Miljøvurdering af termisk assisteret jordrensning (dampoprensning)
4 Det mikrobielle samfund
4.1 Introduktion
Længere tids opvarmning af jord kan potentielt ændre væsentligt på sammensætningen af det mikrobielle samfund i jorden. Det er således kendt, at sporer fra varmeresistente sporedannende bakterier kan spire ved varmepåvirkning /5/, samt at mange typer af svampe, der findes i jord, generelt kan tolerere og gro ved høje temperaturer /6/. Der er derfor god grund til at undersøge om dampremediering har en økotoksikologisk effekt på de mikrobiologiske samfund, dels kortvarigt og dels på længere sigt. Specielt kan længere tids opvarmning af jord potentielt selektere for humant patogene bakterier og svampe, og dermed kan denne remedieringsform udgøre en sundhedsrisiko for mennesker, der færdes i området.
En enkelt undersøgelse af Richardson m.fl. /7/ har vist at den mikrobielle aktivitet under dampbehandling var under detektionsgrænsen, men efter dampbehandlingen var den på samme niveau som før dampbehandling. Yderligere fandt Richardson m.fl. at specifikke mesophile fremmedstofnedbrydende bakterier samt både archeabakterier og eubakterier overlevede dampbehandlingen. Denne undersøgelse fokuserede dog ikke på ændringer i sammensætningen af bakteriesamfundene eller på eventuelle effekter på andre mikroorganismer.
Der eksisterer således ingen af os kendte undersøgelser, der fokuserer på ændringer i sammensætningen af de mikrobiologiske samfund ved remediering af forurenet jord med dampinjektion. Målet for denne undersøgelse var derfor at undersøge udviklingen af de mikrobielle samfund i de øverste jordlag under og efter remediering med damp.
4.2 Nitrifikation
For at vurdere konsekvenserne på det mikrobielle samfund kan funktionelle mikrobielle tests, hvor mineraliseringen af f.eks. kvælstof eller kulstof følges, være anvendelige. Ofte er de dog meget ufølsomme, da selv meget store ændringer i bakteriesamfundet i nogle tilfælde ikke registreres ved generelle funktionsmålinger som f.eks. jordrespiration (CO2 produktion) eller omsætning af forskellige kulstofkilder. Omvendt er specialiserede funktioner i mange tilfælde ikke repræsentative for samfundet. Oxidationen af ammonium (NH4+) via nitrit (NO2-) til nitrat (NO3-) er et vigtigt led i kvælstoffets kredsløb, og de involverede bakterier er autotrofe (de får energi fra omsætningen af hhv. NH4+ og NO2-) og repræsenterer dermed et andet udsnit af den mikrobielle biomasse end de grupper, som udgør ”nedbrydersamfundet”. Den potentielle NH4+-oxidation antages at være proportional med antallet af bakterier, som kan udføre denne proces, og er derfor generelt anerkendt som en god indikator for uacceptable effekter på det mikrobielle samfund. I denne undersøgelse måles der – gennem en tidsserie - samlet for produktionen af nitrit og nitrat ved at reducere nitrat over en kobber/cadmium søjle. Ammonium oxidationsraten bestemmes herefter ved at koble den producerede nitrit med et farvestof (N-(1-nafthyl)ethylendiamin dihydroklorid), der måles spektrofotometrisk ved 520 nm på et Lachat-apparat. Hver jordprøve blev indsamlet som to ”poolet” prøver af nærtliggende nedstik (10 cm dybe) med et smalt jordbor. Alt i alt ca. 100 gram jord, som blev sigtet gennem 4 mm inden analyser.
Den potentielle ammonium oxidationsrate blev undersøgt i efteråret (september) 2001 og i det tidlige forår (marts) 2002. Målingerne fra 2001 viser relativ lav variation mellem replikater, men relativ stor variation mellem de enkelte områder (Figur 4.1), om end de ligger inden for en radius af under 25 meter. Sammenholdt med den mikroskala, hvor bakterier opererer er denne afstand dog betragtelig. Omsætningsraten af kvælstof i disse prøver fra græsplæner er sammenlignelige med de rater, vi tidligere har fundet i landbrugsjorder (0,2-0,5 mg N kg-1 t-1).
I vinteren 2002 steg variationen mellem prøverne betydeligt i alle områder inklusive referenceområdet. Hvor ammonium oxidationen stort set var uændret i referenceområdet – på trods af de forskellige årstider for indsamling - var den steget betydeligt i område A. Der er derfor ikke noget som tyder på, at dampinjektion vil have nogen langvarig og negativ indflydelse på jorden mikrobielle omsætning af ammonium, snarere at dampinjektion kan stimulere visse mikrobielle processer i jorden specielt i f.eks. vinterperioder, hvor der normalt vil være lav generel mikrobiel aktivitet.
Figur 4.1. Den potentielle ammonium oxidation på tre forsøgsområder før (sept. 01) og efter (marts 02) dampinjektion.
4.3 Sammensætning af det mikrobielle samfund
Ændringer i de mikrobielle samfund som følge af dampinjektion er blevet undersøgt før (prøveudtag 1; 11-09-2001), under (prøveudtag 2; 15-03-2002), samt efter (prøveudtag 3; 19-09-2002) dampbehandlingen. Prøverne blev udtaget fra samme lokaliteter som jordfaunaprøverne, det vil sige område A, B samt referenceområdet 15-20 meter væk fra dampboring 140 og 141. Fire prøver af overfladejord samt fire prøver med jord fra ca. 50 cm dybde af ca. 100 gram/stk. blev udtaget ved hver prøvetagning.
Jordprøver blev udtaget med jordbor og jorden blev efterfølgende sigtet gennem en 4 mm sigte og homogeniseret i en stor plasticpose på stedet. Sigten blev renset grundigt mellem hver sigtning. Jordprøverne blev herefter delt og bragt til GEUS i København samt sendt med posten til DJF i Foulum. Jorden på GEUS er opbevaret i køleskab ved 4 grader indtil næste dag, hvor analyserne påbegyndtes.
4.3.1 Antal af bakterier og svampe
Koloniformende enheder (CFU), bakterier
Fra hver prøve blev udtaget 1,5 gram jord, der blev udrystet grundigt i 0,01M phosphate-buffer. Efter 20 minutters sedimentation blev 1/10 fortyndingsrækker lavet og antallet af koloniformende enheder blev undersøgt ved at udplade 50 µl fra 2 relevante fortyndinger på 1/10 TSA agarplader. 1/10 TSA er et generelt medie, som vi har erfaring med, er det bedste medie til bredt at isolere bakterier fra jordprøver på. Pladerne blev inkuberet dels ved 20°C, som er en normal inkubationstemperatur ved isolering af bakterier fra jord, og dels ved 42°C for at isolere varmeresistente stammer. Pladerne blev talt efter 24 og 48 timers inkubation.
Figur 4.2. Bakterielle CFU for overjorden i område A ved inkubationstemperaturerne 20°C og 42°C. Prøveindsamlingen forløb før (1), under (2) og efter (3) dampinjektion.
Antallet af CFU ved 20°C inkubationstemperatur (fig. 4.2) er faldende i både dampområdet som i referencejord fra september 2001 til marts 2002. Herefter stiger CFU-tallene i den behandlede jord, mens tallet i referencejorden forbliver konstant. Ved 42°C inkubationstemperatur er CFU-tallet i referencejorden relativt konstant, mens tallet i den behandlede jord er stigende. Lignende mønster ses i underjorden (data er ikke medtaget).
Koloniformende enheder af slægten Pseudomonas:
Fortyndingsrækker blev udpladet på Goulds S1 agarplader. Goulds S1 er et medie, der er udviklet til at være specifikt for bakterier af slægten Pseudomonas sp. /11. Plader blev inkuberet ved 20°C, som er en temperatur, hvor de fleste kendte Pseudomonas sp kan vokse, og ved 42°C, hvor kun Pseudomonas aeruginosa, som er et kendt opportunistisk humant patogen, kan vokse.
Isolater på Goulds S1 ved 42°C karakteriseres fænotypisk med API 20 NE bakterie identifikationssystemet. Antallet af Pseudomonas sp. CFU ved 20°C inkubationstemperatur er svagt faldende i både behandlet og referencejord. Ved 42°C inkubationstemperatur er CFU-tallet i referencejorden konstant (ingen kolonier) mens tallet i den behandlede jord er under detektionsgrænsen før behandlingen med en kraftig stigning efter behandlingen (figur 4.3).
Ved prøvetagning under dampbehandlingen (marts 2002) fandt vi (formodentlig på grund af nedbrydning af vores fungicid i pladerne fra denne runde) kraftig vækst af svampelignende kolonier på Goulds-pladerne fra den dampbehandlede jord. Disse var tydeligt ikke tilhørende slægten Pseudomonas sp. og er derfor ikke afbilledet på graferne. Dette svampelignende isolat er senere identificeret som Aspergillus fumigatus (se nedenfor).
Figur 4.3. Antal koloniformende enheder (CFU) fra dampbehandlet overjord (gennemsnit fra område A og B og reference-overjord ved inkubation ved 20°C og 42°C på Pseudomonas sp. specifikt medie Goulds S1. Prøveindsamlingen forløb før (1), under (2) og efter (3) dampinjektion. Bemærk at antal Pseudomnas sp CFU 42°C ved prøvetagning 2 er bestemt (formodentlig fejlagtigt) lavt pga. overgroning af pladerne med svampen Aspergillus fumigatus.
Forholdet mellem antal CFU ved 42°C og antal CFU ved 20°C på Goulds S1 medie
I september 2001 før dampinjektionen voksede der ingen Pseudomonas sp. ved 42°C fra referencejorden eller de andre forsøgsområder. Ved prøvetagning i marts 2002 blev prøverne ødelagt af uventet svampevækst og ved prøvetagning 3 var forholdet mellem Pseudomonas sp. i stand til at gro ved 42°C og 20°C helt oppe på 60%.
Vi observerede to koloni-morfologityper hos kolonier isoleret ved 42°C. En type (ca. 5 %) fluorescerede under UV-lys mens den anden (ca. 95%) ikke var fluorescerende. Disse to isolater blev testet på API 20 NE og blev begge (på trods af små forskelle i nedbrydningsprofiler) identificeret (den ene med 99% sikkerhed og den anden med ”størst sandsynlighed”) som værende stammer af Pseudomonas aeruginosa.
Koloniformende enheder (CFU), svampe
Ved prøvetagning i marts 2002 skete der som beskrevet ovenfor fund af svampen Aspergillus fumigatus. Antallet af isolerede Aspergillus fumigatus på Goulds S1 var 16600 CFU/g tør jord (overjord), og 19200 CFU/g tør jord (underjord), hvorimod der ingen vækst var at finde i referencejorden. Derfor blev prøverne fra september 2002 analyseret for indholdet af svampe generelt og A. fumigatus specifikt på V8-medie ved 25°C, CFD-tallet angiver i praksis antallet af sporer (hvilestadier) af svampene. Disse analyser blev foretaget af Susanne Elmholt fra Dansk Jordbrugsforskning (DJF).
Der blev fundet betydelige mængder af A. fumigatus i de dampbehandlede jorde ved prøvetagning ½ år efter ophør af dampbehandlingen (tabel 4.1, fig. 4.4). A. fumigatus er ikke normal i danske jorde, og det er således første gang, at denne svamp er isoleret af Susanne Elmholt. Indholdet af svampe generelt i prøverne er forholdsvis lavt. Til sammenligning er indholdet af svampe i landbrugsjord på mellem 50.000 og 250.000 CFU/g tør jord (pers. kom. Susanne Elmholt, DJF).
Tabel 4.1. Indhold af svampe CFU/g tør jord i prøver udtaget efter dampbehandlingen (sept. 2002).
| Overjord | Underjord | ||||
| Prøveområde | Aspergillus fumigatus | Andre svampe | Prøveområde | Aspergillus fumigatus | Andre svampe |
| 140 | 2,75E+04 | 2,42E+04 | 140 | 4,57E+05 | 5,67E+04 |
| 141 | 1,38E+04 | 1,73E+04 | 141 | 2,78E+04 | 8,39E+03 |
| 142 | 3,42E+03 | 4,04E+04 | 142 | 1,96E+04 | 1,36E+04 |
| Reference | 0,00E+00 | 6,72E+04 | Reference | 0,00E+00 | 2,53E+04 |
Figur 4.4: Antal CFU/g tør jord i overjord (A), samt underjord (B). Lyse søjler angiver antallet af svampe i alt mens mørke søjler angiver antallet af A. fumigatus.
4.3.2 Profiler af det mikrobielle nedbrydersamfund
Biolog
Biolog EcoPlates måler den fænotypiske diversitet af de mikrobielle samfund som helhed og giver et såkaldt ”community-level physiological profiling” af den analyserede prøve. Hver plade består af 3 replikater af 32 brønde indeholdende et af 31 forskellige kulstofkilder samt en brønd med vand som referenceprøve. Ved respiration på den pågældende kulstofkilde reduceres et tetrazolium farvestof og en lilla farve udvikles. Farveintensiteten aflæses spektrofotometrisk. Pladerne giver dermed et metabolsk ”fingeraftryk” af nedbrydningsevnen i de undersøgte mikrobielle samfund og dermed et ”fingeraftryk” af det mikrobielle samfunds sammensætning. Brugen af netop Biolog EcoPlates har vist sig at være et særdeles godt værktøj til at detektere både spatiale og temporale ændringer i mikrobielle samfund /8/.
Alle prøver analyseredes på Biolog-pladerne ved dels 20°C og 42°C. Boringerne blev inokuleret med 100µl fra 10-2 fortyndingen fra ovenstående fortyndingsrække for at opnå et CFU-antal i nærheden af 105 celler/boring. For at pladerne ikke skulle tørre ud, blev disse pakket ind i plastposer sammen med en fugtig klud under inkuberingen.
Brøndende blev aflæst hver dag fra startinokulering til dag 4 samt en aflæsning efter 7 dages inkubering.
Samfundsprofiler på Biolog EcoPlates viste stor nedbrydningskapacitet ved 20°C og næsten ingen nedbrydningskapacitet ved 42°C fra alle prøver udtaget før dampbehandlingen (ingen forskel mellem område A/B og referenceområdet). Fra prøverne taget under dampbehandlingen viste samfundsprofilerne en rimelig nedbrydningskapacitet ved 20°C i alle prøver (behandlede + reference) mens profilerne viste en stor nedbrydningskapacitet ved 42°C i alle dampbehandlede prøver og ingen nedbrydning i referenceprøven. Dette billede gentog sig ved prøvetagning 3 ca. ½ år efter behandlingen (fig. 4.5).
Figur 4.5 Biolog EcoPlates inokuleret med suspension fra dampbehandlet overjord indsamlet september 2002. Øverst fire plader er inkuberet ved 20°C de fire nederste ved 42°C. Rækkefølgen af plader er fra venstre 140, 141, 142 samt referencejord.
4.4 Konklusion
Der er ingen tvivl om at oprensning med dampopvarmning af jorden ændrer væsentligt på de mikrobiologiske samfund i jorden. Resultater fra Hedehusene tyder på, at dampbehandlingen stimulerer samfundet som helhed, måske via frigørelse af tidligere utilgængelige kulstofkilder, hvilket resulterer i et større antal levedygtige bakterier samt forøget aktivitet i den dampbehandlede jord i forhold til referencejorden.
Det er desuden tydeligt, at dampbehandlingen rykker det mikrobielle samfunds generelle temperatur-tolerence væsentligt opad. Samfundsprofilen af nedbrydningsevnen på Biolog EcoPlates pladerne viser således med al tydelighed, at dampbehandlingen har ændret ved det mikrobielle samfund og at denne ændring stadig er gældende ½ år efter behandlingens afslutning. Fundet af en divers og persisterende varmeresistent bakterieflora i de dampbehandlede prøver er bekymrende dels udfra et økotoksikologisk og dels udfra et humant toksikologisk perspektiv.
Antallet af Pseudomonas sp. går generelt ned i både behandlet og referencejord mens dampbehandlingen resulterer i en fremkomst af varmeresistente Pseudomonas aeruginosa-stammer efter behandlingens afslutning. Denne bakterie er et opportunistisk humant patogen der ofte ses som årsag til urinvejs og respiratoriske infektioner. Yderligere er P. aeruginosa fra naturens side resistent overfor en række antibiotika og kan derfor være vanskelig at behandle /9/. Foruden denne bakterie isoleredes store mængder af svampen Aspergillus fumigatus fra damp-behandlede prøver. A. fumigatus producerer store mængder af små og let spredelige sporer med patogene og allergene effekter. Yderligere er flere A. fumigatus stammer i stand til at producere store mængder af mycotoxiner /10/.
Efter afslutningen af indeværende projekt blev der af GEUS foretaget supplerende undersøgelser af det mikrobielle samfund /4/. Konklusionen fra disse undersøgelser var, at der i 2003 blev observeret et fald i den funktionelle diversitet af varmetolerante bakterier. Yderlige blev der påvist et fald i antallet af potentielle patogene bakterier. Svampen Aspergillus fumigatus fandtes dog stadig i markant højere niveauer i den varmebehandlede jord.
Version 1.0 Marts 2007, © Miljøstyrelsen.