| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Pesticiders påvirkning af planter og alger i vandmiljøet

5 Giftighedens afhængighed af tid, effekt variabel og naturlige stressfaktorer

• 5.1 Materiale og Metoder
  • 5.1.1 Tid og effekt variable hos Lemna
  • 5.1.2 Effekt variable hos Elodea
  • 5.1.3 Forsøg med pH
• 5.2 Variation som følge af forsøgsdesign
  • 5.2.1 Giftighedens afhængighed af tid
  • 5.2.2 Giftighedens afhængighed af effekt variabel
• 5.3 Naturlige faktorers påvirkning af giftighed
  • 5.3.1 Herbicid tilgængelighed
  • 5.3.2 Fysiologisk virkning

Hvad betyder valget af forsøgstid og effekt variabel for de giftighedsparametre man bestemmer, og som der tages udgangspunkt i, når der lovgives omkring pesticider? Nogle herbicider virker hurtigt andre langsomt. Det kan tage uger, før virkningen af mange ALS-inhibitorer samt glyfosat viser sig under feltforhold (Cobb, 1992). Spørgsmålet er derfor, om den forsøgstid, der bruges til screening for akvatisk fytotoksisitet på 7 dage for Lemna, er tilstrækkelig til at kunne fastslå den fulde virkning af langsomt virkende herbicider som f.eks. glyfosat og sulfonylurea herbicider? Herbicider påvirker også forskellige processer i planterne. Nogle påvirker f.eks. celledelingen, mens andre virker direkte på fotosyntesen. Dette betyder bl.a., at den estimerede giftighed af et stof må afhænge af, hvilken effekt variabel man måler på, sådan som det også blev vist for metsulfuron-methyl i afsnit 4.2.1. Vi undersøgte variationen i toksisitet udtrykt som EC₅₀ og EC₁₀ over tid for 4 af de effekt variable der er mest anvendt for tests på standard organismen Lemna minor (OECD guideline for testing of chemicals, 2000) på to herbicider: 1) Metsulfuron-methyl, som er et langsomt virkende sulfonylurea-herbicid, der hæmmer dannelsen af de grenede aminosyrer, og 2) terbuthylazin, som er en hurtigt virkende hæmmer af PS II komplekset i fotosynteseapparatet.

Naturlige vækstfaktorer kan også påvirke et stofs giftighed. Generelt undersøger man effekten af herbicider på testplanter, der vokser under optimale vækstbetingelser. Dette giver også mening, da nogle undersøgelser viser, at man i hvert fald for sulfonylurea herbicider får den hurtigste effekt på hurtigt voksende planter (Cobb, 1992). Mayer et al. har tilsvarende vist, at alger i hurtig vækst ved høje lysintensiteter er mere følsomme overfor kemisk stress end alger, hvis vækst er lysbegrænset (Mayer et al., 1998). Der er imidlertid en masse faktorer i det naturlige miljø, der både påvirker tilgængeligheden af herbiciderne og muligtvis også deres fysiologiske virkning. En af de faktorer, de tidligere beskrevne forsøg har vist, kunne være af betydning for tilgængeligheden og dermed for planternes optag af herbicider, er pH (afsnit 2.2.1). Forsøg med alger har vist, at det primært er den uladede ion, der optages (Fahl et al., 1995, Mayer et al., 1998). Hvis dette også er tilfældet for højere planter, kan det forklare den op til faktor 1000 store forskel i toksisitet mellem Lemna og alger, der dyrkes ved pH på helholdsvis 5 og 8. Da pH i dansk overfladevand kan variere mellem pH 5 i sure tørvegrave og pH 10 i eutrofe vande (Sand-Jensen, 2001), kan en mulig pH-effekt på toksisiteten være af stor betydning. På grund af herbiciders specifikke virkning på forskellige biokemiske processer, kunne man forestille sig, at miljømæsige forhold, der påvirker de samme processer som et givet herbicid, kunne forøge eller formindske et herbicids effekt. Vi vil i dette afsnit kort gøre rede for hvilke miljømæsige parametre, der kan være af betydning for herbiciders plantetilgængelighed og toksisitet i det akvatiske miljø, underbygget af enkelte forsøg.

5.1 Materiale og Metoder

5.1.1 Tid og effekt variable hos Lemna

Lemna minor blev dyrket som beskrevet i afsnit 2.1.1. Fem fortyndingsrækker med koncentrationerne: 0,053; 0,15; 0,43; 1,2; 3,5 og 10 μg metsulfuron-methyl l^-1 og 7,9; 23; 64; 184; 825 og 1500 μg terbuthylazin l^-1 og 6 replika for hver koncentration inklusiv kontrol blev fotograferet og anbragt i klimaskabe ved 24°C og en konstant lysintensitet på ca. 100 mol m^-2 s^-1 (PAR). Stamopløsninger for samtlige fortyndingsrækker blev opbevaret i køleskab ved 5°C. Areal, frond antal, friskvægt og tørvægt blev bestemt på 6 Lemna populationer identiske med startmaterialet. Efter henholdsvis 3, 6, 9, 12 og 15 dage blev planterne fotograferede for at bestemme areal og frondantal, og en fortyndingsrække med tilhørende kontrol blev høstet og friskvægt og tørvægt bestemt. På dag 3, 6, 9 og 12 blev de planter, der ikke blev høstet, overflyttet til friskt medie, bestående af de originale stamopløsninger, for at undgå evt. næringsmangel. På dag 9 og 12 blev de hurtigst voksende planter delt i to brønde for at undgå tætheds-afhængig vækst. På baggrund af areal, frond antal, friskvægt og tørvægt blev de relative vækstrater for de 5 forskellige forsøgstider beregnet, og data blev beskrevet med en logistisk dosis-responskurve som beskrevet i afsnit 2.1.1.

5.1.2 Effekt variable hos Elodea

I forsøgene med flere arter blev ikke kun vækstrater og specifikt bladareal målt og beregnet på alle planter, men også morfologiske parametre som antal sideskud, skudlængde, bladantal og –længde, rodantal og –længde samt dannelsen af blomster og frugtlegemer ved forsøgs-afslutning blev talt og målt. Data var i mange tilfælde langt fra tilstrækkelige til, at det var muligt at beskrive dem med en dosis-respons kurve. I enkelte tilfælde kunne det dog lade sig gøre at få tilfredsstillende dosis-respons kurver på flere effektvariable på de samme planter. Nogle af disse vil blive præsenteret her.

5.1.3 Forsøg med pH

For at be- eller afkræfe om forskellen i toksisitet af svage syrer mellem Lemna og alger kan skyldes forskellen i forsøgs-pH, blev toksisiteten af metsulfuron-methyl målt på Lemna minor tilpasset og dyrket i algemedie pH 8 tilsat 12.8 mM NO₃^-, svarende til koncentrationerne i det medie standard testene med Lemna normalt udføres i. Bortset fra mediets sammensætning blev forsøgene udført som beskrevet i afsnit 2.1.1.

5.2 Variation som følge af forsøgsdesign

5.2.1 Giftighedens afhængighed af tid

Parametrene EC₅₀, som er det mest anvendte udtryk for toksisitet og EC₁₀, der ofte bruges som et udtryk for No Observable Effect Concentrations, fra dosis-respons kurver baseret på relative vækstrater beregnet på baggrund af de fire forskellige effekt variable, er afbilledet som funktion af tid i Figur 12. Det ses, at der for effekt variablene frond antal og tørvægt ikke kunne beregnes tilfredsstillende dosis-responskurver for metsulfuron-methyl efter 3 dage. Efter 6 dage kunne man dog få tilfredsstillende parametre for samtlige effekt variable. Hvis den fulde toksisitet af et stof ikke var kommet til udtryk efter 6 dage, ville vi have forventet at EC_x værdierne ville falde (Walker et al., 2001). Dette skete fra dag tre til dag 6 for en del af effektvariablene, men derefter var

Figur 12. Parametrene EC₅₀ og EC₁₀ fra dosis-responskurver baseret på relative vækstrater beregnet på baggrund af 4 effekt variable: Frond antal (lukket cirkel), bladareal (åben trekant), friskvægt (åben cirkel) og tørvægt (lukket trekant) afbilledet som funktion af tid. Usikkerhederne på bestemmelsen af parametrene er opgivet i figur 13.

EC_x-værdierne relativt konstante eller endda svagt stigende. Denne stigning kunne skyldes en tilpasning til herbiciderne eller at koncentrationen af herbicider faldt i løbet af forsøgstiden i de opbevarede stamopløsninger. Ser man på usikkerheden på bestemmelserne af EC_x-værdierne (Figur 13), falder den klart som funktion af tid. Mest tydeligt ses det for terbuthylazin, hvor man allerede efter 6 dage har en CV på EC₅₀ på under 20% for samtlige effekt variable.

Figur 13. Coefficient of variation (CV%) på EC₅₀ og EC₁₀ udregnet som assymptotisk standard fejl på parameteren * 100%/parameteren, som funktion af tid. Symboler som i figur 12.

For metsulfuron-methyl er vækstrater baseret på areal eller friskvægt klart at foretrække, p.g.a. den mere sikre bestemmelse af EC₅₀ og EC₁₀. Usikkerheden på frond antal og tørvægt kan dog formindskes ved at øge antallet af planter per replika, men dette medfører en meget pladskrævende forsøgsopsætning. Forsøget viser, at selv for et meget langsomt virkende herbicid som metsulfuron-methyl, er den fulde giftighed udtrykt efter en forsøgstid på 7 dage, som er standard test-tiden (OECD guideline for testing of chemicals, 2000).

5.2.2 Giftighedens afhængighed af effekt variabel

For et stof som terbuthylazin, der hæmmer fotosyntesen og dermed indirekte kulstoffikseringen, havde vi forventet, at tørvægtsspecifik vækst ville være en følsom parameter. For metsulfuron-methyl, der har den indirekte effekt at stoppe celledelingen få timer efter applikation (Cobb, 1992), forventede vi, at areal specifik vækst ville være den mest følsomme parameter. Begge disse forventninger viste sig at holde stik (Figur 12). Mest markant for EC₅₀ og mest markant ved korttids-forsøg. Hvis man ser på giftighedens afhængighed af effekt variabel efter 6 dage, som er det tidsrum, der ligger tættest op af standard test-tiden, varierer EC₅₀ imidlertid ikke mere end maksimalt en faktor to. Så hvis man tager de sædvanligt anvendte sikkerhedsfaktorer i betragtning, er en faktor to ikke alamerende.

Vender man sig mod makrofytterne, kan man finde langt større forskelle mellem forskellige effekt variable (men også langt større usikkerhed på bestemmelsen af en EC_x-værdi). I figur 14 er udviklingen i fire morfologiske karakterer som funktion af metsulfuron-methyl koncentrationen i mediet vist sammen med en fittet eller visuelt estimeret EC₅₀værdi. De tørvægtsbaserede vækstrater i det samme forsøg var ikke påvirkede af herbicidet (Cedergreen et al., 2003b), men morfologien ændrede sig tydeligt. Der var op til en faktor 50 forskel på de estimerede EC₅₀-værdier. Disse resultater stemmer godt overens med forsøg på Myriophyllum aquaticum, hvor vækst, friskvægt forøgelse, længdevækst, total rodlængde og rodantal var målt sammen med pigmenterne klorofyl a, b og karotenoider på fortyndingsrækker af 17 forskellige herbicider (Turgut & Fomin, 2002). Disse forsøg viste, at for samtlige herbicider var der en eller flere af effektvariable, der ikke udviste nogen signifikant respons på herbicidet, mens andre gjorde. De eneste effektvariable hvor det altid var muligt at beregne EC₅₀ var pigmentmålingerne. Forskellen i EC₅₀ mellem effekt variablene var på en faktor 2-10. I forsøg med makrofytter anbefales det derfor altid at tage mere end en effekt variable i betragtning, og det synes at være en god idé at lade pigment koncentrationer være en af dem.

Figur 14. Udviklingen i fire forskellige morfologiske karakterer hos Elodea canadensis som funktion af koncentrationen af metsulfuron-methyl. Data er fra forsøg 2 med flere arter (Kapitel 4).

5.3 Naturlige faktorers påvirkning af giftighed

5.3.1 Herbicid tilgængelighed

Vi så allerede i Kapitel 3 (Tabel 2), at vandets pH muligvis har en stor indvirkning på svage syrers toksisitet. Dette er vist for alger og skyldes, at den negative ion, som er den dominerende form ved pH højere end stoffets pK_a har sværere ved at trænge ind i en celle. Planteceller har nemlig et negativt potentiale over cellemembranen (Ullrich et al., 1984). Det er derfor altid vigtigt at vide, under hvilken pH en test er foretaget, hvis man vil vide noget om den potentielle toksisitet af svage syrer. Af de 146 herbicider, der var med i litteraturstudiet, havde ca. 40% en pK_a værdi på <pH 5, som er den pH mange Lemna test udføres ved. Toksisiteten ude i miljøet ved en pH 7-9, kan derfor nemt vise sig at være meget lavere. Forsøget med Lemna minor dyrket ved pH 8 viste imidlertid, at toksisiteten ved denne pH var tilsvarende toksisiteten ved pH 5 (Figur 15). Dette var også tilfældet i forsøget med flere arter (Kapitel 4), hvor forsøgs-pH svingede mellem pH 7.7 og pH 8.5. Dette kan enten være, fordi pH ikke spiller nogen rolle for optaget, men at Lemna er meget følsom overfor de herbicider, vi har testet, og som er svage syrer. Hvis vi imidlertid sammenligner EC₅₀ værdier for de 27 herbicider, hvor EC₅₀ er opgivet for både alger og Lemna i Tomlin (2002), viser det sig, at der stort set ikke er forskel i toksisiteten mellem de to arter for de 10 af herbiciderne, som er uladede (EC₅₀ alger/EC₅₀ Lemna = 1.48±2.64 (Interval: 0.01-8.0)). For de 17 herbicider, der har en pK_a < 5, eller hvor K_ow er opgivet ved flere pH værdier (indikere at molekylet kan dissociere), er EC₅₀ for alger imidlertid i gennemsnit ca. 75000 gange højere en EC₅₀ for Lemna (Interval: 1.3 – 625000). Der er altså noget, der kunne tyde på at svage syrer virker forskelligt på de to organismer.

Figur 15. Den relative vækstrate af Lemna minor som funktion af metsulfuron-methyl koncentrationen i mediet ved pH 8 (n=3). Forsøget er udført to gange (Åbne og lukkede cirkler).

En anden faktor, der i høj grad kan påvirke mængden af plante-tilgængeligt herbicid, er vandets turbiditet, altså mængden af organisk materiale og sediment-partikler. Studier med glyfosat, et stof der binder hårdt til jord, fortyndet med flodvand har vist, at stoffets effektivitet afhænger af mængden af opløst materiale. Også mængden af kationer som Ca⁺⁺ og Mg⁺⁺ påvirker glyfosats effektivitet (Stahlman & Phillips, 1979; Thelen et al., 1995). Ofte optræder de største koncentrationer af herbicider i forbindelse med nedbørshændelser, og udvaskningen medfører typisk også store mængder af jordpartikler m.m. Spørgsmålet er derfor, hvor stor en del af den målte herbicidkoncentration, der rent faktisk er tilgængelig for planter og alger? En fremtidig differentiering mellem partikelbundne og opløste pesticider ville kunne nuacere undersøgelser af pesticiders effekt.

5.3.2 Fysiologisk virkning

Begge fler-arts-forsøg blev udført under to forskellige vækstbetingelser, for at se, om herbicidets effektivitet blev påvirket af vækstbetingelserne. I forsøgene med metsulfuron-methyl var vækstraten generelt højere i forsøget med høj lysintensitet, på trods af det noget lavere fosfor-niveau, men toksisiteten forblev uændret (Figur 8 og 10). For et stof som metsulfuron-methyl, der hæmmer dannelsen af visse aminosyrer, kunne vi forvente, at f.eks. N-stress ville påvirke herbicidets effektivitet, men dette er ikke systematiskt undersøgt.

For terbuthylazin forsøget var slutvægtene og dermed vækstraterne ikke markant forskellige mellem de to forsøg (Figur 9). Til gengæld var toksisiteten lavere under de høje lysintensiteter (Figur 10). Dette er overraskende, da terbuthylazin blokerer elektrontransporten i PSII-fotosystemet, hvilket fører til dannelsen af oxygene radikaler, der ødelægger membraner m.m. inde i cellen (Fedtke, 1982b). Højere lysintensiteter og faktorer, der generelt vil fremme fotoinhibering, så som lave temperaturer og næringsstress (Vestergaard, 2003; Osmond, 1994; Osmond, 1994), er derfor forventet også at forøge effekten af terbuthylazin og andre fotosyntese-hæmmere. Årsagen til, at vi ikke så dette i vores forsøg, mener vi kan skyldes den øgede vækst af epifytter under højere lysintensiteter. Et øget epifyt lag vil nedsætte kontakten mellem planten og herbicidet og dermed nedsætte optaget. Hvor vidt dette også vil gøre sig gældende i naturen er uvist, da der i disse systemer også findes græssere, der vil minimere væksten af epifytter. Det er derfor ikke usansynligt, at man under naturlige forhold vil kunne finde, at planter udsat for høj indstråling, vil være mere følsomme overfor fotosyntesehæmmere, end planter udsat for lavere indstråling.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Juli 2004, © Miljøstyrelsen.