| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Afprøvning af immunoassaymetode til bestemmelse afPAH-indhold i jord

3 Princip for immunoassay teknik

• 3.1 Immunoassay-princippet

Det anvendte immunoassay-testkit er produceret af Strategic Diagnostics Inc. SDI /6/, et bioteknologisk selskab, som producer produkter til analyse af vand, levnedsmidler og jordforurening, baseret på antistoffer og immunologiske reagenser.

Til analyse af PAH i jordprøver er anvendt testkittet EnSys PAH soil test system. Dette testkit er beregnet til anvendelse ved afværgeprojekter og angiver kvalitative eller semi-kvantitative oplysninger om tilstedeværelse af de 3-, 4- og 5-ringede PAH, som typisk findes ved stenkulstjære- og olieforurenede lokaliteter. I tabel 3.1 angives de koncentrationer af enkelte PAH-forbindelser, der er nødvendige for at få et positivt resultat på mere end 1mg/kg.

Tabel 3.1 Følsomhed ved immunoassay /6/

Sensitivity of the immuno assay

Som det ses af tabel 3.1, har testkittet kun ringe følsomhed over for naphthalen, dibenz(a,h)anthracen og benzo(ghi)perylen, men rimelig følsomhed over for de fleste af de andre 4-, 5- og 6-ringede PAH, som indgår i MST´s jordkvalitetskriterier. Det vil sige, at høje koncentrationer af naphthalen (2 ringe) kun giver lav respons. Interferens fra andre kulbrinter, som BTEX, phenoler, oliekulbrinter m.fl. er minimal. Da jordkvalitetskriteriet for sum af PAH er baseret på 7 PAH med 4 - 6 ringe, er det en fordel, at kittet er mest følsomt over for netop de tungere stoffer.

PAH testkittet giver en respons svarende til det totale indhold af de 3-6 ringede PAH. Det vil sige, at en PAH-sammensætning bestående af mange PAH-forbindelser, vil give en respons svarende til en lidt højere koncentration (falsk positive værdier) end ved en laboratorieanalyse af de 7 enkelte PAH, som indgår i PAH-jordkvalitetskriteriet. Konsekvenserne ved vurdering af forureningsforhold ved undersøgelser og afgravninger vurderes dog at være uden betydning, idet det kun testes, om jordprøven indeholder mere eller mindre end testniveauerne. Ligeledes noteres det, at dibenz(a,h)anthracen ifølge litteraturkilder kun giver lav respons ved anvendelse af SDI PAH-testkit. Da en PAH-forurening typisk består af en hel række PAH-forbindelser, er lav respons for ét enkelt stof dog uden betydning.

Testkittet er af US EPA godkendt og valideret som metode 4035 til screening af, hvorvidt jorden indeholder mere end 1 mg total PAH/kg /7/. Der foreligger dokumentation for metodens ydeevne, og der er generelt god overensstemmelse mellem testniveauer og laboratorieresultater, ligesom sandsynligheden for et falsk negativt resultat er vurderet som lav /7, 8, 12/. Disse resultater er dog delvist afhængige af, hvorledes forureningsniveauerne ligger i forhold til testniveauerne, om der er anvendt aktuelle forurenede jordprøver eller prøver tilsat standardstoffer, som medfører lempelige ekstraktionsforhold. Det er dog rapporteret, at jordforhold såvel som tilstedeværelse af komplekse blandinger samt nedbrudt forurening kan medføre mindre god overensstemmelse mellem testkit og laboratorieresultater /13/.

Ved afprøvning i Skagen er der valgt to testniveauer, svarende til følgende tre koncentrationsniveauer:

• <1,5         mg/kg TS
• 1,5 – 15   mg/kg TS
• > 15         mg/kg TS

Testkittet kalibreres normalt hos leverandøren (SDI) i forhold til US EPA´s 16 PAH; naphthalen, acenaphthylen, acenaphthen, fluoren, phenanthren, anthracen, fluoranthen, pyren, benz(a)anthracen, chrysen, benzo(b)fluoranthen, benzo(k)fluoranthen, benzo(a)pyren, dibenz(a,h)anthracen, benzo(ghi)perylen og indeno(123-cd)pyren. Testkittet er dog indstillet i forbindelse med afprøvning hos leverandør (SDI), således at testniveauerne svarer til de PAH, som indgår i Miljøstyrelsens sum af 7 PAH (fluoranthen, benzo(b)fluoranthen, benzo(j)fluoranthen, benzo(k)fluoranthen, benzo(a)pyren, dibenz(a,h)anthracen and indeno(123-cd)pyren).

Ved indstilling af testkittet antages, at alle jordprøver, som skal screenes, har en sammenlignelig PAH-sammensætning (ikke altid opfyldt, hvis PAH er fra forskellige kilder og nedbrudt i forskellig grad). Der analyseres for alle 16 US EPA PAH i en repræsentativ jordprøve fra lokaliteten, og de indbyrdes forhold mellem de tilstedeværende PAH anvendes sammen med følsomhedsdata i tabel 3.1 til at beregne fortyndingsforholdene for de ønskede testniveauer. Beregningsmetoden er beskrevet i /9/.

3.1 Immunoassay-princippet

Ca. 10 g jord ekstraheres med methanol ved rystning i 1 minut /5, 6/.

Princippet illustreres i figur 3.1 fra /5/.

Fase 1:   Ekstraktet med eventuelt indhold af PAH (antigen) bringes i kontakt med specifikke antistoffer bundet til væggen af et reagensglas. Desuden tilsættes en bestemt mængde “ren” antigen-enzym kompleks, som kongruerer med prøvens antigen for at binde til antistoffer på overfladen. Jo mere antigen i prøven, jo mere bindes til antistoffer på væggen af reagensglasset. Jo mere prøvens antigen bindes til væggen, jo mere antigen-enzym konjugat findes der i væsken.

Fase 2:   Herefter fjernes væsken (og overskydende antigen-enzym konjugat), og overfladen (reagensglas) vaskes grundigt.

Fase 3:   Herefter tilsættes en reagens til reagensglasset, hvilket medfører en farvedannelse i det bundne antigen-enzym konjugat alene.

Fase 4:   Farvedannelsen er således større ved et lavt indhold af stoffet (antigen) i prøven, idet en større mængde antigen-enzym konjugat vil kunne binde til reagensglasset. Ved at vurdere farvedannelsen efter en række fortyndinger af ekstraktet, kan koncentrationsniveauet i prøven evalueres.

Figur 3.1 Princip for immunoassay-teknik (figur fra /5/)

Principle for immunoassay technique

Ved “EnSys-PAH-metoden” sammenlignes farvedannelsen i et testrør for prøven med et testrør for “blindprøve” (ingen farve). Blindprøven er en PAH-standard (phenanthren) i methanol, som analyseres parallelt med prøven. Farvedannelsen sammenlignes ved hjælp af et photometer. Med et fotometer måles farveforskellen mellem testrøret for blindprøven (højt indhold af PAH - ingen farve) og testrørene for de forskellige fortyndingsrør for hver enkelt prøve, der skal undersøges. Fotometeret benyttes for at undgå subjektive vurderinger af, om farve og intensitet er mere eller mindre end i blindprøven. Der opnås således en høj grad af reproducerbarhed m.h.t. koncentrationsbestemmelsen.

For at kunne evaluere koncentrationsniveauerne foretages en række forudbestemte fortyndinger af prøvens methanolekstrakt, normalt tre eller fire. Jo mere prøven fortyndes (stofkoncentrationen bliver mindre), jo større sandsynlighed for farvedannelse. Hver fortynding kan relateres til et testniveau, f.eks. <1,5, 1,5 -15 og >15 mg/kg.

En prøve med højt indhold PAH vil ikke kunne fortyndes ned til en tilstrækkelig lav koncentration, og alle fortyndinger vil være farveløse. Resultatet for sådanne prøver opgives som større end det højeste testniveau, f.eks. > 15 mg/kg.

Ved moderate indhold vil der ske farvedannelse efter 2. eller 3. fortynding. Koncentrationen kan opgives som et interval mellem koncentrationen med negativ farvedannelse og koncentrationen med positiv farvedannelse, f.eks. 1,5 -15 mg/kg.

Ved lavt eller intet indhold er der farvedannelse ved alle fortyndinger og koncentrationen er mindre end det laveste testniveau, f.eks. <1,5 mg/kg.

Analyseusikkerheden er typisk ± 25% /5-10/. Nøjagtigheden er typisk >70% med en tendens til falsk positive resultater /5-10/. Interferens er generelt minimal, idet metoden er specifik.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Maj 2007, © Miljøstyrelsen.