| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Bekæmpelse af sygdomme i frøbede af Nordmannsgran ved hjælp af biologiske og kulturtekniske metoder i skovplanteskoler

2 Undersøgelser af patogener i forsøgsarealet og på frø

Som forudsætning for at lave bekæmpelsesforsøg (kapitel 6, 7 og 8) undersøges det potentielle sygdomstryk ved:

1. Undersøgelse af forekomst af patogener i jorden i de arealer, hvor markforsøgene udføres
2. Undersøgelse af frøpartier for frøkvalitet og frøbårne patogener. Frøpartier, der forventedes at have forholdsvis god vitalitet og lavt indhold af svampevækst blev undersøgt. Målet var at arbejde med så sundt et parti som muligt, idet hovedformålet med projektet var at undersøge bekæmpelsen af de jordbårne sygdomme.

2.1 Svampe i forsøgsarealet

Baggrunden for udvælgelse af forsøgsareal er, at man gennem flere år i Fosdal

Planteskole har iagttaget et stort udfald i fremspiring af Abies nordmanniana i et bestemt areal i Planteskolen. For at 1) fastslå hvilke patogene svampe, der kan forventes at forårsage problemer og 2) at opnå patogene isolat(er) til smitte- og bekæmpelsesforsøg i vækstkammer, blev der foretaget jordprøvetagninger i forsøgsarealet med efterfølgende undersøgelser.

2.1.1 Materialer og metoder

Metodik for udtagning af jordprøver.

Jordprøver blev indsamlet hvert år (2002, 2003 og 2004) således at hver jordprøve repræsenterede en blok i det senere udlagte markforsøg; dvs. i 2002: 8 prøver, repræsenterende 2 x 4 blokke i to markforsøg med antagonister og dyrkningsændringer (se kapitel 7 og 8). I 2003 og 2004 blev der taget henholdsvis 4 og 5 prøver repræsenterende de 4 og 5 blokke i de to forsøg. 16 delprøver blev udtaget med skovl fra hver blok (diagonalt med ca. 1.5 meters mellemrum). I alt indsamledes for hver blok ca. 6 l jord. Jorden opbevaredes ved 3°C i op til 8 dage. Vandindholdet bestemtes før pladespredninger.

Svampebestemmelse ved pladespredninger.

Der blev foretaget pladespredninger på selektive medier for indikation af hyppigheder af relevante svampeslægter med potentielle patogene arter. For Rhizoctonia solani blev der anvendt sur PDA (”Potato Dextrose Agar”) (pH=4) og antibiotika (chloramphinicol 0.5 mg per l og chlortetracyclin 0.25 mg/l). For svampene Fusarium spp. (Cylindrocarpon destructans og/eller Verticillium sp) blev der anvendt PDA tilsat 2.2 g/l TritonX-100 and antibiotika (chloramphinicol 0.5 mg per l og chlortetracyclin 0.25 mg/l). For Pythium spp. blev der anvendt 4% P₅ARP: 17g/l Difco Corn Meal Agar; Difco Bacto Agar, 25g/l; Pimaricin 5 mg/l; Ampicillin 10 mg/l; Rifampicin, 10 mg/l. Phytophtora isoleres på 4% P₅ARP tilsat 50 mg hymexazol.

Patogene svampe i jord bestemt ved ”baiting”(fangplanter)

I 2002 blev patogene svampe isoleret ved baiting teknik. Der blev sået fem x 10 stratificerede, sundt udsende A. nordmanniana frø i potter for hver af de 8 jordprøver (A-H). Fremspiringen blev talt én gang ugentlig i 2½ måned. Planter der var syge efter fremspiringen blev fjernet, sygt væv skåret fra og overfladesteriliseret i 70% ethanol i 30 sek. Efterfulgt af 3 gange vask med sterilt vand vævsstykkerne blev derefter podet på selektiv agar som beskrevet i det foregående afsnit.

Patogenitetsundersøgelser.

Der udførtes patogenitetsforsøg (smitte i sterilt miljø) for at eftervise at de Kock'ske regler ^[1] var opfyldt for udvalgte isolater. Et andet formål var at udvælge et potent patogent isolat til bekæmpelsesforsøg i kontrolleret miljø (kapitel 6). Forspirede, sundt udseende frø (2-5 mm rod) blev udpriklede i steril jord/sandblanding. Til det spirede frø blev der tilsat en udstandset agarprop med vækst af testsvampen. Der blev aflæst 3 gange efter 3, 4 og 6 uger for fremspiring og post emergence visning.

2.1.2 Resultater

Resultater af pladespredningerne viste at der for 2002 forsøget blev fundet: > 1000 cfu (”koloniformende enheder”) af Rhizoctonia spp; 370 cfu af Pythium spp og 570 cfu af Fusarium spp. g^-1 tør jord. I 2003 blev der ved pladespredninger af jord fundet mellem 80 og 200 cfu af Pythium spp og 2300-4900 cfu af Fusarium spp. g^-1 tør jord. Fusarium oxysporum (der rummer såvel saprofytiske som patogene former) var den hyppigst forekomne. I 2004 viste pladespredningerne et indhold i jorden af 110 og 600 cfu af Pythium spp og 300-1100 af Fusarium spp. g^-1 tør jord.

Resultatet af baiting undersøgelserne viste en fremspiring på mellem 44% og 16% og et antal af raske frøplanter på mellem 42% og 10% (fig 2.1.). Der var signifikant højere fremspiring i blok H (p< 0.0001), sammenlignet med blok A, B, C og D medens blok E, F og G havde en intermediær fremspiring, der ikke var signifikant forskellig fra de to grupper. Blok A, B, C og D udgjorde blokke for antagonistforsøget i 2002 medens de 4 andre blokke blev anvendt til texturforsøget. Undersøgelserne af post-emergence syge planter resulterede i høst af svampeisolater tilhørende: Rhizoctonia (1), Pythium ultimum (10), Phytophtora (1), Cylindrocarpon (1), Fusarium oxysporum/redolens (6) og Chrysosporium pannorum (2). 6 Pythium isolater, 5 Fusarium isolater, 1 Rhizoctonia isolat og 1 Cylindrocarpon isolat blev testede for patogenitet.

Resultatet for test af patogenit viste at 4 ud af 6 Pythium isolater og 5 ud af 6 Fusarium isolater var patogene, idet Abies havde dårligere fremspiring/kvalitet end usmittet kontrol. Ingen af de øvrige isolater var patogene. I overensstemmelse med det angivne fra litteraturen viste Pythium ultimum angrebne planter symptomer på rodbrand, der oftest forårsagede sort nedvisning af planten, medens Fusarium angrebet resulterede i stive planter med tophenvisningssymptomer typiske for Fusarium oxysporum. Et isolat af P. ultimum var ultimum (no 1983) blev benyttet til smitteforsøg (kap. 4) og antagonistforsøg i kontrolleret miljø (kap. 6).

Figur 2.1. Fremspiring af raske planter (venstre søjle) og totalt fremspirede inklusive post-emergence døde registreret efter 12 uger i jord fra Fosdal. A-H referer til blokke der anvendes i markforsøg. Forskelligt bogstav på søjler angiver statistiske forskellige ved Dunn (Bonferoni test (P< 0.05))

2.2 Svampe på frø

Undersøgelsen havde til formål at udvælge frøpartier med lav grad af tilstedeværelse af frøbårne patogener med henblik på at optimere ensartethed i forsøgsmaterialet ved senere undersøgelser af jordbåren smitte og bekæmpelsesforsøg. Partierne blev også testet for spireevne ved forskellige stratificeringslængder (se kapitel 3).

2.2.1 Materialer og metoder

Blotter test

To frøpartier blev evalueret for svampe ved blottertest (test på filterpapir) (ISTA, 1996) med henblik på markforsøg 2002. 015/00 (Tversted F526- A3113 og 016/00 (Tversted F527-A3007) i det følgende benævnt 015 og 016. Begge partier blev høstet i 2000 (hvilket aflæses af partinummerets cifre efter skråstreg dvs. /00). Til markforsøgene 2003 og 2004 blev frø 031/02 Tversted F526 undersøgt (høstet 2002). Blotter testen blev udført foråret 2003.

400 overfladedesinficerede frø (1% NaOCl 10 min, med 3 gange efterfølgende skylning) blev inkuberet ved 20°C, i 15 dage ved NUV (nær ultraviolet lys)(ISTA, 1987) 25 stk. pr. skål. Mikroflora på frøene blev herefter undersøgt ved stereomikroskopi. Spirede frø blev registreret.

Growing on test

Tre frøpartier blev testet i en growing on test i vermiculit. Testen anvendtes til måling af spirevne og opgørelse af syge planter i og efter frøplantestadiet, der kan henføres til frøsmitte (Neergaard, 1979). Partierne var: 031/02 (Tversted, F. 526,), 039/02 (Dallerup, F. 722,), 028/01 (Ambrolauri, Tlugi, Georgien). Growing on testen blev udført foråret 2004.

Frøpartierne blev kuldebehandlet (stratificeret) ved kontrolleret vandindhold (mc) 33%: 3 og 6 uger ved 5°C efterfulgt af spiring ved 20°C i vermiculite.

Spiring og kimplante udvikling blev registreret ugentlig og post emergence syge blev talt og taget op. Fra det syge væv blev der foretaget isolering på samme måde som planter i baitingforsøget (afsnit 2.1.1).

2.2.2 Resultater

Sammenligning af parti 015/00 og 016/00 viste at parti nr. 15 var lavest inficeret med patogener (Fusarium og Cylindrocarpon: hhv 0,3% og 1%) medens parti nr 16 var inficeret med hhv. 4 % og 3 %. Dog var der for visse saprofytiske svampe en højere koloniseringsgrad for 015 i sammenligning med 016. Således var Papulaspora immersa koloniseringsgraden 50% sammenlignet med 11% i parti 016 (se fig. 2.2). Spiringen blev i blottertesten registreret til (015): 50% +/- 11 i modsætning til (016): 38% +/- 10%, hvilket er i god overensstemmelse med data opnået i den originale spiretest se kapitel 3, hvor der blev observeret hhv. 60% og 40% spiring.

Resultaterne af blotter testen i 2003 viste at partiet 031/02 var lavt inficeret med patogener (Fusarium og Cylindrocarpon: hhv 0,8% og 0,2%). Af saprofytiske svampe blev der i lighed med partierne, der blev testet i 2002, især fundet forekomst af Trichoderma (10%). Papulaspora immersa var til stede men blev ikke optalt. Spiringen pr. 9.4.2003 blev opgjort til 65%.

Ved growing on testen i 2004 sås et udfald af planterne (figur 2.3). Der var flest syge planter for parti 031/02 nemlig 23% og 2 % for henholdsvis 3 og 6 ugers forbehandlede sammenlignet med 10% og 6% for 028/01. Isoleringer fra de syge planter viste at 50% af planterne havde vækst af Fusarium oxysporum/redolens, medens 28% havde vækst af Papulaspora immersa.

Figur. 2.2 Svampe registreret ved blotter tests af to frøpartier. 400 frø testet pr. parti (20 gentagelser á 20 frø): 015 (første søjle) og 016 (anden søjle)

Figur 2.3. Procentvise totale fremspirede og fremspirede som udviklede færdige, raske kimplanter for 3 forskellige frøpartier af Abies nordmanniana stratificeret 3 eller 6 uger.

2.3 Konklusion

Det blev sandsynliggjort ved isoleringer, baitingforsøg og patogenitetstest i 2002, at de mest betydende patogener (når man vurderer både kvantitativt og kvalitativt) i forsøgsarealet var Pythium spp og Fusarium spp. Der var en god overensstemmelse mellem fund af Pythium spp. (ultimum overvejende) og Fusarium spp. (oxyporum og redolens overvejende) i pladespredninger og de opnåede resultater i baitingforsøget. Da jorden i forsøgsarealet med bedopbygning med sand, lille rotation i driften i planteskolen, samt ensartet topografi på arealet kan forventes at resultere i en ret ensartet mikroflora sammensætning over hele marken, hvor de tre forsøg blev udlagt, blev det antaget at pladespredninger de to følgende år alene kunne være et bud på, om der kan forventes angreb i marken. De to følgende år blev der i pladespredninger fundet værdier for Pythium spp og Fusarium spp. som var på et lignende niveau som det første år, og de tre forsøgsarealer blev derfor alle anset for brugbare til markforsøg med et forventeligt angreb i marken.

I de to første års markforsøg ønskedes frøpartier med god spireevne og lav sygdomsniveau. Den anerkendte metode til frøtest: blottertesten giver et fingerpeg, men viser ligesom pladespredninger fra jord ikke om fund af svampe er proportional med sygdom, heller ikke selv om man identificerer til arter med forventet patogenitet, idet mange arter rummer såvel patogene som saprofytiske genotyper. Overfladesterilisering er en metode til at eliminere svampe der ikke har inficeret væv, men flere saprofytiske svampe kan overleve behandlingen, deriblandt Trichoderma spp. Metoderne kan dog sige noget om, hvorvidt potentielle patogene svampe er til stede. I blottertesten blev der påvist et lavt niveau af potentielle patogene Fusarium spp. Omvendt blev der fundet Papulaspora immersa, der ikke hidtil er anset for et problem på frøet. Derfor blev frøparti 015/00 anvendt i 2002 og 031/02 i 2003. Ved den efterfølgende growing on test i 2004 blev der klarlagt at Papulaspora immersa kan udgøre en sygdomsrisiko for frøplanter. Partiet (031/02) blev også anvendt i DJF forsøg 2004, hvor man ligeledes undersøgte partiet i blottertest. Her blev der fundet op til 93 % koloniserede frø med P. immersa, på trods af grundig sterilisering med NaOCl (Kåre Møller, pers information). Dette fund kan også tyde på at svampen kan være patogen. I 2004 havde frøpartiet 031/02 samtidig mistet noget af sin vitalitet (se kapitel 3), hvilket kan have indvirket på modtagelighed af sygdom.

Det kan således sammenfattes, at der er en stor sandsynlighed for, at de mest betydende patogene svampe, der skal bekæmpes af antagonister i de foreliggende undersøgelser er jordbårne Pythium spp. og jord- (og frø-)bårne Fusarium spp./Papulaspora immersa. Denne viden giver et bedre grundlag for valg af testorganismer til brug ved bekæmpelsesforsøg.

Fodnote

[1] Koch 1884 og 1890, men endelig formuleret af Federation of British Plant Pathologists 1937 som Koch’s postulates: (1) the suspected causal organism must be constantly associated with the disease; (2) it must be isolated and grown in pure culture; (3) when a healthy plant is inoculated with it, the original disease must be reproduced (4) the same organism must be reisolated from the experimentally infected plant (Holliday, 1989)

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 November 2005, © Miljøstyrelsen.