| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Rensning af MTBE-forurenet grundvand vha. propanoxiderende mikroorganismer

Bilag A: Laboratorieprocedurer

Standardprocedure

I det følgende er laboratorieprocedurerne som er benyttet ved de enkelte forsøg skitseret. Hvis ikke andet er bemærket, er forsøgene udført under følgende standardbetingelser:

Der er der anvendt 120 mL serumflasker, indeholdende 20 mL vækstmedie med biomasse. Efter grundig homogenisering er biomassekoncentrationen målt som optisk densitet ved 550 nm (OD₅₅₀) og omregnet til koncentration af celleprotein via en standardkurve. Serumflaskerne er herefter lukket med teflonbelagte gummipropper og tilsat propan og MTBE. Flaskerne er placeret på rystebord ved 150 rpm og er placeret ved 23°C.

A.1: Fremelskning, selektion og opformering

Ændret berigelsesprocedure

Det er fundet forholdsvist let at fremelske alkanoxiderende berigelseskulturer med MTBE-nedbrydende egenskaber, hvorfor der til forsøgene udført efter afrapportering i Miljøstyrelsen (2001) er benyttet en hurtigere og mindre omstændelig berigelsesprocedure end den der er beskrevet i Miljøstyrelsen (2001). Nedenstående procedure er benyttet til fremelskning og selektion.

Berigelse af blomsterjord

Som podemateriale er der benyttet sphagnumholdig jord fra et indendørs blomsterbed på Aalborg Universitet. Der er afvejet ca. 30 g jord, som er overført til en 500 mL serumflaske og tilsat 250 mL vækstmedie (pH ≈ 7), indeholdende bl.a. mikro- og makronæringsstoffer. Flasken er lukket med en gastæt neopren-prop og metallåg, hvorefter der er tilsat ca. 25,5 mg MTBE og 25,5 mL gasformig propan, svarende til koncentrationer i væskefasen på hhv. 100 mg MTBE/L og 6,3 mg propan/L. Flasken er placeret ved 23°C og omrystet ved 120-150 rpm.

Selektion

Efter en uge er 20 mL repræsentativ væskeblanding, efter grundig omrystning, udtaget og overført til en ny 500 mL flaske med 230 mL frisk vækstmedie. Denne flaske er tilsat MTBE og propan, hvorefter den er inkuberet under samme forhold som beskrevet ovenfor. For at sikre tilstrækkelig selektion af de propanoxiderende bakterier er kulturen overført i alt fem gange.

Berigelses- og selektionsproceduren er skitseret i figur A.1.

Figur A.1: Skematisk fremstilling af den anvendte berigelses- og selektionsprocedure.

Opformering

Efter selektion af den ønskede mikrobielle kultur er der foretaget en opformering med henblik på udførelsen af de planlagte batchforsøg samt podning af to laboratorieskala bioreaktorer. Opformeringen er foretaget i 2 stk. 20 L glasbeholdere tilsat 10 L næringsmedie, indeholdende bl.a. mikro- og makronæringsstoffer (pH ≈ 7). Flaskerne er lukket med gastæt gummiprop og placeret på magnetomrører (ca. 150 rpm) ved 23°C, hvorefter der er tilsat MTBE og propan, svarende til koncentrationer i væskefasen på hhv. 10 mg MTBE/L og 6,3 mg propan/L.

Med henblik på tilførsel af iltholdig atmosfærisk luft er flaskerne åbnet og udluftet ca. 2-3 gange om ugen i tre timer ved konstant omrøring. Ved samme lejlighed er der tilført MTBE og propan, svarende til koncentrationer i væskefasen på hhv. 10 mg MTBE/L og 6,3 mg propan/L. Ufortyndet næringsmedie er tilsat med ca. 14 dages mellemrum.

A.2: Mikroorganismernes vækst

Forsøgsprocedure

Til disse forsøg er der anvendt 1 L flasker, indeholdende en tynd biomassesuspension i 250 mL vækstmedie. Flaskerne er lukket med teflonbelagte gummipropper og tilsat 375 mL propan, svarende til en væskefasekoncentration på ca. 31 mg propan/L (dvs. primærsubstrat i overskud). Hver flaske er ligeledes tilsat 40 mL ren ilt, svarende til at der, inklusiv atmosfærebidraget, var omkring 10 mg O₂/L i hver flaske.

Inkubation

Flaskerne er omrystet ved 150 rpm og placeret ved hhv. 23 og 30°C. Efterfølgende er væksten fulgt over en periode på op til 4 døgn ved, efter grundig omrystning, at udtage en repræsentativ prøvemængde til bestemmelse af optisk densitet ved 550 nm (OD₅₅₀) gennem en gastæt ventil. Prøverne er ført tilbage til flaskerne efter endt måling. OD₅₅₀ er omregnet til koncentration af celleprotein via en standardkurve.

A.3: Nedbrydning af propan

Inkubation

Forsøgene er udført efter standardproceduren ved koncentrationer af celleprotein på mellem ca. 12 og 21 mg/L. Der er tilsat 5 forskellige propankoncentrationer fra ca. 0,05 til 3 mg/L. MTBE er tilsat til en startkoncentration på ca. 10 mg/L. Tabel A.1 giver en summarisk beskrivelse af forsøgsopsætningen.

Tabel A.1: Forsøgsopsætning ved bestemmelse af propankinetik.

Propan- og MTBE-koncentrationen er analyseret i head-space over op til 60 timer. Nedbrydningsraterne er bestemt som initialrater.

A.4: Nedbrydning af MTBE

To forsøgsrækker

Der er udført to forsøgsrækker til afklaring af forholdene omkring MTBE-nedbrydningshastigheden:

1) Propan-koncentrationens betydning (varierende propan-koncentration og konstant MTBE-koncentration).

2) MTBE-koncentrationens betydning (varierende MTBE-koncentration og konstant propan-koncentration).

Inkubation – propans betydning

Til den første række forsøg er der anvendt de samme flasker som ved forsøget til bestemmelse af nedbrydningskinetikken for propan, jf. bilag A.3, hvorfor inkubationsbetingelserne er identiske med de ovenfor beskrevne betingelser. Blot er der i databehandlingen fokuseret på data for MTBE.

Inkubation – MTBEs betydning

Den anden række forsøg er ligeledes udført efter standardproceduren ved koncentrationer af celleprotein på mellem ca. 12 og 22 mg protein/L. Der er anvendt 5 forskellige MTBE-koncentrationer fra ca. 5 til 220 mg/L. Primærsubstrat er tilsat til en startkoncentration på ca. 0,06 mg/L. Tabel A.2 giver en summarisk beskrivelse af forsøgsopsætningen.

Tabel A.2: Forsøgsopsætning ved bestemmelse af MTBE-kinetik.

MTBE-koncentrationen er moniteret ved head-space analyse over en periode på op til 110 timer. Nedbrydningsraterne er bestemt som initialrater over de første ca. 5 timer.

A.5: Temperatur-følsomhed

Inkubation

Forsøgene er udført efter standardproceduren ved koncentrationer af celleprotein på ca. 22 mg protein/L. Der er udført forsøg ved hhv. 10°C og 23°C, med en dobbeltbestemmelse ved hver temperatur. MTBE er tilsat til en startkoncentration på ca. 10 mg/L og propan er tilsat til en startkoncentration på ca. 0,19 mg/L. Tabel A.3 giver en summarisk beskrivelse af forsøgsopsætningen.

Tabel A.3: Forsøgsopsætning ved bestemmelse af temperatur-følsomhed.

Flaskerne inkuberet ved 10°C er opbevaret i køleskab sammen med flasker til bestemmelse af en standardrække under omrystning ved 150 rpm. Fra udtagning til analyse på GC, der er placeret ved stuetemperatur (23°C) er flaskerne opbevaret i en spand med fugtigt sand, der ligeledes har stået på køl. MTBE-koncentrationen er moniteret ved head-space analyse over en periode på op til 310 timer.

A.6: Ilt-følsomhed

Inkubation

Til disse forsøg er der anvendt 250 mL flasker, indeholdende 50 mL vækstmedie med biomasse. Forsøgene er udført ved koncentrationer af celleprotein på ca. 50-70 mg protein/L og iltkoncentrationer på mellem 0 og 8,2 mg/L. MTBE er tilsat til en startkoncentration på ca. 10 mg/L og substrat er tilsat til en startkoncentration på ca. 0,05 mg/L. Tabel A.4 giver en summarisk beskrivelse af forsøgsopsætningen.

Tabel A.4: Forsøgsopsætning ved bestemmelse af ilt-følsomhed.

MTBE-koncentrationen er moniteret ved head-space analyse over en periode på op til 37 timer.

A.7: BTEX-følsomhed

Inkubation

Til disse forsøg er der anvendt 250 mL flasker, indeholdende 50 mL vækstmedie med biomasse. Forsøgene er udført ved en koncentration af celleprotein på ca. 15 mg protein/L og benzen-koncentrationer fra 0 til ca. 43 mg/L. MTBE er tilsat til en startkoncentration på ca. 8,5 mg/L og substrat er tilsat til en startkoncentration på ca. 0,12 mg/L. Tabel A.5 giver en summarisk beskrivelse af forsøgsopsætningen.

Tabel A.5: Forsøgsopsætning ved bestemmelse af benzen-følsomhed.

Flaskerne er omrystet ved 150 rpm og placeret ved 23°C. Benzen-, propan- og MTBE-koncentrationen er moniteret ved head-space analyse over en periode på op til 75 timer. Nedbrydningsraterne er bestemt som initialrater efter en eventuel lag-periode.

A.8: Substrattilførsel

Inkubation

Forsøgene er udført efter standardproceduren ved koncentrationer af celleprotein på ca. 18 mg protein/L. Der er udført forsøg med gentagne substrattilsætninger, samt efter 0, 1 og 2 dages sulteperiode (uden substrat). MTBE er tilsat til en startkoncentration på ca. 8-9 mg/L og propan er tilsat til en startkoncentration på mellem 0,05 og 0,08 mg/L. Tabel A.6 giver en summarisk beskrivelse af de eksakte forsøgsopsætningen.

Tabel A.6: Forsøgsopsætning ved undersøgelse af substrattilførsel.

MTBE- og propankoncentrationen er moniteret ved head-space analyse over en periode på op til 94 timer. Nedbrydningsraterne er bestemt som initialrater.

A.9: Nedbrydningsprodukter

Inkubation

Til disse forsøg er der anvendt 1.000 mL flasker, indeholdende 200 mL vækstmedie med biomasse. Forsøgene er udført ved en koncentration af celleprotein på ca. 64 mg/L. MTBE er tilsat til en startkoncentration på ca. 50 mg/L og substrat er tilsat til en startkoncentration på ca. 0,5 mg/L. Tabel A.7 giver en summarisk beskrivelse af forsøgsopsætningen.

Tabel A.7: Forsøgsopsætning ved bestemmelse af nedbrydningsprodukter.

Flaske 1 og 2 er benyttet til at måle MTBE- og TBA-koncentrationen i head-space. Flaske 3, 4 og 5 er benyttet til at måle ¹⁴CO₂-udviklingen via opsamling i en KOH-fælde (se nedenfor). Flaske 4 er opsplittet efter 307 timer for at bestemme fordelingen af ¹⁴C imellem den opløste fase (MTBE og nedbrydningsprodukter) og den partikulære fase (biomasse), mens flaske 6 er benyttet som kontrol, til at måle det abiotiske tab af ¹⁴C-MTBE fra flasken. Forsøget er udført over en periode på 21 døgn.

Figur A.2 viser en skematisk fremstilling af forsøgsopsætningen for de flasker, der er tilsat ¹⁴C-mærket MTBE. Beholderen med KOH-opløsning benyttes til at opsamle den udviklede CO₂.

Figur A.2: Skematisk fremstilling af forsøgsopsætning for ¹⁴C-forsøget.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Juli 2007, © Miljøstyrelsen.