Hudoptagelse af pesticider - betydning af lag-time og reservoir-effekt
3 Diskussion
- 3.1 Hovedobservationer og diskussion
- 3.2 Betydning af stoffers opløselighed for absorptionsmængde og hastighed
- 3.3 Betydning af afvaskning og let hudbeskadigelse for penetration
3.1 Hovedobservationer og diskussion
Et kemisk stofs passage af huden er i princippet en passiv diffusion gennem forskellige lag med hver deres karakteristika i forhold til lipofilicitet. Et hydrofilt stof vil således nødigt flytte sig i retning af et mere lipofilt miljø, mens et lipofilt stof nødigt flytter sig i retning af et mere hydrofilt miljø. Over tid vil der dog indstille sig en ligevægt. Ved ligevægt vil der således eksistere en koncentration af modelstoffet i begge lag/fordelingsfaser. Givet at de to faser var henholdsvis oktanol og vand, ville man kunne udregne ratioen ved ligevægt som en oktanol-vand ratio. Det er det, der afspejles i logPow, som er den logaritmiserede værdi af ratioen mellem et stofs fordeling mellem oktanol og vand. En negativ LogPow er således et udtryk for, at et givet kemisk stof har en ratio under 1, og således ’foretrækker’ et vandigt miljø frem for et mere lipofilt miljø (oktanol). Der er klare paralleller mellem logPow og et stofs opløselighed i vand, men som det fremgår af oversigten over de anvendte modelstoffers logPow og opløselighed i vand (fx Tabel 11), er der stadig tale om to forskellige mål. Caffein er således omkring dobbelt så opløseligt i vand som glyphosat, mens caffeins præference for vand frem for oktanol er omkring 70 gange lavere end glyphosats. Det overordnede billede er dog, at en faldende opløselighed i vand modsvares af en stigende logPow-værdi.
Penetrationskoefficienten, Kp, fremkommer ved at dividere den maksimale penetrationshastighed med den påsatte koncentration af modelstof. Herved får man et koncentrationsuafhængigt mål for modelstoffets penetrationsegenskaber, der er gældende for så vidt, at betingelserne for Ficks lov er opfyldte i det eksperimentelle set-up. Idet diffusionen er afhængig af koncentrationsgradienten mellem de to fordelingsfaser, er en forudsætning for beregning af penetrationskoefficienter i det eksperimentelle set-up, at denne gradient er tilnærmelsesvis uendelig, hvilket svarer til, at koncentrationen på donorsiden er tilnærmelsesvis uendeligt større end på receptorsiden. Denne forudsætning er naturligvis opfyldt ved påbegyndelse af eksperimenter, hvor receptorkoncentrationen er nul, men vil udlignes over tid, afhængig af den til donoren påsatte mængde modelstof. Denne situation afspejles på penetrationskurverne, ved at de bøjer af og bliver fladere, penetrationshastigheden nedsættes, og ved tilnærmelsesvis ligevægt mellem koncentrationerne i donor og receptor vil penetrationskurven blive flad. Dette observeredes for eksempel ved benzosyre efter to døgn (Figur 7). I tilfældet benzosyre er betingelserne for beregning af en penetrationskoefficient således alene til stede de initiale omkring seks timer.
Et stofs lag-time er som tidligere omtalt et mål for, hvor lang tid der går fra stoffet er påsat i donorkammeret, til det observeres i receptoren, altså hvor lang tid det bruger på at flytte sig fra en fase til en anden. Der er ikke nogen entydig sammenhæng mellem lag-time og penetrationshastighed. Billedligt kan man forestille sig at skulle flytte vand fra et kar til et andet gennem en vandslange. Afgørende for den maksimale hastighed - hvor hurtigt man kan flytte vandet - er dels trykforskellen (analog med koncentrationsgradienten) og dels diameteren på slangen. Afgørende for hvor lang tid der går, fra man åbner for vandet i den ene ende, til man ser vandet komme ud i den anden ende (analog med lag-time) er imidlertid længden på slangen, som jo ikke afhænger af diameteren. Derfor er det ikke uventet, at man kan se et stof A med en højere penetrationskoefficient end stof B, men samtidig en længere lag-time. Disse overvejelser er relateret alene til passage mellem to faser.
I forhold til passage af huden er billedet mere kompliceret, idet der er tale om passage mellem flere faser med forskellige opløselighedskarakteristika. I den simple version fra en donorfase ind i epidermis, herfra videre til dermis, for endelig at slutte i receptorfasen. De forskellige opløselighedskarakteristika i specielt epidermis og dermis gør, at man kan opleve, at visse modelstoffer har egne opløselighedskarakteristika, der passer bedre med forholdene i enten epidermis eller dermis, hvilket kan resultere i en ophobning af stof i disse compartments.
3.2 Betydning af stoffers opløselighed for absorptionsmængde og hastighed
Målet for dette delprojekt var gennem anvendelse af en række modelstoffer at fastlægge et interval i forhold til lipofilicitet, hvor den mest effektive absorption kan forventes. Denne diskussion må nødvendigvis også forholde sig til modelstoffernes størrelse (molvægt, MW) samt deres steriske forhold (illustreret ved strukturformler, Figur 21). Den mest effektive absorption vil i det givne eksperimentelle set-up være en kombination af høj penetrationshastighed, illustreret ved en høj Kp, kort lag-time. Det giver samlet en høj penetration over den eksperimentelle periode, illustreret ved en høj receptorgenfinding. Det vil endvidere være af betydning, hvor meget stof der findes deponeret i huden, epidermis plus dermis, idet denne mængde i et vist omfang (belyses nærmere i det senere delstudie) er til stede for senere absorption. For samtlige modelstoffer observeres i dette delstudie en fuldt tilfredsstillende genfinding, således at forsøgene både enkeltvis og samlet klart lever op til krav om genfinding statueret i OECD’s guidelines for eksperimentelle penetrationsforsøg.
Den laveste penetrationskoefficient (Kp) ses ved det mest hydrofile modelstof (glyphosat). Kp stiger derefter med faldende hydrofilicitet, indtil et maksimum for Kp nås ved benzosyre, hvor Kp er knap 1000 gange større end for glyphosat. Forskellen i hydrofilicitet udtrykt som oktanol/vand ratioen (Pow) er godt 3000 svarende til en forskel i logPow på godt tre. Forskellen mellem glyphosat og benzosyre i vandopløselighed er dog ikke tilnærmelsesvis lige så stor. For de tre mest lipofile modelstoffer (methiocarb, paclobutrazol, prochloraz) falder Kp igen i forhold til benzosyre. Faldet i logPow i forhold til benzosyre er dog ikke så markant for de mest lipofile modelstoffer som for de mest hydrofile. Resultaterne indikerer generelt en omvendt U-formet sammenhæng mellem Kp og logPow, således at hurtigst penetration opnås ved en logPow værdi mellem 1½ og cirka 4 (Figur 17). Vore resultater er i overensstemmelse med tidligere studier med færre modelstoffer, som beskriver den optimale penetration over huden for stoffer med en logPow omkring 2 (Morgan et al. 2003), medens et studie med en række mindre alkoholer med forskellig vandopløselighed viste størst absorption gennem fuldhud ved logPow værdier mellem 1 og 3 (Cross et al. 2003). I sidstnævnte studie var der imidlertid en direkte sammenhæng mellem vandopløselighed og molvægt, hvorfor en adskillelse af indflydelsen af disse to forskellige fysisk-kemiske parametre ikke var mulig.
Figur 17. Sammenhæng mellem logPow og Kp samt relativ receptor deposition for ni modelstoffer. Kp og relativ receptor deposition for malathion er afsat separat med henholdsvis en blå trekant og en gul stjerne.
Der var ingen umiddelbar sammenhæng mellem molvægt og penetrationshastighed udtrykt som Kp. Dette var lidt overraskende, givet at et tidligere litteraturstudie baseret på en større database over studier involverende dermal penetration havde vist en umiddelbar sammenhæng mellem molvægt og maksimal penetrationshastighed (Magnusson et al. 2004). En nærmere analyse af de i dette arbejde inkluderede 87 modelstoffer viser dog, at sammenhængen har forholdsvis brede variationer, og at flere modelstoffer er taget ud af regressionsanalysen, idet de afveg for meget fra de andre stoffer. I nærværende undersøgelse har vi også enkeltstoffer, der falder udenfor det forventede (for eksempel malathion), og det kan ikke udelukkes, at vi med flere modelstoffer havde fundet samme sammenhæng som i det Australske litteraturstudie (Magnusson et al. 2004).
En afledt betydning af penetrationshastigheden er den mængde stof, der i løbet af den eksperimentelle periode når receptorfasen. Denne mængde er i Tabel 11 angivet ved den relative receptordeponering. Som ovenfor diskuteret er der et naturligt maksimum betinget af opnåelse af ligevægt mellem modellens compartments, men ikke desto mindre forventes en vis parallelitet mellem de to mål. Som det fremgår af Figur 17 er denne overensstemmelse mellem den fundne Kp og den observerede relative receptor deponering også tilstede.
Det var på baggrund af opløselighed og molvægt ventet, at malathions penetrationskarakteristika ville placere sig mellem methiocarbs og benzosyres. Som det imidlertid også fremgår af såvel Tabel 11 som Figur 17, var det ikke tilfældet. Der er søgt efter årsager omkring mulige eksperimentelle forhold (manglende opløselighed i donor/receptor, tab af stof under forsøg, analytiske problemer), men der er ikke fundet relevante forklaringer. Opløseligheden i donor/receptor væske er således undersøgt og fundet tilfredsstillende. I denne fase blev analyse gennemført med såvel HPLC som radioaktivitetsmåling for at sikre, at det målte stof ved radioaktivitetsmålingen stadig var helt (en ulempe ved mærkede stoffer er, at man i stedet for at følge et stof, følger et mærket atom - man vil derfor fortsat finde resultater, selvom udgangsstoffet for eksempel er omdannet til et andet stof med potentielt andre penetrationsegenskaber). Recovery var over 90 % og således på linie med de øvrige eksperimenter og OECD’s guidelines Malathion var et af de radioaktivt mærkede stoffer, hvorfor analytiske problemer var begrænsede. Tilbage står muligheden, at de oplyste værdier for logPow/opløselighed ikke er korrekte eller at kemiske/steriske forhold specifikke for malathion betinger de i forhold til de øvrige modelstoffer afvigende penetrationsegenskaber.
En anden væsentlig parameter for den absolutte mængde af et stof, der i løbet af en given periode kan absorberes over huden, er stoffets lag-time. Den tid, der går efter applikation af stoffet på donorsiden, indtil det kan måles på receptorsiden, kan tænkes at afhænge af såvel opløselighed som størrelse (molvægt) og steriske forhold. Sammenhængen med opløselighed er, at alt andet lige vil et stof med en hurtig penetrationshastighed også forventes at kunne observeres efter en kortere lag-time end et stof med en langsom penetrationshastighed. Derfor er den parallelitet, der ses mellem Figur 17 og Figur 18 ikke uventet, og viser at for de i dette studie anvendte modelstoffer gælder, at den korteste lag-time kan forventes af stoffer med en vandopløselighed mellem 3g/L og godt 20 g/L.
Figur 18. Sammenhæng mellem opløselighed i vand og lag-time for 9 modelstoffer.
Der er en tydelig sammenhæng mellem flertallet af modelstoffers molvægt og den observerede lag-time. Med stigende molvægt øgedes lag-time (Figur 19). Således var lag-time for det mindste modelstof med en molvægt på 122 gram nede på omkring 1½ time, medens lag-time ved molvægt over 350 gram oversteg 20 timer, hvilket er en ganske markant forskel, der også influerer på den mængde stof, der i løbet af en begrænset periode vil kunne absorberes dermalt.
Figur 19. Sammenhæng mellem molvægt og lag-time for 9 modelstoffer. Lag-time for malathion er afsat separat med en stjerne på figuren.
Specielt i situationer med forholdsvis kort eksponeringstid vil en lang lag-time forventes at virke stærk begrænsende på den mængde stof, der kan absorberes, hvilket i forhold til de fleste erhvervsmæssige eksponeringer er relevant. En nærmere diskussion af denne problemstilling vil findes i relation til delstudie 2, hvor der netop er anvendt 6 timers eksponering for modelstoffer.
I lighed med sammenhængen mellem logPow og penetrationskoefficienten Kp ses malathion også ved denne sammenstilling af molvægt og lag-time at afvige markant fra de andre teststoffer. Således har malathion med en molvægt på 330 gram en lag-time på knap 3 timer svarende til et stof med en molvægt på under det halve.
Deponeringen i epidermis er relativt begrænset for alle modelstoffer, hvilket ikke er overraskende, givet at det alene drejer sig om de øverste hudlag (primært stratum corneum). Forskelle i epidermisdeponering mellem modelstofferne indikerer en relativt større deponering efter eksponering med de mest lipofile stoffer, idet caffein dog adskiller sig ved en relativ høj relativ epidermal deponering på godt 3 %.
For dermis ses en klart større relativ deponering af de lipofile stoffer (Figur 20), hvilket også var ventet, givet at dermis er et overvejende lipofilt matrix. Analoge resultater er vist i et studie inkluderende fem forskellige alkoholer med forskellige opløselighedskarakteristika (Cross et al. 2003).
Figur 20. Sammenhæng mellem lipofilicitet udtrykt som logPow og den relative dermis deponering for ni modelstoffer.
Donordeponering ved forsøgsafslutning er udtryk for den fraktion af det påsatte modelstof, der ikke har forladt donorkammeret og diffunderet ind i huden. Det er klart blandt de mest hydrofile modelstoffer, at den største relative donordeponering observeres (Tabel 11), hvilket er fint i overensstemmelse med disse stoffers ringere affektion for de mere lipofile forhold i hudens compartments, som jo også ses i ovennævnte forhold omkring relativ deponering i dermis (Figur 20).
3.2.1 Delkonklusion
- Resultaterne indikerer generelt en omvendt U-formet sammenhæng mellem Kp og logPow, således at hurtigst penetration opnås ved en logPow værdi mellem 1½ og cirka 4. Et enkelt af de ni modelstoffer (malathion) falder udenfor denne generalisering.
- Der var ingen umiddelbar sammenhæng mellem molvægt og penetrationshastighed udtrykt som Kp.
- For de i dette studie anvendte modelstoffer gælder, at den korteste lag-time kan forventes af stoffer med en vandopløselighed mellem 3g/L og godt 20 g/L.
- Med stigende molvægt øgedes lag-time. Således var lag-time for det mindste modelstof med en molvægt på 122 gram nede på omkring 1½ time, medens lag-time ved molvægt over 350 gram oversteg 20 timer, hvilket er en ganske markant forskel, der også influerer på den mængde stof, der i løbet af en begrænset periode vil kunne absorberes dermalt. Igen adskiller malathion sig fra de øvrige modelstoffer.
- For dermis ses en klart større relativ deponering af de lipofile stoffer, hvilket også var ventet, da dermis er et overvejende lipofilt matrix.
Figur 21. Strukturformler for modelstoffer anvendt i delstudie 1.
3.3 Betydning af afvaskning og let hudbeskadigelse for penetration
I delstudie 2 anvendtes seks timers eksponering efterfulgt af afvaskning i modsætning til delstudie 1, hvor huden kontinuert eksponeredes over 48 timer. For glyphosat, caffein, benzosyre, samt malathion er det eksperimentelle set-up for kontrolgrupperne i kolonne 1, tabel 18 (intakt, ikke-afvasket) identisk med det set-up der er brugt i delstudie 1. For to af stofferne med lang lag-time (dimethoat og methiocarb) er modelstoffet dog fjernet fra donorkammeret efter 6 timer i kontrolgruppen uden efterfølgende afvaskning med sæbeopløsning. Formålet var for disse to stoffers vedkommende at observere, hvorvidt alene en tidlig afbrydelse af eksponeringen i forhold til den kendte lag-time ville påvirke den efterfølgende penetration gennem huden, eller om penetrationen ville fortsætte uagtet den manglende koncentrationsgradient mellem donor og hudreservoir.
En direkte sammenligning for de fire modelstoffer, der indgik identisk i begge delstudier, viser, at der generelt er god overensstemmelse mellem de to sæt data fra delstudie 1 og delstudie 2, således at hverken penetrationskoefficient (Kp) eller lag-time er væsentlig forskellige (Tabel 11, Tabel 18). For methiocarb ses en øget donor-recovery i delstudie 2 i forhold til delstudie 1, hvilket ikke er uventet, givet at man efter 6 timer aktivt fjerner den mængde stof, der resterer i donorfasen, hvorimod man i delstudie 1 først fjerner reststof fra donorkammeret efter 48 timer. Differencen kan således tages som et forsigtigt bud på den mængde, der trænger ind i huden i de sidste 42 timer af eksponeringsperioden. Set i lyset af, at det er omkring 17 % af den administrerede dosis, som man genfinder efter 48 timer (Tabel 11) og 43 % efter 6 timer (Tabel 18), er der således en absorption til huden på omkring 25 % af den administrerede mængde i perioden mellem 6 og 48 timer. Analog med denne observation ses der da også en signifikant mindre deponering af methiocarb i huden og en mindre hudabsorption (udtrykt ved genfinding i receptorkammeret) for eksperimentet i delstudie 2 (Tabel 18) sammenlignet med delstudie 1 (Tabel 11). For det modelstof med den længste lag-time (dimethoat, lag-time = 22,3 timer) ses der slet ingen penetration i det tilfælde, hvor eksponeringen standses efter 6 timer. Resultatet viser, at for et modelstof med en lang lag-time og en begrænset affinitet for den mere lipofile hudkompartment kan man ikke forvente nogen målbar absorption gennem huden efter kortere tids eksponering (i dette tilfælde under en tredjedel af lag-time), ligesom en midlertidig ophobning i huden heller ikke ses. Årsagen er sandsynligvis, at der kræves en længerevarende kontinuerlig koncentrationsgradient favoriserende en penetration ind i huden, før man overvinder den modstand, der er betinget af den høje vandopløselighed. At andre faktorer end blot vandopløselighed er af betydning for hudpenetrationen illustreres tydeligt ved, at caffein med en sammenlignelig vandopløselighed og en kun lidt mindre molvægt fremviser klart anderledes penetrationskarakteristika (Tabel 13, Tabel 18).
3.3.1 Betydning af afvaskning for senere hudpenetration
Denne problemstilling er belyst gennem forsøg, hvor man efter 6 timers eksponering har foretaget en reel afvaskning af huden med en svag sæbeopløsning. Da pH potentielt har indflydelse på huden såvel som på stoffernes ioniseringsgrad, er der anvendt en pH-neutral sæbeopløsning. Det er tidligere vist, at vask med svag sæbeopløsning ikke influerer mere på hudens barriereegenskaber end afvaskning i vand (Bornkessel et al. 2005), hvorfor afvaskningen antages ikke at påvirke den efterfølgende penetration af modelstof tilstede i huden. Da afvaskningen først gennemføres efter 6 timers eksponering, er forsøgsbetingelserne indtil da identiske med forsøgene uden afvaskning. Da modelstofferne på nær dimethoat og methocarb grundet disse to modelstoffers lange lag-time er trængt ind i huden i løbet af de initiale 6 timer, er det derfor heller ikke overraskende, at lag-time for de anvendte modelstoffer ikke er påvirket af afvaskningen efter 6 timer. Centralt for diskussionen om betydningen af afvaskning er, hvorvidt det via en afvaskning med en svag sæbeopløsning er muligt at reducere den mængde modelstof, der er til rådighed i hudens reservoir for senere absorption. Det er i forsøgenes design givet, at en måling af deponeringen efter 6 timer ikke er mulig, hvorfor data alene haves for huddeponeringen ved forsøgsafslutning efter 48 timer. Resultaterne er derfor alene indikative for de forhold, der eksisterede 42 timer forud for den aktuelle måling. Tallene for huddeponering kan derfor sammenstilles med den mængde modelstof, der kunne opsamles ved afvaskningen efter de 6 timer. Resultaterne viser entydigt, at en afvaskning efter 6 timer fjerner den altovervejende del af den administrerede mængde modelstof, og nedsætter derved muligheden for senere huddeponering, således at man ved forsøgsafslutning ser en signifikant reduceret huddeponering i de grupper, hvor der er gennemført afvaskning efter 6 timer. For de mest vandopløselige modelstoffer (glyphosat og caffein) nedsættes huddeponeringen med 80-90 %, medens reduktionen for de mere lipofile stoffer såsom malathion og methiocarb er omkring 35 %. Den nedsatte mængde modelstof i huden betyder en mindre koncentrationsgradient mellem hud og receptorkammer, hvilket alt andet lige forventes at resultere i en nedsat flux af modelstof. Dette bekræftes af den nedsatte receptor recovery i de grupper, der fik sæbeafvaskning efter 6 timer. For de to mest vandopløselige stoffer reduceredes absorptionen (udtrykt gennem receptor recovery) til omtrent en tredjedel, medens absorptionen for benzosyre og methiocarb blev reduceret til 60-80 % af værdierne uden afvaskning. Penetrationskoefficienterne ændredes i overensstemmelse med ovennævnte ændringer i penetrationshastighed og mængde. Samlet kan det konkluderes, at en afvaskning efter endt eksponering signifikant nedsætter den samlede absorption af modelstofferne. For de mest vandopløselige stoffer er denne reduktion omkring 67 % og for de mere lipofile modelstoffer med lidt mindre. Det er således muligt ved almindelig let afvaskning at fjerne en del af den stofmængde, der er trængt ind i huden. Denne observation har klare forebyggelsesmæssige implikationer, og dokumenterer betydningen af afvask med sæbeopløsning efter endt arbejde med dermal kontakt til fremmedstoffer. Et tidligere studie, hvor man efter 90 minutters pesticideksponering (glyphosat, alachlor, methyl parathion, eller triflualin) af grisehud afvaskede med enten propanol eller en sæbeopløsning viste, at man kunne fjerne omkring halvdelen af den administrerede mængde pesticid (Campbell et al. 2000). Dette Amerikanske studie viste endvidere, at sæbevand var mere effektivt end for eksempel polyethylen glycol til fjernelse af pesticid fra huden (Campbell et al. 2000). Sidstnævnte observation kunne være en konsekvens af, at polyethylen glycol i andre sammenhænge har været anvendt som bærestof/detergent med det formål at gøre meget hydrofile stoffer mere blandbare med vandige opløsninger, og således også kunne tænkes at befordre en absorption af for eksempel det meget hydrofile pesticid glyphosat. Tidligere undersøgelser gennemført i Odense har netop dokumenteret betydningen af detergenter og bærestoffer for absorptionen af pesticider over human hud (Nielsen 2004).
Den nuværende regelsætning omkring vurdering af penetrationsforsøg følgende gældende OECD guidelines foreskriver, at man skal henregne alt stof, der ikke er genfundet i donordelen som absorberet og dermed potentielt tilgængeligt for systemisk toksicitet. Dette gælder således også den fraktion af den administrerede dosis, der er ophobet i huden. Nærværende undersøgelse viser, at absorption fra huden og ud i receptordelen fortsætter efter endt eksponering. For visse stoffer fortsætter absorptionen i over et døgn efter endt eksponering. Der er derfor ingen tvivl om, at en vis del af den i huden deponerede mængde modelstof senere vil absorberes. Det er imidlertid ikke afklaret, hvor stor en fraktion af den i huden midlertidigt deponerede mængde modelstof, der vil fjernes uden at nå systemisk cirkulation, det vil sige ovenud af huden. I den eksperimentelle situation svarer det til den fraktion, der vil returnere til donorkammeret efter endt eksponering. En indikation på størrelsen af denne fraktion er, at knap 8 % af den administrerede mængde methiocarb kunne opsamles i donorkammeret efter 48 timer i de grupper, hvor cellerne blev skyllet efter 6 timer (Tabel 17; 2,1 ug/27,0 ug). Da det ikke er mere end 15 % af den administrerede methiocarb-dosis, der genfindes i huden efter 48 timer (Tabel 17), udgør de 8 % således knap en tredjedel af den mængde, der ville have været deponeret i huden, såfremt der ikke havde været en tilbagediffusion til donordelen. Disse data indikerer således, at det er en betydende fraktion af det i huden midlertidigt deponerede modelstof, der faktisk returnerer til donorsiden af huden. For de lipofile stoffer indikerer de disse, om end begrænsede data, at den nuværende anvendelse af data ved regelsætning for dermal absorption baseret på guideline-forsøg i en vis grad overestimerer den reelle absorberbare mængde fremmedstof ved at indregne alt stof ikke genfundet i donor som absorberet. Overestimatet er dog ikke voldsomt stort, og for de lipofile stoffers vedkommende synes den hidtil anvendte procedure pragmatisk anvendelig. For de hydrofile stoffer kan nærværende data ikke give fyldestgørende svar på denne problemstilling.
3.3.2 Betydning af lettere hudbeskadigelse for senere hudpenetration
En stor del af mennesker eksponeret dermalt for fremmedstoffer kan ikke antages altid at have fuldt intakt hud med optimale barriereegenskaber. Derfor er det en relevant problemstilling, hvorvidt fremmedstoffers penetrationsforhold ændrer sig i tilfælde af en lettere beskadiget hud. Tidligere undersøgelser har indikeret, at beskadigelsen af stratum corneum kan ændre på deponeringsmønstret af fremmedstoffer (Morgan et al. 2003, Nielsen 2005). Disse tidligere studier er udført med ganske få modelstoffer. Det Britiske studie konkluderer således på basis af en undersøgelse af to meget hydrofile modelstoffer (penciclovir og aciclovir, logPow omkring -2) i et eksperimentelt set-up med mikrodialyse af frivillige forsøgspersoner, at der er en direkte sammenhæng mellem graden af hudbeskadigelse og absorptionen af fremmedstof (Morgan et al. 2003). Denne undersøgelse baserer sig som ovenfor nævnt alene på to modelstoffer med meget høj hydrofilicitet, men en nærmere analyse inkluderende modelstoffer med forskellig størrelse og opløselighedskarakteristik er ikke tidligere gennemført.
Resultaterne fra delstudie 1 viste, at den dermale penetration af de anvendte modelstoffer forekom omvendt proportional med molvægten, medens der fandtes et centralt opløselighedsinterval med størst penetrationshastighed. En effekt af en lettere beskadigelse af huden på modelstoffernes penetrations-egenskaber kan forventes at være størst for de modelstoffer, der havde sværest ved at gennemtrænge den intakte hud. En nylig in vivo undersøgelse over effekten af en lettere beskadiget hud på penetrationen af tre polyethylenglykoler viste da også, at den relative forøgelse af penetrationen efter beskadigelse var størst for den glykol med størst molvægt (Jakasa 2006). Benzosyre havde meget let ved at gennemtrænge den intakte hud og har en relativ lav molvægt, og en lettere beskadigelse vil således ikke forventes at øge penetrationen eller penetrations-hastigheden væsentligt, hvorimod såvel de mere hydrofile som de mere lipofile modelstoffers penetrationsegenskaber forventes at ændre sig mere markant.
Den i dette studie anvendte model opererer i princippet med tre overordnede compartments: donorkammeret, huden, samt receptorkammeret. En lettere beskadigelse af huden med den anvendte metode er tidligere vist at nedsætte hudens integritet, men under bevarelse af en specificeret del af hudens barriereegenskaber (Nielsen 2005). En beskadigelse af huden via forbehandling med den lave koncentration af SLS (0,3 %) i tre timer forventes primært at have betydning for transporten fra donorkammer og ind i huden. Det er en transport mod et mere lipofilt miljø, hvorfor det forventes, at en nedsættelse af hudens integritet i højere grad vil have betydning for de hydrofile stoffer end for de lipofile, der i forvejen, lettere end de hydrofile, kommer fra donor og ind i huden.
Man kunne have forstillet sig, at lag-time blev påvirket af den lettere beskadigelse, men som det fremgår af de opnåede resultater, indikerer disse ikke, at det er tilfældet. Der er således i de fleste tilfælde alene tale om en begrænset ikke-signifikant reduktion i lag-time. Den observerede stigning i lag-time for glyphosat efter anvendelse af beskadiget hud skal i højere grad tages som udtryk for en mere usikker bestemmelse af lag-time ved de meget lave penetrationshastigheder for dette modelstof gennem ubeskadiget hud. For dimethoat sås i lighed med resultater fra ikke-beskadiget hud heller ingen penetration gennem den lettere beskadigede hud. Årsagen er sandsynligvis den samme; Den lange lag-time tillader ikke en relevant penetration ind i huden i løbet af de 6 timers eksponering.
For samtlige modelstoffer fandtes en forøget maksimal penetrationshastighed medførende en øget penetrationskoefficient (kp). Forøgelsen af Kp for benzosyre var dog marginal og ikke-signifikant, hvilket også til dels var ventet jævnfør tidligere argumentation. For de to mere lipofile modelstoffer, malathion og methiocarb, var der tale om en forøgelse med henholdsvis næsten 90 % og godt 15 % (Tabel 18). At effekten er størst på malathion kan være en konsekvens af, at malathion med sin betydelige molvægt på 330 g/mol som udgangspunkt har en penetrationskoefficient af samme størrelse som det langt mere hydrofile stof caffein, og derfor får en større gevinst ved den lettere beskadigede hud end methiocarb. For de mere hydrofile modelstoffer var penetrationshastigheden imidlertid forøget ganske markant mere, idet caffein penetrerede med en hastighed, der var forøget med omkring 500 %, medens glyphosats maksimale penetrationshastighed blev omkring 25 gange større som følge af den lettere beskadigede hud. Resultaterne indikerer således, at en lettere beskadiget hud resulterer i en generel forøget penetrationshastighed for alle stoffer, at forøgelsen er marginal for de stoffer, der allerede ved den intakte hud har gode penetrationsegenskaber, at forøgelsen er signifikant for de mere lipofile stoffer, men at den klart største effekt observeres ved eksponering for hydrofile modelstoffer. Den kraftigt forøgede penetration af specielt de mere hydrofile modelstoffer gennem lettere beskadiget hud kan have den konsekvens, at man reguleringsmæssigt er nødt til at forholde sig til, at den reelle situation blandt en stor del af ansatte med dermal eksponering og ikke-intakt hud er, at de absorberer ganske meget mere dermalt end de traditionelle in vitro guideline-forsøg indikerer.
Den øgede penetrationshastighed har den umiddelbare konsekvens, at den samlede mængde modelstof, der kan genfindes i receptorkammeret, og således er absorberet, er forøget tilsvarende. Marginalt for benzosyre, plus 25 % for methiocarb, godt og vel fordoblet for malathion og caffein, samt 30 gange forøget for glyphosats vedkommende. Forklaringen er analog med ovenstående og relateret til hydrofilicitet for caffeins og glyphosats vedkommende og størrelse for malathions vedkommende. Begge forklaringer er i overensstemmelse med observationer fra Hollandske in vivo undersøgelser omkring dermal penetration af glykol-forbindelser gennem lettere beskadiget hud (5 % SLS i 4 timer) (Jakasa 2006).
Betydningen af den lettere beskadigelse af huden for den temporære deponering af modelstof i huden er primært relateret til de to modelstoffer, der enten af opløselighedsgrunde havde sværest ved at komme fra donorkammeret og ind i huden (glyphosat), eller af størrelsesmæssige årsager havde svært ved at komme ind i huden og af opløselighedsgrunde havde sværest ved at komme fra huden og videre til receptoren. Den temporære deponering i huden var således forøget tre-fem gange for malathions og glyphosats vedkommende, men som nævnt sandsynligvis af forskellige årsager.
Den større absorption og til dels deponering i huden resulterer umiddelbart i en mindre mængde modelstof i donorkammeret ved forsøgsafslutning.
Også for forsøgsrækken med lettere beskadiget hud gennemførtes en parallel række forsøg med afvaskning efter 6 timers eksponering. Resultaterne fra opsamling af modelstof efter seks timer og afvaskning viser, at man næsten får opsamlet alt modelstof tilstede i donorkammeret efter seks timer, og at der alene i meget begrænset omfang senere frigives modelstof til donorkammeret i disse forsøg med lettere beskadiget hud. Differencen mellem donordeponeringen efter 6 timer i forsøgene med afvaskning og donordeponeringen efter 48 timer i forsøgene uden afvaskning er således udtryk for den fraktion af den administrerede dosis modelstof, der trænger ind i huden og i et vist omfang videre gennem huden, i de afsluttende 42 timer af den eksperimentelle periode. Differencen mellem, hvad der opsamles efter 6 timer i forsøgene med afvaskning, og hvad der opsamles efter 48 timer i samme forsøg, er derimod udtryk for den fraktion af dosis, der diffunderer tilbage til donorkammeret efter initialt at være diffunderet ind i huden. Denne fraktion er meget begrænset i disse forsøg med lettere beskadiget hud.
Afvaskning af den lettere beskadigede hud efter 6 timer resulterede for alle modelstoffer i en nedsat deponering af modelstof i huden. Mest markant var effekten på de to modelstoffer, hvis huddeponering var påvirket stærkest af den forudgående hudbeskadigelse. For både glyphosats og malathions vedkommende observeredes således, at man ved afvaskning af huden var tæt på at kunne neutralisere den stærkt forøgede huddeponering forårsaget af den lettere beskadigelse af huden. Faktisk kunne man for de to mest lipofile modelstoffer opnå en lavere huddeponering i den lettere beskadigede hud end i den ikke-beskadigede hud, et resultat hvis eneste forklaring synes at være, at man i højere grad er i stand til at vaske modelstof deponeret i huden ud af den lettere beskadigede hud end ud af ikke-beskadiget hud. I hvilken grad man i levende hud ville se samme billede er uafklaret idet man til en vis grad vil forvente en reparationsproces initieret i den levende hud i løbet af den eksperimentelle periode på 48 timer. Visse typer beskadigelser af huden har på den anden side mere permanent karakter, hvor reetablering af fuld barrierefunktion ikke kan forventes på 48 timer. I forhold til den mængde af den administrerede dosis, der når frem til receptorkammeret, og altså kan betragtes som absorberet, er effekten af afvaskning, i lighed med observationerne fra den ikke-beskadigede hud, størst for de to mest hydrofile modelstoffer caffein og glyphosat.
Tolkningen af forsøgene med lettere beskadiget hud er, at man ved eksponering af en lettere beskadiget hud opnår en kraftig forøget huddeponering såvel som en kraftig forøget reel absorption, og at effekten er størst for de stoffer, der har de største begrænsninger for uhindret absorption gennem ikke-beskadiget hud. Det vil sige de mest lipofile og specielt de mest hydrofile stoffer. Imidlertid vil en afvaskning efter endt eksponering i meget høj grad kunne reducere den forøgede absorption såvel som huddeponering, en reduktion til et niveau der dog mængdemæssigt stadig er signifikant højere end efter afvaskning af intakt hud.
3.3.3 Delkonklusion
- For et modelstof med en lang lag-time og en begrænset affinitet for den mere lipofile hudkompartment kan man ikke forvente nogen målbar absorption gennem huden efter kortere tids eksponering (i dette tilfælde under en tredjedel af lag-time), ligesom en midlertidig ophobning i huden heller ikke ses.
- En afvaskning efter 6 timer fjerner den altovervejende del af den administrerede mængde modelstof og nedsætter derved muligheden for senere huddeponering. For de mest vandopløselige modelstoffer (glyphosat og caffein) nedsættes huddeponeringen med 80-90 %, medens reduktionen for de mere lipofile stoffer såsom malathion og methiocarb er omkring 35 %.
- Den nedsatte mængde modelstof i huden betyder en mindre koncentrationsgradient mellem hud og receptorkammer, hvilket resulterer i en nedsat flux af modelstof.
- Samlet kan det konkluderes, at en afvaskning efter endt eksponering signifikant nedsætter den samlede absorption. For de mest vandopløselige stoffer nedsættes absorptionen med omkring 67 % og for de mere lipofile modelstoffer med lidt mindre. Det er således muligt ved almindelig let afvaskning at fjerne en del af den stofmængde, der er trængt ind i huden. Denne observation har klare forebyggelsesmæssige implikationer, og dokumenterer betydningen af afvaskning med sæbeopløsning efter endt arbejde indebærende dermal kontakt til fremmedstoffer.
- Nærværende undersøgelse viser, at absorption fra huden og ud i receptordelen fortsætter efter endt eksponering. For visse stoffer i over et døgn efter endt eksponering. Der er derfor ingen tvivl om, at en vis del af den i huden deponerede mængde modelstof senere vil absorberes.
- For de lipofile stoffer indikerer disse, om end begrænsede data, at den nuværende anvendelse af data ved regelsætning for dermal absorption baseret på guideline-forsøg i en vis grad overestimerer den reelle absorberbare mængde fremmedstof ved at indregne alt stof ikke genfundet i donor som absorberet. Overestimatet er dog ikke voldsomt stort, og for de lipofile stoffers vedkommende synes den hidtil anvendte procedure pragmatisk anvendelig. For de hydrofile stoffer kan nærværende data ikke give fyldestgørende svar på denne problemstilling.
- Dette studie indikerer, at en lettere beskadiget hud resulterer i en generel forøget penetrationshastighed for alle stoffer, at forøgelsen er marginal for de stoffer, der allerede ved den intakte hud har gode penetrationsegenskaber, at forøgelsen er signifikant for de mere lipofile stoffer, men at den klart største effekt observeres ved eksponering for hydrofile modelstoffer.
- Imidlertid vil en afvaskning af den beskadigede hud efter endt eksponering i meget høj grad kunne reducere den forøgede absorption såvel som huddeponering til et niveau, der dog mængdemæssigt stadig er signifikant højere end efter afvaskning af intakt hud.
- Den kraftigt forøgede penetration af specielt de mere hydrofile modelstoffer gennem lettere beskadiget hud kan have den konsekvens, at man reguleringsmæssigt er nødt til at forholde sig til, at den reelle situation blandt en stor del af ansatte med dermal eksponering og ikke-intakt hud er, at de absorberer ganske meget mere dermalt end de traditionelle in vitro guideline-forsøg indikerer.
Version 1.0 Maj 2007, © Miljøstyrelsen.