- 2.2 Flydende substrater - non-selektive bouilloner
- 2.3 Flydende substrater - selektive/indikative bouilloner
- 2.4 Faste substrater - non-selektive
- 2.5 Faste substrater - selektive/indikative
3 Diskussion
4 Anbefalinger
5 Litteratur
Forord
Miljøstyrelsen besluttede i december 2002 at indsamle og evaluere oplysninger om de akkrediterede miljølaboratoriers udførelse af substratkontrol. Baggrunden var dels et par sager med
uoverensstemmende resultater på grund af problemer med substraterne, dels den forestående revision af Miljøstyrelsens bekendtgørelse om kvalitetskrav til miljømålinger udført af akkrediterede laboratorier,
certificerede personer mv. (nr. 637 af 30. juni 1997).
Formålet var at fastsætte minimumskrav for udførelse af substratkontrol for at sikre en vis ensartethed mellem laboratorierne.
Spørgeskemaer blev udsendt til laboratorierne, og de indkomne svar er evalueret i denne rapport. Rapporten er opbygget med en systematisk gennemgang af substratgrupper og de enkelte substrater. De ni
laboratorier, der har besvaret spørgeskemaet, er anonymiserede i opgørelsen.
Projektet er udarbejdet af Miljøstyrelsens mikrobiologiske referencelaboratorium.
Vibeke From Jeppesen, Eurofins Danmark
Inger Guldbæk, Eurofins Danmark.
| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |
Evaluering af substratkontrol på de akkrediterede miljølaboratorier
Sammenfatning og konklusioner
Formålet med projektet har været at fastsætte minimumskrav for udførelse af substratkontrol for at sikre en vis ensartethed mellem de mikrobiologiske miljølaboratorier.
Spørgeskemaer blev udsendt til laboratorierne og de indkomne svar danner basis for evaluering af niveauet og omfanget af substratkontrol. I alt ni laboratorier har deltaget i undersøgelsen, svarene er
anonymiserede i denne rapport. Rapporten er opbygget med en systematisk gennemgang af substratgrupper og de enkelte substrater og afsluttes med anbefalinger om hyppighed og type af substratkontrol.
Det anbefales at kontrollere substrater batch vis når laboratoriet selv afvejer ingredienserne og for så vidt angår færdigfremstillede tørsubstrater anbefales kontrolfrekvensen at være per leverandørbatch.
Kontrol af fortyndingsvæsker anbefales at omfatte sammensætning, volumen og sterilitet. Non-selektive substrater anbefales desuden kontrolleret ved kvalitative evt. semikvantitative metoder, mens selektive
substrater bør kontrolleres ved kvantitative metoder.
Ved kontrol efter kvalitative og kvantitative metoder anbefales brug af relevante positive og negative kontrolstammer i relevante niveauer.
Summary and conclusions
The aim of this project was to set minimum demands for quality control of microbiological media in order to secure uniformity between the laboratories.
Questionnaires were sent to the laboratories and the answers were evaluated with respect to extent and level of quality control of media. Nine laboratories participated in the study. This report systematically
evaluates both types of media as well as the specific medias and recommendations are given concerning frequency and type of quality control method.
It is recommended to control media batch wise when the laboratory it self prepare the media from basic ingredients. If commercial manufactured media are used it is recommended to control each supplied
batch of media.
Quality control of dilution fluids is recommended to include composition, volume, pH, and sterility. Non-selective media are also recommended checked by qualitative or semi-quantitative methods, while
selective media should be checked by quantitative methods.
When checking by qualitative and quantitative methods it is recommended to use relevant positive and negative test strains in appropriate concentrations.
1 Indledning
Forudsætningen for tilfredsstillende kvalitet af mikrobiologiske analyser er, at der anvendes korrekte og ensartede dyrkningsmedier, som giver reproducerbare resultater. Kvalitetssikring af
substratproduktionen er derfor særdeles vigtig. Nationalt og internationalt arbejde med standardisering af metoder med det formål at frembringe sammenlignelige og reproducerbare resultater giver ikke
meget mening, såfremt analysegrundlaget ikke er pålideligt og reproducerbart. Kvaliteten af substraterne kan også bidrage til usikkerhedsbudgetterne, og kvalitetssikring af substrater er et krav i
analyselaboratoriernes akkrediteringsgrundlag: DS EN 17025, punkt 5.4: ”
Laboratoriet skal have instruktioner for anvendelse og betjening af alt relevant udstyr og for håndtering og forberedelse af emner til
prøvning og/eller kalibrering eller til begge dele, hvor mangel på sådanne instruktioner vil kunne forringe resultaterne af prøvninger og/eller kalibreringer.”
2 Resultater
2.1 Fortyndingsvæsker
2.1.1 Saltvandspeptonopløsning:
Der er i alt 9 besvarelser, hvoraf det fremgår at 1 laboratorium foretager ”
opformering”
, 7 laboratorier foretager volumenkontrol og 3 laboratorier foretager kontrol af pH. Kontrolfrekvensen varierer fra
hvert leverandørbatch til hvert fremstillet batch, daglig eller månedlig. 2 ud af 9 laboratorier oplyser, at de medtager negativ kontrol ved hver analyse.
Tabel 1 Saltvandspeptonopløsning, DS 6222 Bestemmelse af aerobt kimtal 22º
C og 37º
C.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Positive |
Negative |
Hyppighed |
Positive |
Negative |
1 |
Opformering, fortynding ÷
1 til ÷
12 |
- |
E. coli ukendt mængde |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
- |
Ved hver produktion kontrol på BA |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
Volumenkontrol |
|
|
Inkubation med upodet rør |
Hvert nyt fremstillet batch |
|
1 ml udsås i agar. |
4 |
pH + volumenkontrol |
|
|
|
pH ved fremstilling.
Volumen 1 gang årlig
|
|
|
5 |
pH + volumenkontrol |
|
|
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
|
Ja |
6 |
pH + volumenkontrol |
|
|
|
Hvert nyt fremstillet batch |
|
|
7 |
Volumenkontrol |
|
|
|
|
|
|
8 |
Volumenkontrol |
|
|
|
1 /måned |
|
|
9 |
Volumenkontrol + sterilkontrol |
WPCA |
|
|
Daglig |
|
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.1.2 Phosphatbuffer pH 7,0:
Der er i alt 7 besvarelser. 3 laboratorier foretager kontrol af volumen før ibrugtagning af mediet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch, per fremstillet batch eller månedlig. Sterilkontrol udføres
som negativ kontrol/blindprøve af 3 laboratorier ved hver analyse.
Tabel 2 Phosphatbuffer pH 7,0 DS 268 Bestemmelse af Pseudomonas aeruginosa.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Opformering, fortynding
÷
1 til ÷
12
|
- |
Ps.
aeruginosa |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
- |
Ved hver produktion kontrol på BA |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
Volumenkontrol |
|
|
|
|
|
+ |
5 |
Ref. ampul |
|
|
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
|
Ja |
6 |
Sterilkontrol |
|
|
|
|
|
Steril-kontrol |
7 |
Volumenkontrol |
|
|
|
|
|
|
8 |
Volumenkontrol+
sterilkontrol
|
|
|
|
1 /måned |
|
|
9 |
Sterilkontrol |
CN agar |
Ps.
aeruginosa
|
|
Hver analysedag |
Ps. aeruginosa |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.1.3 Phosphatbuffer pH 7,2:
I alt 6 besvarelser, hvoraf det fremgår at 3 laboratorier foretager kontrol af volumen før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandørbatch, per fremstillet batch eller periodisk.
Sterilkontrol udføres af 1 laboratorium som negativ kontrol ved hver analyse.
Tabel 3 Phosphatbuffer pH 7,2 DS 2256 Bestemmelse af Clostridium perfringens og DS 266 Bestemmelse af Salmonella.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Opformering, fortynding ÷
1-÷
12 |
- |
Cl. perfringens |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
Cl. perfringens ukendt mængde. |
Ved hver produktion kontrol på BA |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
Volumen-kontrol |
|
|
|
1/år |
|
|
5 |
Ref. ampul |
|
|
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
S. adabraka + Cl. perfringens |
Ja |
6 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
7 |
Volumen-kontrol |
|
|
|
|
|
|
8 |
Volumen-
kontrol+
sterilkontrol + ref. ampul
|
|
|
|
1 /måned |
|
|
9 |
Sterilkontrol + ref. ampul |
|
Cl. perfringens |
|
Per fremstillet/
indkøbt batch
|
Cl. perfringens |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.2 Flydende substrater – non-selektive bouilloner
2.2.1 Peptonholdig phosphatbuffer:
I alt 3 besvarelser. De 3 laboratorier foretager alle kontrol af substratets funktion før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. Positiv kontrol
medtages ved hver analyse af alle laboratorierne, og 2 laboratorier medtager desuden negativ kontrol ved hver analyse.
Tabel 4 Peptonholdig phosphatbuffer, DS 266 Bestemmelse af Salmonella.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
Salmonella |
Upodet substrat |
5 |
Fortynding ved ekstension |
TSB/TSA |
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
S. adabraka |
Ja |
6 |
Ukendt podemængde, påvist/ikke påvist |
- |
S. adabraka |
E. coli |
|
S. adabraka ukendt pode-mængde |
|
7 |
|
|
|
|
|
|
|
8 |
+/- Vækst på BLSF og XLD |
|
S. adabraka |
|
Start og slut af hvert nyt leverandør batch |
S. adabraka |
E. coli ukendt pode-mængde |
9 |
|
|
|
|
|
|
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.3 Flydende substrater – selektive/indikative bouilloner
2.3.1 Alkalisk peptonvand med polymixin B/colistin:
I alt 4 besvarelser. 3 laboratorier foretager kontrol af substratets funktion før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. Positiv kontrol medtages
ved hver analyse af 3 af laboratorierne, og 1 laboratorium medtager desuden negativ kontrol ved hver analyse.
Tabel 5 Alkalisk peptonvand med polymixin B/colistin, DS 3030 Bestemmelse af Vibrio vulnificus.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Positive |
Negative |
Hyppighed |
Positive |
Negative |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|
|
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
Vibrio vulnificus |
Ja |
6* |
Ukendt podemængde, påvist/ikke påvist |
|
|
|
|
Vibrio vulnificus ukendt podemængde |
|
7 |
Positiv kontrol |
|
Vibrio vulnificus |
E. coli |
Start og slut af hvert nyt leverandør batch |
Vibrio vulnificus |
|
8 |
|
|
|
|
|
|
|
9* |
Sterilkontrol |
Alkalisk peptonvand cellubiose col. |
|
|
Hvert nyt fremstillet batch |
|
|
*) analysen udføres ikke akkrediteret
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.3.2 Rappaport-Vassiliadis bouillon (R10)
I alt 3 besvarelser. Alle 3 laboratorier foretager kontrol af substratets funktion før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. Positiv kontrol
medtages ved hver analyse af alle 3 laboratorier, og 2 laboratorier medtager også negativ kontrol ved hver analyse.
Tabel 6 Rappaport-Vassiliadis bouillon (R10), DS 266 Bestemmelse af Salmonella.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
5 |
Fortynding ved ekstension |
TSB |
+ |
+ |
Hvert nyt fremstillet batch |
S. adabraka |
+ |
6 |
Ukendt podemængde, påvist/ikke påvist |
|
S. adabraka |
E. coli |
Hvert nyt leverandør batch |
S. adabraka ukendt pode-mængde |
E. coli ukendt pode-mængde |
7 |
|
|
|
|
|
|
|
8 |
+/- Vækst |
|
S. adabraka |
E. coli |
Start og slut af hvert nyt leverandør batch |
S. adabraka |
|
9 |
|
|
|
|
|
|
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.3.3 MacConkey enkelt og dobbeltstyrke:
I alt 9 besvarelser. 8 laboratorier foretager funktionskontrol af substratet før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. 4 laboratorier medtager
positiv kontrol ved hver analyse og 4 laboratorier medtager desuden negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 7 MacConkey bouillon, enkelt og dobbeltstyrke, DS 2255 Bestemmelse af coliforme bakterier og termotolerante coliforme bakterier.
Lab.
nr. |
Substratkontrol forud for
anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. Substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Opformering, fortynding ÷
1-÷
12 |
- |
E. coli |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
- |
Upodet MacConkeyrør |
2 |
Ampuller |
|
|
|
Hvert nyt fremstillet batch |
|
Blindprøve |
3 |
pH, sterilkontrol |
- |
- |
- |
- |
E. coli, ukendt
mængde |
50ml steril vand til 50 ml
MacConkey |
4 |
NMKL procedure nr. 10 pkt.
4.7.2 |
Gammelt substrat
batch |
E. coli ukendt
podemængde |
|
Hvert nyt leverandør batch |
E. coli, ukendt
mængde |
Upodet substrat + S. aureus ukendt
mængde |
5 |
Ref. ampul |
|
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
E. coli |
Ja |
6 |
Ukendt podemængde påvist/ikke
påvist |
- |
E. coli |
S. aureus, Ps.
aeruginosa |
Hvert nyt leverandør batch |
|
|
7 |
+/- typisk vækst |
TSB |
E. coli |
|
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
8 |
+/- typisk vækst |
TSB |
E. coli |
A. hydrophilia |
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
9 |
Sterilkontrol, vækstkontrol |
MacConkey |
E. coli |
|
Hver dag |
E. coli ukendt
mængde |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.3.4 Tryptonvand:
I alt 7 besvarelser. 4 laboratorier udfører funktionskontrol af substratet forud for analyse enten per leverandørbatch eller per fremstillet batch. 5 laboratorier medtager positiv kontrol ved hver analyse og 4
medtager også negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 8 Tryptonvand, DS 2255 Bestemmelse af coliforme bakterier og termotolerante coliforme bakterier.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Positive |
Negative |
Hyppighed |
Positive |
Negative |
1 |
Opformering, fortynding ÷
1-÷
12 |
- |
E. coli |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
- |
Upodet substrat |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
pH, sterilkontrol |
|
|
|
Hvert nyt fremstillet batch |
E. coli, ukendt mængde |
50 ml steril vand tilsættes til 50ml McConkey |
4 |
|
|
|
|
|
E. coli, ukendt mængde |
Upodet substrat + S. aureus ukendt mængde |
5 |
|
|
+ |
+ |
Hvert nyt fremstillet batch |
E. coli |
+ |
6 |
|
|
|
|
|
|
|
7 |
+/- Typisk vækst, +/- indol |
|
|
|
|
E. coli |
|
8 |
+/- Typisk vækst, +/- indol |
|
E. coli |
|
Start og slut af hvert nyt leverandør batch |
|
|
9 |
Sterilkontrol, vækstkontrol |
Tryptonvand |
E. coli |
|
Hver dag |
E. coli ukendt mængde |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.3.5 Laktose trypton lauryl sulfat bouillon:
I alt 6 besvarelser. Alle udfører funktionskontrol af substratet før ibrugtagning af substratet enten per fremstillet batch eller per leverandørbatch. 4 laboratorier medtager positiv kontrol ved hver analyse og 2
medtager desuden negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 9 Laktose trypton laurylsulfat bouillon, Mod ISO/DIS 9308-1 Bestemmelse af coliforme bakterier og E. coli.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Opformering, fortynding ÷
1-÷
12 |
- |
E.
coli |
Ps. aeruginosa |
Hvert nyt leverandør batch |
E. coli ukendt
mængde |
Upodet substrat |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
Sterilkontrol |
|
|
|
Hvert nyt fremstillet batch |
|
|
5 |
|
|
+ |
+ |
Hvert nyt fremstillet batch |
E. coli |
+ |
6 |
Ukendt podemængde påvist/ikke
påvist |
TSA |
E.
coli |
S. aureus, E.
faecalis |
Hvert nyt leverandør batch |
- |
- |
7 |
+/- Typisk vækst, +/- gas/indol |
|
|
|
|
E. coli |
|
8 |
+/- Typisk vækst, +/- luft/indol |
|
E.
coli |
|
Start og slut af hver nyt leverandør
batch |
|
|
9 |
Sterilkontrol, vækstkontrol |
Laktose trypton lauryl sulfat bouillon,
tryptonvand |
E.
coli |
|
Hver dag |
E. coli ukendt
mængde |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.4 Faste substrater – non-selektive
2.4.1 Trypton gærekstraktagar:
I alt 9 besvarelser. Alle foretager funktionskontrol af substratet før ibrugtagning af substratet. 6 laboratorier udfører kvantitativ substratkontrol. Kontrolfrekvensen er enten per leverandørbatch, per fremstillet
batch eller daglig. 6 laboratorier medtager negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 10 Trypton gærekstraktagar, DS 6622 Bestemmelse af aerobt kimtal 22º
C og 37º
C.
Lab.
nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. Substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Økometrisk kontrol |
- |
S. aureus, ukendt
mængde |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
- |
Upodet plade |
2 |
Ampul |
|
|
|
Hvert nyt leverandør batch |
|
Blindprøve |
3 |
pH, sterilkontrol |
|
|
|
Hvert nyt fremstillet batch |
|
”
Før”
og ”
efter”
kontrol på
hver flaske |
4 |
Mod. Miles-Misra, NMKL procedure nr. 10
pkt 4.7.1.4 |
Gammel substrat
batch |
|
|
Hvert nyt leverandør batch |
E. coli |
Upodet substrat |
5 |
Ref. ampul |
|
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
|
Ja |
6 |
Mod. Miles-Misra |
TSA |
E. coli |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
|
Steril kontrol |
7 |
Miles-Misra |
TSA |
E. coli |
|
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
8 |
Økometrisk kontrol |
|
Ps. florescences |
|
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
9* |
Sterilkontrol, vækstkontrol |
WPCA |
Ps. aeruginosa, B.
cereus |
|
Hver dag |
Ps. aeruginosa, B. cereus, ukendt
mængde |
|
*) analysen udføres ikke akkrediteret
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.4.2 Blodagar:
I alt 8 besvarelser. Alle foretager funktionskontrol af substratet før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. 3 laboratorier medtager positiv
kontrol ved hver analyse og 5 laboratorier medtager negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 11 Blodagar, DS 2217 Bestemmelse af kimtal 37º
C (MF), DS 3029 Bestemmelse af Legionella.
Lab.
nr. |
Substratkontrol forud for
anvendelse |
Ved hver
analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Positive |
Negative |
Hyppighed |
Positive |
Negative |
1 |
Økometrisk kontrol |
- |
S. aureus |
- |
Hver nyt leverandør batch |
- |
Steril kontrol (agar og upodet
fortyndingsvand) |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
pH, sterilkontrol |
- |
- |
- |
Hvert nyt fremstillet batch |
- |
Steril kontrol (agar og 100 ml steril vand) |
4 |
Sterilkontrol |
|
|
|
Hvert nyt fremstillet batch |
E. coli |
Upodet substrat |
5 |
Ref. ampul |
|
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
|
Ja |
6 |
Mod. Miles-Misra |
TSA |
S. aureus |
|
Hvert nyt leverandør batch |
|
Steril kontrol |
7 |
Miles-Misra |
TSA |
S. aureus, B.
cereus |
E. faecalis |
|
|
|
8 |
Økometrisk kontrol |
|
B. subtilis, E. coli |
|
Start og slut af hvert nyt leverandør
batch |
L. pneumophila |
|
9* |
Sterilkontrol, vækstkontrol |
Blodagar |
B. cereus |
|
Hver dag |
B. cereus, L.
pneumophila |
|
*) analysen udføres ikke akkrediteret
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5 Faste substrater – selektive/indikative
2.5.1 Membran laurylsulfat agar:
I alt 8 besvarelser. Alle laboratorierne foretager funktionskontrol af substratet før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandørbatch eller per fremstillet batch. 5 laboratorier medtager
positiv kontrol ved hver analyse og 4 medtager negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 12 Membran lauryl sulfat agar, Mod. ISO/DIS 9308-1 Bestemmelse af coliforme bakterier og E. coli.
Lab.
nr. |
Substratkontrol forud for
anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrol-metode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Økometrisk kontrol |
- |
E. coli |
Ps.
aeruginosa |
Hver nyt leverandør batch |
E. coli ukendt
mængde |
Upodet plade |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
pH, sterilkontrol |
TSA |
E. coli, min. 70% genfinding,
podeniveau 10-100 |
|
Hvert nyt leverandør batch |
E. coli, ukendt
mængde |
Steril plade |
4 |
NMKL procedure nr. 10 pkt.
4.7.1.4 |
Gammelt substrat
batch |
E. coli |
|
Hvert nyt leverandør batch |
E. coli |
Substrat med upodet fortyndingsvand
som er MF |
5 |
Ref. ampul |
|
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
|
Ja |
6 |
Mod. Miles-Misra |
TSA |
E. coli |
B. subtilis |
|
|
|
7 |
+/- typisk vækst |
TSA |
E. coli |
|
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
E. coli |
|
8 |
Økometrisk kontrol |
|
E. coli, L. freundii |
L. plant. |
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
9 |
Sterilkontrol, vækstkontrol |
Membran Lauryl
sulfat agar |
E. coli |
|
Hver dag |
E. coli ukendt
mængde |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.2 Slanetz og Bartley agar:
I alt 8 besvarelser. Alle foretager funktionskontrol af substratet før ibrugtagning af substratet. 5 laboratorier foretager kvantitativ substratkontrol. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per
fremstillet batch. 5 laboratorier medtager positiv kontrol ved hver analyse og 5 medtager negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 13 Slanetz og Bartley agar, Mod. ISO 7899-2 Bestemmelse af enterokokker (MF), DS 2401 Bestemmelse af enterokokker.
Lab.
nr. |
Substratkontrol forud for
anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. Substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Økometrisk kontrol |
- |
E. faecalis |
- |
Hvert nyt leverandør
batch |
E. faecium |
Upodet plade |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
pH, sterilkontrol |
TSA (hver nyt
leverandør batch) |
E. faecalis, min. 70%
genfinding, podeniveau
10-100 |
- |
Hvert nyt fremstillet
batch |
E. faecalis, ukendt
mængde |
100 ml steril vand filtreres |
4 |
Mod. Miles-Misra NMKL
procedure nr. 10 pkt. 4.7.1.4 |
Gammelt substrat
batch |
E. faecalis |
E. coli |
Hvert nyt leverandør
batch |
E. faecalis |
Substrat med upodet fortyndingsvand (100 ml). Substrat
podet med E. coli. ved overfladeudsæd: upodet plade. |
5 |
Ref. ampul |
|
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet
batch |
Enterococcus |
Ja |
6 |
Mod. Miles-Misra |
TSA |
E. faecalis, E. durans |
E. coli |
Hvert nyt leverandør
batch |
- |
- |
7 |
Miles-Misra |
TSA |
E. faecalis |
E. coli |
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
8 |
Økometrisk kontrol |
|
E. faecalis |
L.
plant. |
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
9* |
Sterilkontrol |
Slanetz og Bartley
agar |
Enterococcus |
|
Hver dag |
Enterococcus
ukendt mængde |
|
*) analyse efter DS 2401 udføres ikke akkrediteret
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.3 Galde esculin agar:
I alt 8 besvarelser. 4 foretager kvantitativ substratkontrol og 3 foretager kvalitativ substratkontrol før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandørbatch eller per fremstillet batch. 5
laboratorier medtager positiv kontrol ved hver analyse og 4 medtager negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 14 Galde esculin agar, Mod. ISO 7899-2 Bestemmelse af enterokokker.
Lab.
nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. Substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Økometrisk kontrol |
- |
E. faecalis |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
E. faecalis |
Upodet plade |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
pH, sterilkontrol |
TSA (hver nyt
leverandør batch) |
E. faecalis, min. 70% genfinding,
podeniveau 10-100 |
- |
Hvert nyt fremstillet batch |
E. faecalis, ukendt
mængde |
100 ml steril vand
filtreres |
4 |
Mod. Miles-Misra NMKL procedure nr.
10 pkt. 4.7.1.4 |
Gammelt substrat batch |
E. faecalis |
E. coli |
Hvert nyt leverandør batch |
E. faecalis |
Upodet substrat |
5 |
Ref. ampul |
|
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
Enterococcus |
Ja |
6 |
Ukendt podemængde påvist/ikke påvist |
|
E. faecalis, E. durans |
E. coli |
Hvert nyt leverandør batch |
|
|
7 |
± typisk vækst |
TSA |
E. faecalis |
E. coli |
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
8 |
Økometrisk kontrol |
|
E. faecalis |
L.
plant. |
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
9 |
Sterilkontrol |
Galde esculin agar |
Enterococcus |
|
Hver dag |
Enterococcus ukendt
mængde |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.4 Cellobiose colistin agar:
I alt 3 besvarelser. 2 laboratorier foretager kontrol af substratet før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. 1 laboratorium medtager såvel
positiv som negativ kontrol ved hver analyse.
Tabel 15 Cellobiose colistin agar, DS 3030 Bestemmelse af Vibrio vulnificus.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|
|
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
Vibrio vulnificus |
Ja |
6 |
|
|
|
|
|
|
|
7 |
Positiv kontrol |
|
Vibrio vulnificus |
E. coli |
Start og slut af hvert nyt leverandør batch |
|
|
8 |
|
|
|
|
|
|
|
9* |
Sterilkontrol |
Alkalisk peptonvand, cellubiose, colistin |
|
|
Hver dag |
|
|
*) analysen udføres ikke akkrediteret
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.5 Bufferet charcoal gærekstrakt agar med selektiv supplement (GVPC):
I alt 3 besvarelser. 2 laboratorier foretager kontrol af substratet før ibrugtagning. Kontrolfrekvensen er per leverandørbatch.
Tabel 16 GVPC, DS 3029 Bestemmelse af Legionella.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|
|
|
|
|
L. pneumophila |
Ja |
6 |
Mod. Miles-Misra |
Gammel batch |
L. pneumophila |
- |
Hvert leverandørbatch |
L. pneumophila ukendt podemængde |
- |
7 |
|
|
|
|
|
|
|
8 |
± Typisk vækst |
|
L. pneumophila |
|
Start og slut af hvert nyt leverandørbatch |
L. pneumophila |
|
9* |
Sterilkontrol |
BCYE |
L. pneumophila |
|
Hver dag |
L. pneumophila |
|
*) analysen udføres ikke akkrediteret
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.6 Bufferet charcoal gærekstrakt agar (BCYE):
I alt 4 besvarelser. 2 laboratorier foretager kontrol af substratet før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er per leverandørbatch eller daglig.
Tabel 17 BCYE, DS 3029 Bestemmelse af Legionella.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|
|
|
|
|
|
Ja |
6 |
|
|
L. pneumophila |
|
|
|
|
7 |
|
|
|
|
|
|
|
8 |
± Typisk vækst |
|
L. pneumophila |
|
Start og slut af hvert nyt leverandørbatch |
L. pneumophila |
|
9 |
Sterilkontrol |
BCYE |
L. pneumophila |
|
Hver dag |
L. pneumophila |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.7 Brilliantgrønt-laktose-saccharose-phenolrødt agar (BS agar):
I alt 2 besvarelser. Begge foretager funktionskontrol af substratet før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. Begge laboratorier medtager
positiv og negativ kontrol ved hver analyse.
Tabel 18 BS agar, DS 266 Bestemmelse af Salmonella.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
5 |
Økometrisk kontrol |
TSB/TSBA |
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
S. adabraka |
Ja |
6 |
Ukendt podemængde påvist/ikke påvist |
|
S. adabraka |
E. coli |
Hvert nyt leverandør batch |
S. adabraka ukendt podemængde |
E. coli ukendt podemængde |
7 |
|
|
|
|
|
|
|
8 |
|
|
|
|
|
|
|
9 |
|
|
|
|
|
|
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.8 Phenolrødt-mannitol agar:
I alt 3 besvarelser. Alle foretager funktionskontrol af substratet før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. 3 laboratorier medtager positiv og 2
medtager negativ kontrol ved hver analyse.
Tabel 19 Phenolrødt mannitol agar, DS 266 Bestemmelse af Salmonella.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
5 |
Økometrisk kontrol |
TSA |
Ja |
Ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
S. adabraka |
Ja |
6 |
Ukendt podemængde påvist/ikke påvist |
|
S. adabraka |
E. coli |
Hvert nyt leverandør batch |
S. adabraka ukendt podemængde |
E. coli ukendt podemængde |
7 |
|
|
|
|
|
|
|
8 |
Økometri |
|
S. adabraka |
L. plant. |
Start og slut af hver nyt leverandør batch |
S. adabraka |
|
9 |
|
|
|
|
|
|
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.9 Cetrimid nalidixinsyre-agar (CN agar):
I alt 8 besvarelser. Alle foretager kontrol af substratet før ibrugtagning og 4 laboratorier foretager kvantitativ substratkontrol. Kontrolfrekvensen er enten per leverandørbatch eller per fremstillet batch. 4
laboratorier medtager positiv og 4 medtager negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 20 CN agar, DS 268 Bestemmelse af Pseudomonas aeruginosa.
Lab.
nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. Substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Økometrisk kontrol |
- |
Ps. aeruginosa |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
- |
Steril kontrol (agar og upodet
fortyndingsvand) |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
pH, sterilkontrol |
TSA (hver nyt
leverandør batch) |
Ps. aeruginosa, min. 70% genfinding,
podeniveau 10-100 |
- |
Hvert nyt fremstillet batch |
Ps. aeruginosa, ukendt
mængde |
100 ml steril vand filtreres |
4 |
Mod. Miles-Misra NMKL procedure
nr. 10 pkt. 4.7.1.4 |
Gammel substrat batch |
Ps. aeruginosa, ukendt podemængde |
E.
coli |
Hvert nyt leverandør batch |
Ps. aeruginosa |
Upodet substrat |
5 |
Ref. ampul |
|
ja |
ja |
Hvert nyt fremstillet batch |
Ps. aeruginosa |
ja |
6 |
Mod. Miles-Misra |
TSA |
Ps. aeruginosa |
E.
coli |
Hvert nyt leverandør batch |
- |
- |
7 |
+/- typisk vækst |
TSA |
Ps. aeruginosa |
E.
coli |
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch |
|
|
8 |
Økometrisk kontrol |
|
Ps. aeruginosa |
E.
coli |
Start og slut af hvert nyt
leverandør batch
|
|
|
9 |
Steril kontrol |
CN agar |
Ps. aeruginosa |
|
Hver dag |
Ps. aeruginosa |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.10 Jernsulfit agar:
I alt 7 besvarelser. 6 laboratorier foretager kontrol før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. 4 laboratorier medtager positiv og 3 negativ
kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 21 Jernsulfit agar, DS 2256 Bestemmelse af Clostridium perfringens.
Lab.
nr. |
Substratkontrol forud for
anvendelse |
Ved hver
analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
Økometrisk kontrol |
- |
Cl.
perfringens |
- |
Hvert nyt leverandør batch |
Cl. perfringens, ukendt
podemængde |
Sterilkontrol (agar med upodet
fortyndingsvand) |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
Cl. perfringens ukendt
podemængde |
Upodet substrat |
5 |
Ref. ampul |
|
+ |
+ |
Hvert nyt fremstillet batch |
|
+ |
6 |
Mod. Miles-Misra |
Gammelt batch |
Cl.
perfringens |
E.
coli |
Hvert nyt leverandør batch |
- |
- |
7 |
+/- Typisk vækst, ref. ampul |
|
|
|
Start og slut af hvert nyt leverandør
batch |
|
|
8 |
+/- Typisk vækst, ref. ampul |
|
Cl.
perfringens |
|
Start og slut af hvert nyt leverandør
batch |
Cl. perfringens |
|
9 |
Steril kontrol |
JSA |
+ |
|
Hver dag |
Cl. perfringens |
|
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
2.5.11 R2A agar:
I alt 6 besvarelser, hvoraf det fremgår, at alle foretager kontrol før ibrugtagning af substratet. Kontrolfrekvensen er enten per leverandør batch eller per fremstillet batch. 1 laboratorium medtager positiv og 2
laboratorier medtager negativ kontrol/blindprøve ved hver analyse.
Tabel 22 R2A agar, DS 2402 Bestemmelse kimtal 37º
C, 44º
C, 55º
C, 65º
C.
Lab. nr. |
Substratkontrol forud for anvendelse |
Ved hver analyse |
|
Kontrolmetode |
Ref. substrat |
Pos. |
Neg. |
Hyppighed |
Pos. |
Neg. |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
Mod. Miles-Misra NMKL procedure nr. 10 pkt. 4.7.1.4 |
Gammel substrat batch |
|
|
Hvert nyt leverandør batch |
|
Upodet substrat |
5 |
Ref. ampul |
|
+ |
+ |
Hvert nyt fremstillet batch |
|
+ |
6* |
Mod. Miles-Misra |
TSA |
B. stearotermophilus |
|
Hvert nyt leverandør batch |
|
Sterilkontrol |
7 |
Miles-Misra |
TSA |
E. coli |
|
|
|
|
8 |
Økometrisk |
|
B. cereus E. coli |
|
Start og slut af hvert nyt leverandør batch |
|
|
9 |
Steril kontrol |
R2A |
B. cereus |
|
Hver dag |
B. cereus |
|
*) analysen udføres ikke akkrediteret
”
-”
: laboratoriet har sat et minus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
nej”
.
”
+”
: laboratoriet har sat et plus i feltet i spørgeskemaet, dette tolkes som et ”
ja”
.
Tom felt: laboratoriet har ikke besvaret spørgsmålet.
3 Diskussion
Det er vigtigt at mikrobiologiske dyrkningsmedier, herunder fortyndingsvæsker, er underkastet en kvalitetskontrol før de tages i anvendelse, idet nøjagtigheden af analyseresultater i høj grad afhænger af de
anvendte medier.
Der er mange måder at kontrollere substrater på. Det kan f.eks. være fysisk kontrol (dvs. farve, gelstyrke, homogenitet, overflade og lignende), pH-kontrol, sterilkontrol, volumenkontrol samt kontrol af om
de ønskede mikroorganismer kan vokse i tilstrækkelig antal på det pågældende medium og for de selektive medier også om vækst af de ikke-ønskede mikroorganismer hæmmes i tilstrækkeligt omfang.
Såfremt substratet er indikativ, bør det også undersøges om de korrekte typiske reaktioner opnås med målorganismerne.
Det fremgår af resultatet fra spørgeskemaerne, at alle de deltagende laboratorier, på nær et enkelt laboratorium, udfører kontrol af substrater. Funktionskontrolmetoderne varierer fra kvalitative til kvantitative
eller semi-kvantitative metoder afhængig af laboratorium og/eller substrattype.
Sterilitet kan eftervises ved dokumentation af autoklaveringen; tid, temperatur og fyldningsgrad af autoklave. Dette forudsætter, at den anvendte kombination af parametrene tid, temperatur og fyldningsgrad
en gang for alle er dokumenteret at resultere i sterile substrater. Sterilkontrol i form af mikrobiologiske analyser er egnede som verifikation af autoklavering, men er ikke brugbar som produktionsstyring.
Udover de nævnte funktionskontroller af de fremstillede substrater bør der foretages kontrol af pH og sterilitet af hvert batch. Sterilitetskontrollen kan som ovenfor nævnt bestå af kontrol af tid og temperatur
for hvert batch. Faktuelle tid-temperatur forhold for varmebehandlingen af hver batch bør være dokumenterede.
I mange tilfælde medtages negativ kontrol ved hver analyse. Resultatet af spørgeskemaerne viser at nogle laboratorier opfatter negativ kontrol (ved hver analyse) som et ikke inokuleret substrat (en
blindplade/-rør), andre laboratorier opfatter negativ kontrol som substrat podet med en negativ kontrolstamme og andre opfatter negativ kontrol som en analyse gennemført med fortyndingsvæske i stedet for
prøven. Sidstnævnte anbefales, idet man herved får dokumentation for korrekt aseptisk analyseforløb. På tilsvarende vis vil man ved medtagelse af en positiv kontrolstamme i lavt niveau kunne opnå
dokumentation for korrekt analyseforløb for så vidt angår overholdelse af tid og temperatur.
Såfremt der er vækst på den negative kontrol ved analysen, må resultatet forkastes. Årsagen til vækst kan enten være forurening under analyseforløbet eller et ikke sterilt udgangspunkt. Sidstnævnte vil ikke
kunne afvises såfremt der ikke er dokumentation for sterilitet af partiet i forbindelse med fremstilling. Miljøanalyser skal gennemføres indenfor 24 timer efter prøveudtagning, hvorfor det ikke er muligt at lave
analysen om på aflæsningstidspunktet, og det gælder derfor om at udelukke flest mulige fejlkilder før analysen i værksættes.
Hvis man ved hver analyse kun medtager positiv kontrolstamme og udelader sterilkontrollen (den upodede prøve) risikerer man ”
falsk positive resultater”
, fordi kontrollen af og dokumentationen for
aseptiske arbejdsgange under analyseforløbet mangler. I ganske mange tilfælde kan man ikke på den positive kontrolplade skelne mellem tilsatte bakterier og bakterier hidrørende fra evt. forureninger. Hvis
der er vækst på ”
steril kontrollen”
, bør analyseresultatet forkastes.
3.1 Fortyndingsvæsker
Opgørelsen i afsnit 2.1 viser, at langt den overvejende del af laboratorierne kontrollerer volumen af fortyndingsvæskerne. Korrekt sammensætning dokumenteres af nogle af laboratorierne ved kontrol af
fortyndingsvæskens pH. Sterilkontrol forud for anvendelse af mediet udføres systematisk af laboratorium nr. 8 og 9.
Fortyndingsvæskerne indeholder salte, så mikroorganismer ikke udsættes for osmotisk chok ved overførsel fra prøven til fortyndingsvæsken. Desuden er fortyndingsvæsker fattige på næringsstoffer, da
mikroorganismerne ikke skal vokse i fortyndingsmedierne, men blot kunne overleve. For at undgå vækst af mikroorganismerne i fortyndingsvæskerne, er det nødvendigt at begrænse opholdstiden i
fortyndingsvæsken. Tidsintervallet fra prøven overføres til fortyndingsvæsken og indtil substrat påhældes bliver dermed en kritisk faktor. DS 2250:1983 ”
Vandundersøgelse. Prøvetagning, transport og
opbevaring af prøver til mikrobiologisk undersøgelse”
giver ingen vejledning herom, men i EN ISO 6222 beskrives at der max må være 15 minutter mellem tilsætning af prøven (eller fortynding heraf) og
agaren. NMKL nr. 91:2002 pkt. 7.5 beskriver, at der max må hengå 45 minutter fra fremstilling af 10-1 fortyndingen til sammenblanding med substrat.
For at sikre nøjagtige resultater af analyserne, er det vigtigt, at der anvendes korrekt volumen af fortyndingsvæsker og at fortyndingsvæskerne er sterile.
3.2 Flydende substrater - Non-selektive bouilloner
Formålet med anvendelse af mediet bør danne udgangspunkt for typen af kvalitetskontrol, der er forskel på den nødvendige præcision ved bestemmelse af kimtal som antal kolonidannende enheder og
undersøgelse for patogene mikroorganismer såsom salmonella. I sidstnævnte tilfælde er man interesseret i at kunne detektere meget lavgradige forureninger, uanset bakteriecellerne kan være, og ofte er,
stressede eller beskadigede. Ofte leder man efter ”
bakterien”
.
Udover at dokumentere sammensætning (fx målt ved pH) og sterilitet bør funktionaliteten af mediet dokumenteres før ibrugtagning af batch. Da man ikke kan tælle kolonidannende enheder på samme måde i
bouilloner som på faste substrater, må man i hvert enkelt tilfælde overveje hvorvidt kvalitativ eller semikvantitativ kontrol af funktionaliteten er nødvendig. For så vidt angår phosphatbuffer med pepton
anbefales semi-kvantitativ kontrol, idet evnen til opfriskning af stressede og eller beskadigede celler er væsentlig.
Spørgeskema undersøgelserne viser at 3 ud af 4 laboratorier foretager funktionskontrol af flydende non-selektive substrater før ibrugtagning af disse.
Eksempler på semi-kvantitativ kontrol er podning af flydende medier med mikroorganismer og efter inkubering at aflæse den uklarhed som vækst af mikroorganismerne har givet anledning til. Wickerhams
kort kan anvendes som måleskala, kombineret med mikroskopi til bekræftelse af vækst af renkultur af den tilsatte organisme. En anden semi-kvantitativ kontrolmetode er fortyndingsmetoden, hvorved der
fremstilles en fortyndingsrække af den opformerede kontrolstamme. Fra hver fortynding inokuleres 5 rør af det medium, der skal kontrolleres. Efter inkubation aflæses rørene for vækst og MPN værdien
bestemmes. Produktivitetsforholdet bestemmes som forholdet mellem MPN værdien for det medium der skal kontrolleres og MPN værdien for reference mediet.
3.3 Flydende substrater - Selektive/indikative bouilloner
Ud over ovennævnte dokumentation af funktionaliteten; selve væksten af de ønskede mikroorganismerne og hæmning af de ”
ikke-ønskede”
mikroorganismer bør de indikative parametre også
dokumenteres. Det anbefales at udføre batch kontrollen (dvs. forud for anvendelse af substratet) med såvel en positiv kontrolstamme som en negativ kontrolstamme. Under selve analysen er det tilstrækkelig
at medtage en positiv kontrolstamme og en sterilkontrol i form af en ikke-podet prøve til dokumentation af korrekt analyseforløb. Selektive og/eller indikative bouilloner kan kontrolleres med ovennævnte
semi-kvantitative metode, i kombination med registrering af at de indikative parametre virker.
Det fremgår af resultaterne af spørgeskema undersøgelserne at over 80% af laboratorierne foretager kontrol af de flydende substraters funktion før ibrugtagning.
3.4 Faste substrater - Non-selektive faste substrater
Kontrol af non-selektive substrater foretages ved kvantitativ eller semi-kvantitativ kontrol af funktionaliteten, såkaldt Growth Promotion Test (GPT), enten med modificeret Miles Misra metode eller ved
økometrisk metode (semi-kvantitativ). Ved Miles Misra metoden undersøges væksten af den for mediet relevante mikroorganisme overfor væksten af samme mikroorganisme på non-selektiv
referencesubstrat eller overfor foregående batch af samme medium. Produktivitetsforholdet (Productivity Ratio, PR-værdi) beregnes som forholdet mellem kolonitallet på det undersøgte medium og
kolonitallet på referencemediet. For ikke- selektive medier anbefales i flg. NMKL proceduren en PR værdi på minimum 0,7.
Ved den økometriske metode bestemmes det absolutte vækstindeks (Absolute Growth Index, AGI). En overnatskultur af kontrolorganismen udstryges i et bestemt mønster på overfladen af det medium der
skal testes. Efter inkubation aflæses hvilke streger (i udstrygningsmønsteret), der giver anledning til vækst, dette omsættes til en talværdi på en skala fra 0 til 5. Ikke selektive medier bør have AGI over 3.
Ved kontrol af non-selektive faste substrater er det tilstrækkeligt at medtage positive kontrolstammer.
Spørgeskema undersøgelserne viser at over 70% af laboratorierne foretager kontrol af substraterne forud for anvendelse enten ved modificeret Miles Misra metoden, ved økometrisk kontrol eller ved vækst
kontrol.
3.5 Faste substrater - Selektive og/eller indikative faste substrater
For denne gruppe anbefales det at foretage kvantitativ funktionskontrol af substratet forud for anvendelse. Heri bør indgå såvel en positiv kontrolstamme i lavt niveau som en negativ kontrolstamme i højt
niveau, således at både vækst af ”
målorganismen”
og den logaritmiske hæmning af følgefloraen kan dokumenteres. Ligeledes bør der være dokumentation for korrekte indikative reaktioner.
For selektive medier anbefales en log-5 forskel på produktivitetsforholdet (PR værdien) for negative og positive kontrolstammer. NMKL procedure nr. 10 anbefaler PR værdier på minimum 0,5 for positive
kontrolstammer på selektive medier og PR på max 0,00001 for negative kontrolstammer, ved substratkontrol efter Miles Misra metoden. Anvendes den økometriske metode til selektive medier anbefales
absolut vækstindeks for positive kontrolstammer over 2,5 og AGI under 2,0 for negative kontrolstammer.
Under selve analysen vil det være tilstrækkelig at medtage en positiv kontrolstamme og en sterilkontrol (en ikke podet prøve) til dokumentation af korrekt analyseforløb.
3.6 Kontrolstammer
Valget af hvilken type kontrolstamme, der skal anvendes, afhænger af dyrkningsmediet. For selektive og/eller indikative medier anvendes de for mediet relevante positive kontrolstammer (jvf. nedenstående
tabel). I nogle tilfælde kan det være relevant at supplere med biokemisk atypiske kontrolstammer. Sidstnævnte kunne fx være tilfældet hvis der i et medium er indbygget flere selektive/indikative principper.
For non-selektive medier vælges mikroorganismer, som kan vokse på mediet, og som findes i den matrix man anvender analysen til. Således er det relevant, jvf. tabel 10, at anvende E. coli og Pseudomonas
fluorescens som positiv kontrol til Trypton gærekstrakt agar og mindre relevant at anvende en S. aureus stamme, idet førstnævnte er naturligt forekommende i vand, det er S. aureus ikke.
Nedenstående tabel er et eksempel på hvilke mikroorganismer det kunne være relevante at anvende til kontrol af de forskellige dyrkningsmedier, men der vil let kunne argumenteres for brug af andre og flere
lige så relevante mikroorganismer, jvf. ovenstående om selektive og indikative dyrkningsmedier.
Tabel 23 Eksempler på relevante kontrolstammer.
Dyrknings medium |
Metode |
Mål organisme |
Positiv
kontrol
|
Negativ
kontrol
|
Bemærkninger |
Peptonholdig phosphatbuffer |
DS 266 |
Salmonella |
Salmonella adabraka |
- |
Non-selektiv |
Alkalisk peptonvand med polymixin B/colistin |
DS 3030 |
Vibrio |
Vibrio vulnificus |
E. coli |
|
Rappaport-Vassiliadis bouillon |
DS 266 |
Salmonella |
S. adabraka |
E. coli |
|
MacConkey bouillon |
DS 2255 |
Coliforme bakterier og E. coli |
E. coli |
S. aureus |
|
Tryptonvand |
DS 2255 |
Coliforme bakterier og E. coli |
E. coli |
Enterobacter aerogenes |
|
Laktose trypton laurylsulfat bouillon |
Mod ISO/DIS 9308-1 |
Coliforme bakterier og E.coli |
E. coli |
Staph. aureus |
|
Trypton gærekstrakt |
DS 6222 |
Non-selektiv |
E. coli 37º
C/
Pseudomonas fluorescens 22º
C
|
- |
Non-selektiv |
Blodagar |
DS 2217/ DS 3029 |
Non-selektiv |
S. aureus |
|
Non-selektiv |
Membran laurylsulfat agar |
Mod ISO/DIS 9308-1 |
Coliforme bakterier og E.coli |
E. coli |
Staph. aureus |
|
Slanetz og Bartley agar |
Mod ISO 7899-2 og DS 2401 |
Enterokokker |
Enterococcus faecalis |
E. coli |
|
Galde esculin agar |
Mod ISO 7899-2 |
Enterokokker |
Enterococcus faecalis |
E. coli |
|
Cellobiose colistin agar |
DS 3030 |
Vibrio vulnificus |
Vibrio vulnificus |
E. coli |
|
GVPC |
DS 3029 |
Legionella |
Legionella pneumophila |
E. coli |
|
Brilliantgrønt-laktose-saccharose-phenolrødtagar (BS agar) |
DS 266 |
Salmonella |
Salmonella adabraka |
E. coli |
|
Phenolrødt agar |
DS266 |
Salmonella |
Salmonella adabraka |
E. coli |
|
Cetrimid nalidixinsyre agar (CN agar) |
DS 268 |
Pseudomonas aeruginosa |
Pseudomonas aeruginosa |
E. coli |
|
Jernsulfit agar |
DS 2256 |
Clostridium perfringens |
Clostridium perfringens |
E. coli |
|
R2A agar |
DS 2402 |
Varmt vands kim |
E. coli (37+44)
Bacillus stearothermophilus (55)
Thermus spp. (65)
|
|
|
Ved anvendelse af positive og negative kontrolstammer er det vigtigt, jvf. DS EN 17025 og EAL Guidelines for Microbiology, at disse er sporbare til en anerkendt kultursamling. Anvendelse af
bakteriestammer skal foregå styret, idet en n'te generations bakterie ikke kan have samme egenskaber som naturligt forekommende bakterier. Bakterier kan hurtigt tilpasse sig laboratorieforhold med det
resultat, at man risikerer, at man ved hjælp af standardmetoder ikke kan påvise naturligt forekommende bakterier. Man bør ikke benytte sig af ældre kulturer end 5. generation fra moderstammen.
Det podeniveau der anvendes ved substratkontrollen er en væsentlig faktor. Ved analyserne skal laboratorierne kunne detektere mikroorganismer i lavt antal, og substratkontrollen skal kunne vise, at medier
er i stand til at restituere mikroorganismer i lavt antal. Desuden er det vigtig at undgå problemer med sammenflydning af kolonier og overvoksede plader, således at korrekt kolonimorfologi og tilstedeværelse
af renkultur ikke kan kontrolleres. I de fleste tilfælde vil det være fornuftigt at anvende et podeniveau på 10 til 100 cfu af positive kontrolstammer. Når det drejer sig om de negative kontrolstammer er
situationen den modsatte, idet selektive medier skal kunne modstå et vist pres fra følgefloraen og ofte vil det være fornuftigt at anvende 10.000 til 100.000 cfu som podeniveau.
3.7 Hyppighed af substratkontrol
Spørgeskema undersøgelsen viser at hyppigheden af substratkontrol i form af GPT-test er per leverandørbatch eller per fremstillet batch. Nødvendigheden af at udføre GPT-test på hvert fremstillet batch kan
diskuteres. Producenter af tørsubstrater udfører typisk GPT-test forud for frigivelse af partier til salg, og ofte medfølger denne kvalitetsdokumentation, når laboratorier indkøber dyrkningsmedier. Såfremt
laboratoriet benytter sig af færdigblandede tørsubstrater, vil det ofte være tilstrækkeligt at udføre én GPT-test per leverandørbatch. Dette forudsætter (jvf. ISO 7218) at tørsubstrat opbevares ved anvist
temperatur, at det anvendes indenfor holdbarhedstiden, at tørsubstratet ikke klumper og ikke smuldrer, at der ikke er misfarvninger, at korrekt mængde tørsubstrat afvejes til korrekt mængde vand og at
varmebehandlingen gennemføres korrekt. I NMKL procedure nr. 10 beskrives det, at såfremt laboratoriet benytter ISO 9000 godkendte leverandører af tørsubstrater vil det være tilstrækkeligt at udføre
GPT test når der tages en ny type substrat i arbejde i laboratoriet eller hvis laboratoriet skifter leverandør.
Dyrkningsmedier som laboratoriet selv fremstiller ved afvejning af enkelt ingredienser er behæftet med større usikkerhed, og det vil derfor være hensigtsmæssigt at udføre GPT test med større hyppighed fx
på hvert fremstillet batch.
4 Anbefalinger
4.1 Fortyndingsvæsker
Følgende tre faktorer anbefales at indgå i kontrollen af fortyndingsvæsker: Korrekt sammensætning (dokumenteret ved fx afvejningskontrol og pH), korrekt volumen og sterilitet (dokumentation af faktisk
varmebehandling). Frekvensen for kontrol bør være for hvert fremstillet batch.
4.2 Flydende substrater – Non-selektive
For non-selektive bouilloner anbefales kontrollen desuden at omfatte kvalitativ eller semi-kvantitativ kontrol fx udført som beskrevet under punkt 3.2. Der bør anvendes en relevant positive kontrolstamme i
lavt niveau. Kontrolfrekvensen herfor anbefales at være per leverandørbatch såfremt man benytter sig af færdigblandede tørsubstrater, og per fremstillet batch såfremt laboratoriet selv afvejer alle
ingredienserne. Dokumentation for korrekt sammensætning og sterilitet bør under alle omstændigheder foretages per fremstillet batch.
4.3 Flydende substrater – Selektive og/eller indikative
For selektive og/eller indikative bouilloner anbefales kontrollen gennemført som beskrevet for non-selektive bouilloner, dog med yderligere anvendelse af en negativ kontrolstamme i højt niveau.
4.4 Faste substrater – Non-selektive faste substrater
Non-selektive faste substrater anbefales kontrolleret med kvantitative eller semi-kvantitative metoder. Der bør anvendes en relevant positiv kontrolstamme i lavt niveau. Kontrolfrekvensen herfor anbefales at
være per leverandørbatch, såfremt man benytter sig af færdigblandede tørsubstrater, og per fremstillet batch såfremt laboratoriet selv afvejer alle ingredienserne. Dokumentation for korrekt sammensætning
og sterilitet bør under alle omstændigheder foretages per fremstillet batch.
4.5 Faste substrater – Selektive og/eller indikative faste substrater
For selektive og/eller indikative faste substrater anbefales kontrollen gennemført som beskrevet for non-selektive faste substrater, jvf. 4.4. Der bør dog også anvendes en negativ kontrolstamme i højt niveau.
Opnåelse af de indikative principper bør dokumenteres.
De anbefalede kontrolfrekvenser er under forudsætning af, at kontrol af laboratoriets vandforsyning, vægte og driftskontrol af autoklavering er omfattet af god laboratoriepraksis og derved sikrer ensartede
fremstillingsbetingelser fra gang til gang.
Det anbefales at medtage såvel positiv som negativ kontrol i alle analysetrin, således at korrekt analyseforløb kan dokumenteres. Også her gælder det, at man bør kende sit podeniveau for den positive
kontrol organisme, og helst vælge den i niveauet lige over detektionsgrænsen for analysen.
Kontrol/dokumentation af korrekt analyseforløb hører under proceskontrollen – på samme måde som kontrol/dokumentation af inkuberingstid og -temperatur.
5 Litteratur
DS/EN ISO/IEC 17025 1. udgave 2000-04-27 Generelle krav til prøvnings- og kalibreringslaboratoriers kompetence
NMKL prosedyre nr. 10 (2001) Kontrol av mikrobiologiske dyrkningsmedier. Versjon 1. 26. november 2001
DS 2250. 1983 Vandundersøgelse. prøvetagning, transport og opbevaring af prøver til mikrobiologisk undersøgelse.
NMKL nr. 91 2001 Prøveudtagning og forbehandling af levnedsmidler og foderstoffer til kvantitativ mikrobiologisk undersøgelse.
EAL G18 Accreditation for Laboratoriums Performing Microbiological Testing. 1. Ed. 1996.
UKAS Lab 31 Use of Culture Media Procured Ready-to-use or Partially Completed in Microbiological Testing. 1. Ed. 2000.
DS/EN ISO 6222 1. udg. 2000 Vandundersøgelse. Bestemmelse af antal mikroorganismer i gærekstraktagar ved 22º
C og36º
C. Dybdeudsæd
| Til Top | | Forside |
Version 1.0 Februar 2006 • © Miljøstyrelsen.