Miljøprojekt, 1062 – Kildeopsporing ved fænotypisk karakterisering af enterokokker

Kildeopsporing ved fænotypisk karakterisering af enterokokker

Sammenfatning og konklusioner

Ifølge Kommissionens forslag til et nyt badevandsdirektiv vil der fremover blive stillet større krav til at forbedre vandkvaliteten på badesteder, der ikke overholder kravene til den hygiejniske kvalitet. De hygiejniske parametre er indikatorbakterierne E. coli og fækale Enterokokker. For at forbedre vandkvaliteten på et forurenet badested er det nødvendigt at kende kilden til forureningen. Der er derfor behov for at afprøve metoder til bestemmelse af indikatorbakteriernes oprindelse.

En sådan metode er PhPlate rapid. Med denne metode kan man karakterisere bakterier på baggrund af deres fænotypiske egenskaber (engl.: phenotype, heraf navnet ph-plate). En bakteries fænotypiske egenskaber kan defineres som dens synlige fysiske egenskaber eller adfærd, f.eks. hvor hurtigt en bakterie vokser på forskellige substrater under bestemte forhold. Ved at gennemføre en fænotypisk bestemmelse af bakterier, der er isoleret fra en forurenet lokalitet, og bakterier, der er isoleret fra potentielle forureningskilder, og derefter lave en statistisk sammenligning mellem fænotyperne fra de forskellige lokaliteter, kan man identificere den lokalitet, der med størst sandsynlighed er kilden til forureningen.

Det har været dette projekts formål at undersøge, om PhPlate rapid screening for Enterokokker kan anvendes til kildesporing i badevand samt at anvende PhPlate rapid screening for Enterokokker til lokalisering af kilden til forurening i Vandet Sø Østende.

Vandet Sø er valgt som prøvetagningslokalitet, idet der i den østlige ende af søen er konstateret overskridelse af badevandskravene for E. coli i en periode. Endvidere er lokaliteten valgt, fordi Thisted Kommune gennem de senere år har undersøgt området og har peget på de mest sandsynlige forureningskilder.

Fra badevandsprøver og prøver fra potentielle forureningskilder er der isoleret Enterokokker til fænotypisk karakterisering. Isoleringen er foregået ved dyrkning på m-Enterokok agar og efterfølgende verifikation på galdeæskulin-agar. Det var målet at opnå 24 isolater fra hver af prøverne, undtaget gødningsprøverne, hvor det var målet at isolere 8 Enterokokker fra hver prøve. I projektet er der i alt isoleret 238 Enterokokker.

I PhPlate rapid screening undersøges Enterokokkernes evne til at vokse på forskellige relevante substrater. I en 12 x 8 brønds mikrotitrebakke er der nedlagt 11 tørrede substrater i hver af de 8 rækker. Ved analysens start tilsættes alle brøndene enterokoksubstrat med bromothymolblå som indikator for vækst. En enterokok-koloni suspenderes i den første brønd uden tørret substrat. Herfra pipetteres suspensionen ud i de 11 andre brønde. Dette gentages for hver af de 8 rækker. Pladen inkuberes og aflæses på en fladbed-scanner efter 16, 40 og 64 timer. Brønde med gul farveudvikling er positive.

Der er udtaget prøver fra badevandsstationen Vandet Sø Østende og fra potentielle forureningskilder den 21. august 2003 og den 10. september 2003. De undersøgte potentielle kilder var et nedsivningsanlæg, en afvandingskanal, en lejrskole, en gylletank, kokasser, bundmateriale fra badevandslokaliteten, samt ekskrementer fra fugle.

Inden analyse af prøver fra Vandet Sø Østende, er der blevet gennemført indledende analyser af kontrolstammer. Resultaterne var tilfredsstillende for to af tre kontrolstammer. Den tredje kontrolstamme har variabel fænotype, og analyseresultaterne for denne stamme varierede mere end forventet. Analyse af blindprøver viste, at der ind imellem sker en utilsigtet forurening i brøndene, hvilket medfører en vis usikkerhed. Analyse af referencestammer og dobbelt-analyse af udvalgte stammer fra prøverne viste, at variationen var på et acceptabelt niveau. På baggrund af den observerede variation er similaritets grænsen, hvorover bakterieisolater anses for at være ens, bestemt til 0,965.

Resultatet af de obligatoriske badevandsanalyser fra Vandet Sø Østende viste, at der i 2003 er sket en overskridelse af kvalitetskravene. Badevandsanalyserne stemte godt overens med analyserne af Enterokokker, som er udført i dette projekt.

Indholdet af Enterokokker i vandprøven, som var synligt påvirket af måger, var lavt. Det betyder, at forurening af prøven med fugleklatter ikke nødvendigvis giver anledning til enkeltstående forhøjede koncentrationer af Enterokokker i forbindelse med badevandsovervågning.

Similariteten mellem to prøver bestemmes på baggrund af den parvise similaritet mellem Enterokokker fra de to prøver. Den beregnes som antallet af par med similaritet større end 0,965 divideret med det samlede antal mulige par. For eksempel er similariteten mellem isolaterne i badevandsprøven og prøven udtaget i pumpekanalen den 21. august 0,367. Det betyder, at ud af de 420 mulige similaritetspar har 36,7% (= 154 par) en similaritet, der er større end 0,965. En similaritet på 1 betyder, at alle isolater i to prøver, der sammenlignes, er fænotypisk identiske. En similaritet på 0 betyder, at ingen af isolaterne i de to prøver har en similaritet over 0,965.

Undersøgelsens resultater viste, at similariteten mellem de tre badevandsprøver og prøven fra pumpekanalen var høj, idet 35-37% af isolaterne er fænotypisk identiske. Det kan tolkes som om, at pumpekanalen har været kilden til forurening. De lokale beboere har imidlertid oplyst, at pumpestationen ikke har været i drift hele sommeren, og inspektion af pumpestationen har vist, at vandstrømmen var fra søen og ind i pumpekanalen. Det er således mest sandsynligt, at søen er kilde til forurening i pumpekanalen og ikke omvendt.

Similariteten mellem badevandsprøverne udtaget den 21. august og den 10. september er høj og indikerer, at kilden til forureningen på badevandsstationen er den samme de to dage.

Derimod er similariteten mellem de øvrige potentielle kilder og badevandsprøverne ikke så entydige, at man kan pege på en forureningskilde med sikkerhed. Blandt de analyserede prøver er det kokasserne, der har størst similaritet med badevandsprøverne. Det er derfor kvæget, der med størst sandsynlighed er kilde til forureningen. Det blev dog fundet, at antallet af Enterokokker umiddelbart tæt på kvægvandingsstedet var lavt og fænotypisk var de helt forskellige fra Enterokokkene i badevandsprøverne. Derfor er der usikkerhed omkring konklusionen, og det foreslås, at der gennemføres en supplerende undersøgelse, hvor der udtages et antal prøver hen over badesæsonen for at bekræfte resultatet.

Kildesporingsmetoden kunne eftervise sammenhænge mellem badevandsstationen og pumpekanalen og kokasserne. Metoden viser imidlertid andre høje, men mindre forklarlige ligheder mellem prøver fra de andre lokaliteter, f.eks. mellem prøven fra nedsivningsanlægget (21. august) og prøven udtaget i gylletanken.

På baggrund af denne pilotundersøgelse kan det konkluderes, at PhPlate metoden kan påvise ligheder og forskelle mellem de fænotyper, der forekommer i badevandsprøverne og i potentielle forureningskilder. Metoden er dermed en lovende teknik til kildesporing.

Resultaterne indikerede, at metoden i nogle tilfælde er behæftet med nogen usikkerhed. Metoden kræver en vis routine for at opnå optimale resultater.