitet opgivet som EC₅₀.

Adgang til databasen kan fås ved henvendelse til Nina Cedergreen.

3.2 Resultater og Diskussion

3.2.1 Laboratorie tests på 10 herbicider

Ingen af de testede herbicider havde en virkning på væksten af hverken Lemna eller alger ved de herbicidkoncentrationer, som er blevet målt i Danmark (Løkke, 2000; NOVA-data). Heller ikke en afdriftshændelse på omkring 10% af markdosis, hvilket ikke er urealistiskt (Asman et al., 2003), vil kunne forårsage væksthæmninger på over 50% (Tabel 2). For 6 af de 10 herbicider vil end ikke en fuld markdosis på 30 cm vand kunne forårsage den vækstnedsættelse. Et typisk kurveforløb for mechlorprop, som er det pesticid, der er fundet i højeste koncentrationer, er vist i Figur 4, og alle resultaterne er opsummerede i Tabel 2.

Figur 4. Den relative vækstrate (RGR) som funktion af Mechlorprop-koncentrationen for Lemna minor. De åbne symboler er det tekniske stof og de lukkede, det formulerede produkt. Det grå område angiver det i Danmark målte koncentrationsinterval.

En anden væsentlig observation er, at der stort set ikke er forskel på de tekniske og formulerede produkter for samtlige herbicider, undtaget glyfosat, hvor den anvendte formulering var Roundup (Monsanto). Det additiv, der bliver brugt i denne formulering, er i sig selv phytotoksiskt, hvilket har ført til udviklingen af mindre toksiske formuleringer som Roundup-bio (Cheminova, personlig kommunikation).

De syntetiske auxiner (plantehormoner) påvirker ikke væksten af alger selv i koncentrationer, der nærmer sig dem der findes i sprøjtebeholderen. Dette skyldes sandsynligvis, at alger er encellede organismer, der ikke påvirkes af de hormoner, der virker på celledifferentieringen i højerestående planter. Tilsvarende resultater er blevet fundet i mesokosmosforsøg, hvor også makrofytter indgik (Brock et al., 2002).

Der er stor forskel mellem resultaterne fra Lemna og algetesten med omkring en faktor 1000 større tolerance hos alger overfor metsulfuron, triasulfuron og mesotrion. Disse tre stoffer er, sammen med bentazon, svage syrer med en pK_a på <5. Dette betyder, at der vil være omkring en faktor 1000 flere molekyler på negativ ladet form ved pH 8, som er det pH algetesten udføres ved, sammenlignet med pH 5, som er Lemnas vækst pH. Dette kunne indikere, at herbiciderne og andre produkter med tilsvarende egenskaber hovedsageligt tages op på den uladede form, hvilket også er vist for alger (Fahl et al.; 1995). For den svage syre bentazon var forskellen i toksisitet mellem de to testsystemer kun en faktor 10. Vi havde forventet en større forskel, hvis toksisiteten udelukkende afhang af pH-afhængige optagsrater, men planternes følsomhed spiller selvfølgelig også en rolle.

Tabel 2. EC₅₀ for Lemna minor og algen Pseudokirchneriella subcapitata for en række tekniske og formulerede (Form.) herbicider tilhørende fem overordnede virkemåder (Syntetiske auxiner: O, Aminosyresyntese hæmmende stoffer: B og G, Fotosyntesehæmmere: C og D, hæmmere af carotenoid dannelsen: F samt Inhibitorer af celledeling: K (Boutsalis, 2000)). EC₅₀ værdierne er sammenlignede med de fundne koncentrationer af herbicider (Løkke, 2000; NOVA-data)og med den koncentration, som en afdriftshændelse på 10% af en gennemsnitlig markdosis vil give på 30 cm vand. Alle koncentrationer er angivet i μg l^-1, og de tilhørende usikkerheder er standardfejlen på kurve-fittet. Fungicidet prochloraz er medtaget, da det indgår i senere undersøgelser.

a Diquat fåes kun som Diquat-bromid, som er den opløsning der anvendes, og derfor her betegnes som det formulerede produkt.

b Emulsionsformuleringen Stomp-pentagon

3.2.2 Database-analyse

Der var 146 herbicider der opfyldte de stillede krav om toksisitetsdata på alger. For 55 af disse var testene udført på Selenastrum sp., for 16 var Scenedesmus sp. anvendt, 6 opgav Chlorella sp., 2 Anabaena sp. og 1 Navicula sp. For de resterende tests er arten ikke angivet ligesom usikkerhederne på de bestemte EC₅₀ værdier aldrig angives. Dette giver, sammen med varierende testbetingelser, hvoraf vi har set at bl.a. pH kan spille en stor rolle, større usikkerhed på toksisitetsdataene sammenlignet med laboratorieforsøgene. Den store mængde data gør det dog muligt at kunne udrede nogle generelle tendenser.

3.2.2.1 Fordelingen af EC₅₀ og Relativ Toksisitet

Ser man på fordelingen af EC₅₀ for alger og deres Relative Toksisitet på en logaritmisk skala, får man i begge tilfælde en klokkeformet kurve (Figur 5).

For giftighed, angivet som EC₅₀, kan man se, at <20% af det totale antal herbicider har en EC₅₀ værdi på <10 μg l^-1, som er omkring det højeste niveau man har målt i Danmark. Af disse 27 herbicider er kun fire kendt i Danmark og éet tilladt (www.lr.dk/middeldatabasen/Middelvalg.asp d. 21/10 2003). De fire er: 1) Pyraflufen-ethyl (EC₅₀: 0,65 μg l^-1), som er under afprøvning men endnu ikke tilladt til afgrøder, 2) Dichlorbenil (EC₅₀: 2 g 1–1), som nu er udgået, men kendt for nedbrydningsproduktet BAM, 3) Oxadiargyl (EC₅₀: 1,2 μg l^-1), der som Raft 800 WG har været afprøvet i Landsforsøg, men som der ikke er blevet søgt godkendelse til og 4) Aclonifen (EC₅₀: 6,9 μg l^-1), der sælges under navnet Fenix. Aclonifen er, så vidt vi er orienterede, ikke målt i dansk overfladevand.

Vender man sig mod den Relative Toksisitet (RT), har over halvdelen af herbiciderne en Relativ Toksisitet på >1. Det vil sige, at en fuld markdosis på 30 cm vand ikke vil kunne reducere algernes vækst med mere end 50%, hvis algerne i det naturlige miljø reagerer som algerne i alge-testen. Betragter vi en mere realistisk eksponering som f.eks. en 10% afdriftshændelse, vil 27% af de 146 herbider potentielt kunne reducere test-algevæksten med mere end 50%. Ud af disse, er 7 af stofferne kendt i Danmark og 3 af dem forhandles. Disse er: 1) Terbuthylazin (RT: 0,03), der indgår i 6 markedsførte produkter, 2)Diquat bromide (RT: 0,09), der sælges som Reglone og 3) Prosulfocarb (RT: 0,09), der sælges som Boxer EC. De fire udgåede eller endnu ikke markedsførte stoffer er Propachlor, Isoproturon, Dimethachlor og Oxadiargyl. Af disse 7 stoffer er både Terbuthylazin og Isoproturon jævnligt fundet i overfladevand (Løkke 2000, NOVA-data).

Den generelt lavere toksisitet af herbicider i vand sammenlignet med det terrestriske miljø kan skyldes flere ting. Vores hypotese er, at den store fortynding af herbiciderne nedsætter optagelseshastigheden af herbiciderne til et niveau, hvor planten i højere grad kan nå at afgifte det optagne stof end det er tilfældet i det terrestriske miljø. Dette begrunder vi med udgangspunkt i Ficks lov, der beskriver principperne for diffusion, som er den måde de fleste herbicider optages i planter. Ficks lov siger: F = D (C₀-C₁)/L, hvor

F er den arealspecifikke flux, D er diffusions koefficienten, L diffusionslængden og C₀ – C₁ er koncentrationsforskellen mellem herbicidopløsningen og plantevævet. En toksisk koncentration af herbicid i plantevævet vil derfor afhænge dels af herbicideksponeret overflade/volumenforhold, som er 2-5 gange større for akvatiske planter sammenlignet med terrestriske, hvis hele planten er eksponeret, og endnu større hvis der er tale om alger eller kun en delvis eksponering af den terrestriske plante. Diffusionskoefficienten er molekylafhængig og derfor ens i de to miljøer, så længe diffusionen foregår i et vandigt medie. Diffusionslængden gennem cuticula, cellevæg og –membran er kortere for vandplanter og alger med en skønnet faktor 2-20 (Frost-Christensen et al., 2003; Kirkwood, 2003). Både overflade volumenforholdet og den lavere diffusionslængde hos vandplanter peger altså på et øget optag hos vandplanter fremfor landplanter. Men sammenlignes koncentrationen af herbicidopløsningen i sprøjtebeholderen (C₀) med den koncentration en fuld markdosis på 30 cm vand og en sprøjtevæskemængde på 150 l ha-1 giver, viser det sig, at der finder en fortynding på en faktor 20 000 sted. D.v.s. at koncentrationsgradienten (C₀ – C₁) er 20 000 gange lavere i det akvatiske miljø end i det terrestriske for herbicider, der sprøjtes direkte på planterne. For jordherbicider vil forskellen være noget lavere, da sprøjtevæsken vil blive delvist fortyndet af jordvand og herbicider, der imobiliseres ved adsorbtion til jordpartikler. Vi mener derfor, at hovedårsagen til den lavere toksisitet af herbicider i vand, sammenlignet med den terrestriske toksisitet, ligger i den kraftige fortynding og dermed optagshastigheden af stofferne.

Udover at vurdere den akvatiske toksisitet af et herbicid sammenlignet med den terrestriske toksisitet, fortæller den Relative Toksisitet også noget om sandsynligheden for, at et bestemt herbicid vil udgøre en fare for vandmiljøet. Det er den tolkning af termen Relativ Toksisitet man bruger, når man vurderer TER-værdier. Men en fuld markdosis på 30 cm vand er ikke kun et udtryk for den værst tænkelige koncentration i miljøet, det er også den parameter, der bedst forklarer den herbicidkoncentration (og frekvens), man reelt finder i vandmiljøet (Sørensen et al., 2003). Den fundne sammenhæng kan bl.a. forklares med afdriftshændelser og punktkildeforurening fra vaskepladser, hvor man må forvente en korrelation mellem koncentrationen af herbicid i sprøjtebeholderen og udledningen til vandmiljøet. De mere komplicerede interaktioner, der finder sted så snart herbiciderne har været i kontakt med jord, hvortil nogle herbicider binder sig kraftigt, synes at være af mindre betydning for det overordnede billede. Den Relative Toksisitet - TER er altså et meget anvendeligt udtryk for den potentielle toksisitet af et stof i vandmiljøet, da den kombinerer toksisitet og sandsynlighed for forekomst og koncentrationsstørrelse. Når man som i dette litteraturstudie kun har EC₅₀-værdier fra en enkelt art per herbicid, vil man, når man skal vurdere risikoen for alger og planter i miljøet bruge en sikkerhedsfaktor på mindst 100 (Miljøstyrelsen, 1999), for at tage højde for de forskelle, der måtte være mellem arter og mellem laboratorie og virkelige forhold. Vores laboratorieforsøg viste, at forskellen i toksisitet mellem arter (L. minor og P. supcapitata) i sig selv kunne variere med op til en faktor 1000. En faktor 100 mellem EC₅₀ på alger og PEC vil altså for visse herbicider være for lav til også at kunne beskytte højere planter.

Vender man tilbage til figur 5 og vurderer den ud fra en risikovurderings-synsvinkel vil man se, at langt størstedelen af herbiciderne har en Relativ Toksisitet på <100 nemlig ialt 78%, og 90% har en Relativ Toksisitet på <1000. Langt de fleste herbicider vil derfor blive klassificeret som potentielt toksiske for den akvatiske flora. Dette indebærer, at man vil foretage yderligere undersøgelser, hvor man tager hensyn til nedbrydning og adsorption af herbicidet i miljøet og undersøger eksponeringen ved introduktion af sprøjtebræmmer og evt. introducerer mikrokosmos- og felt-forsøg (Miljøstyrelsen, 1999).

3.2.2.2 Sammenhænge mellem akvatisk toksisitet og fysisk/kemiske og fysiologiske egenskaber

Vi sammenlignede den akvatiske toksisitet, både som algernes EC₅₀ og som Relativ Toksisitet, med herbicidernes K_ow og vandopløselighed. Den eneste signifikante sammenhæng var mellem logaritmen til den Relative Toksisitet og logaritmen til K_ow (Regression: R² = 0,07; p = 0,003, n =120, hældning = –0,21) og mellem gennemsnitlig markdosis og K_ow (Regression: R² = 0,09; p = 0,001, n =120, hældning = 0,11). Begge korrelationer forklarer dog så lidt af den samlede variation, at deres kemiske og biologiske signifikans er begrænset. Man finder ofte en positiv sammenhæng mellem stoffers narkotiske toksisitet og K_ow (skønt knap så overbevisende for alger som for dyr), da stoffer med en høj fedtopløselighed let opløses i organismers cellemembraner, og ad den vej forårsager toksiske effekter (ECETOC,1998). Denne sammenhæng var ikke fundet i dette studie med herbicider, som er stoffer, der er kendetegnet ved at virke specifikt på forskellige fysiologiske processer i planter. Dette understreger deres specifikke virkning, der er uafhængig af deres fedtopløselighed. Ser man på herbicidernes fysiologiske virkning og opdeler dem efter deres virkemåde (Boutsalis, 2000), får man følgende billede (Figur 6). Virkemåderne er angivet med et nummer og forklarede i Tabel 3.

Tabel 3. Virkemåde og den kategori de forskellige virkemåder får ifølge "The Herbicide Resistance Action Comittee (HRAC)" og det nummer, de er givet i Figur 6.

Figur 6. Spredningen i toksisitet angivet som EC₅₀ (n = 135) og Relativ Toksisitet (n = 120) overfor alger mellem herbicider med forskellig virkemåde. Virkemåden er angivet med et tal som er forklaret i Tabel 3. Alle herbicider er angivet med små symboler og meridianen for hver virkemåde er angivet med et stort symbol.

Det er markant at glyfosat (nummer 15) og de syntetiske auxiner (nummer 14) generelt er meget uvirksomme overfor alger. For de syntetiske auxiner gælder det, at algerne ikke har de hormoner, der påvirker celledifferentieringen, og for glyfosat er det vores hypostese, at dette herbicid simpelthen er svært at optage. Glyfosat er en zwitter-ion, hvilket vil sige, at den ved neutral pH har både en positiv og en negativ ladning (Knuuttila & Knuuttila, 1979). Det eneste andet herbicid med to pK_a værdier under pH 7 er Imazethapyr, der ligeledes har en meget høj EC₅₀ for Selenastrum på 500 000 μg l^-1. Der er signifikant forskel i EC₅₀ mellem de syntetiske auxiner og celledelings hæmmerne, mikrotubuli samlings hæmmerne, PS II hæmmerne og ALS hæmmerne (Tukey HSD). For den Relative Toksisitet er der ingen signifikant forskel mellem nogen af grupperne.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Juli 2004, © Miljøstyrelsen.