1. Litteraturgennemgang af blågrønalgetoksiner

Siden Francis (1878) gav den første beskrivelse af toksiske effekter af en blågrønalgeopblomstring, er der kommet talrige rapporter om forgiftninger af mennesker, husdyr og vilde dyr, som har drukket af vand med store koncentrationer af blågrønalger (se f.eks. Schwimmer & Schwimmer 1968). Dette har i kombination med stigende behov for udnyttelse af vandressourcer medført øget opmærksomhed omkring forekomsten af og toksinproduktionen hos blågrønalger. I en række lande er der foretaget undersøgelser, som viser, at blågrønalgeopblomstringer meget hyppigt producerer toksiner (figur 1-1, bilag 1-1). Den her beskrevne undersøgelse bekræfter, at dette også er tilfældet i Danmark.

Figur 1-1
Undersøgelser af forekomst af toksiske blågrønalger. Mørk grå: andelen af undersøgte lokaliteter, hvor der forekom toksiske blågrønalger. Lys grå: andelen af lokaliteter uden toksiske blågrønalger. Resultaterne fra Danmark stammer fra den her beskrevne undersøgelse.


Antallet af blågrønalger, som vides at kunne producere toksiner, stiger hvert år. I 1993 sammenstillede Skulberg et al. (1993) den daværende viden, og listede 42 potentielt toksinproducerende arter (se bilag 1-2). Af de 42 er 10 encellede organismer, der oftest er samlet i kolonier holdt sammen af gelé (figur 1-2, a), mens de resterende er flercellede tråde (figur 1-2, b).

(a)

(b)

Figur 1-2
Microcystis arter (a) og Anabaena arter (b). Microcystis og Anabaena er to af de almindeligst forekommende toksinproducerende blågrønalgeslægter i danske søer.

1.1 Effekter af blågrønalgetoksiner

Forgiftningstilfælde som følge af blågrønalger er kendt i hele verden, og forgiftninger af mennesker og kvæg er beskrevet allerede i forrige århundrede (Farre 1844 i Schwimmer & Schwimmer 1968, Francis 1878). I Danmark er der gennem de sidste 15 år jævnligt observeret ildebefindende hos kvæg (krampe og kalvekastning) og dødsfald hos hunde samt fisk og fugle, der har drukket søvand med opblomstringer af blågrønalger (Damsø et al. 1994).

I modsætning til f.eks. Norge og Sverige har vi i Danmark endnu ikke veldokumenterede rapporter om effekter af blågrønalger på mennesker. En væsentlig årsag til dette kan være manglende opmærksomhed og manglende viden. Koblingen mellem sygdomssymptomer og blågrønalger må oftest ske indirekte ved at kombinere viden om forekomst af blågrønalger, forekomst af toksiner, effekt af toksiner og sygdomsbillede. Hyppigt inddrages blågrønalger først som en mulig årsag, når alle andre forklaringer er udelukket.

Badevand
Rødme og udslet

Hudinflammationer (rødme og udslet) hos mennesker, der har badet i søer med blågrønalgeopblomstringer, er almindelig kendt i udlandet (Annadotter 1993, Carmichael et al. 1985, Codd & Bell 1985). I Sverige er der i en række tilfælde observeret høfebersymptomer som snue, rindende øjne og astma hos badende, der har været i kontakt med blågrønalgeopblomstringer (Heise 1949, Heise 1951, Annadotter 1993). Det er usikkert, om der er tale om en direkte toksisk effekt, eller om inflammationerne og høfeberen skyldes allergi mod algerne.

Tabel 1-1

Mavetarmkatar
Normalt vil mennesker ikke, som f.eks. kvæg og hunde, indtage så store mængder søvand, at det får lethale effekter. Der er imidlertid flere eksempler på, at mennesker er blevet dårlige efter at have drukket mindre mængder søvand med blågrønalger. I Canada blev 11 børn og et par voksne syge efter trods advarsler i aviser og TV at have badet i søer med kraftige algeopblomstringer (Dillenberg 1960). Symptomerne var mavesmerter, diarré, opkastninger, feber og hovedpine. I faeces fra de syge blev der fundet celler af blågrønalger, mens der ikke var spor af patogene bakterier eller virus. I 1989 blev engelske rekrutter sendt på øvelse på en sø med opblomstring af blågrønalgen Microcystis aeruginosa, og 10 af rekrutterne, der drak søvand, fik bagefter pneumonia (lungeinflammation) foruden feber, mavekrampe, opkastning m.m. (Turner et al. 1990). Heller ikke i dette tilfælde blev der fundet patogene bakterier eller virus, der kunne forklare sygdomsudbrudene.

Lungeinflammation
I Danmark er kraftige blågrønalgeopblomstringer almindelige om sommeren i mange af vore badevandssøer, som f.eks. søerne i Mølleåsystemet og Gudenåsystemet, og advarsler mod badning forhindrer normalt ikke folk i at bade i søerne. Når der ikke er rapporteret patogene effekter skyldes det sandsynligvis, at symptomerne ligner almindelig bakterie/virus infektion, samt at de normalt forsvinder hurtigt (indenfor 1-2 dage) og kun rammer særligt følsomme personer. I mange tilfælde vil folk derfor ikke søge læge, og hvis de gør, vil lægen ikke sætte symptomerne i forbindelse med forekomst af blågrønalger.

Drikkevand
En hyppig årsag til blågrønalgeforgiftninger er indtagelse af toksiner med drikkevandet. I Danmark bruger vi kun i begrænset omfang overfladevand fra søer til drikkevand. Således udgør søvand på årsbasis ca. 4-18% af drikkevandet. Indvindingen foregår hovedsageligt i hovedstadsområdet, og overfladevandet opblandes med grundvand, så det aldrig udgør over 50%. Til sammenligning kommer 75% af den svenske vandforsyning fra søer (Annadotter 1993), og i Finland er andelen 48% (Lepistö et al. 1994). Sandsynligheden for toksiske effekter på mennesker er derfor langt mindre i Danmark.

I lande, hvor drikkevandet er baseret på ferskvandsindvinding, kan der opstår epidemier, hvor større befolkningsgrupper rammes (se tabel 1-2). I Australien oplevede man i 1991 den hidtil største blågrønalge"katastrofe" i verden. Blågrønalgen Anabaena circinalis dannede en kraftig opblomstring over en mere end 225 km lang strækning af Darling flodsystemet, der bruges til drikkevand. Algen producerede både lever og nervetoksiner, og indtagelse af algeholdigt vand medførte at folk blev syge, og kvæg, får og hunde døde. Området omkring floden blev erklæret for katastrofeområde, og militæret blev indsat for at bringe rent vand ud.

På Palm Island blev 148 mennesker syge efter at have drukket vand, der stammede fra et vandreservoir domineret af Cylindrospermopsis raciborskii. Der var få dage forinden blevet tilsat kobbersulfat til søen for at regulere en kraftig algeopblomstring. Ved tilsætning af kobbersulfat dør algerne, og eventuelle toksiner frigives (Hawkins et al. 1995).

Mavetarm katar / Barcoo fever
En almindelig følge af blågrønalgeforgiftning efter indtagelse af forurenet drikkevand er mavetarmkatar (Annadotter 1993, Tabel 1-2). I Australien er der desuden konstateret sygdomstilfælde med effekter på leveren hos mennesker, der får drikkevand fra damme/søer med masseopblomstringer af blågrønalger (Bourke et al. 1983, Falconer et al. 1983a). Ligeledes fra Australien er det foreslået, at en sygdom beskrevet som "Barcoo fever" kan skyldes indtagelse af blågrønalgetoksiner (Hayman 1992). Sygdommen er karakteriseret ved feber, hovedpine, kvalme, opkastninger og kraftig diarré; symptomer som hyppigt er rapporteret i forbindelse med indtagelse af vand med blågrønalger (Schwimmer & Schwimmer 1968, Billings 1981, Turner et al. 1990, Annadotter 1993, Saadi & Cameron 1993).


Tabel 1-2
Sygdomstilfælde forårsaget af blågrønalger i drikkevand forskellige steder i verden

Badfeber
Den såkaldte badfeber er et andet sygdomsbillede, som menes at skyldes blågrønalgetoksiner i hanevand. De ramte personer får influenzalignende symptomer med feber få timer efter, at de har været i bad. I Sverige og Finland er der gennem de sidste 20 år konstateret flere epidemier af badfeber (Annadotter 1993). Rylander et al. (1989) konkluderer, at epidemierne skyldes indånding af endotoksiner, og at disse toksiner stammer fra blågrønalger, fordi der er en tæt sammenhæng mellem forekomsten af epidemier og opblomstringer af disse alger.

Dødsfald
I enkelte tilælde har blågrønalgetoksiner haft markante lethale effekter på mennesker. I foråret 1996 døde 55 patienter efter at have været i dialyse på et dialysecenter i Caruarce, Brasilien. 44 af disse patienter døde af leverproblemer/leverblødning. Der kunne detekteres microcystiner i serum fra patienter i live samt i levervæv fra de afdøde patienter. Dialysecentret modtog vand fra et reservoir, hvor der var opblomstring af blågrønalger, og i centrets aktive kulfiltre til vandrensning måltes høje koncentrationer af micrycystiner (µgmg pr. gram filtermateriale) (Carmichael 1996).

Cancer
Nye forskningsresultater indikerer, at levertoksiner fra blågrønalger fremmer cancer (Nishiwaki-Matsushima et al. 1992, Falconer & Humpage 1996), og nogle toksiner er direkte carcinogene (Ohta et al. 1994). NishiwakiMatsushima et al. (1992) foreslår, at et markant højere antal tilfælde af levercancer hos befolkningsgrupper i Kina, som får drikkevand fra smådamme, i forhold til grupper som får drikkevand fra brønde (Yu 1989), kan skyldes tilstedeværelsen af microcystinproducerende Microcystis i dammene. En efterfølgende undersøgelse (Ueno et al. 1996) viste, at vandprøver fra damme eller floder oftere indeholdt levertoksiner end vand fra brønde. Desuden var toksinkoncentrationen højere i vand fra damme og floder. Også andre typer af blågrønalgetoksiner har cancerfremmende effekter. Den marine art Lyngbya majuscula producerer aplysiatoxin og lyngbyatoxin-A, som udover at give irritation af hud og slimhinder i mund og tarmsystem, kan fremme dannelsen af hudtumor.

Blågrønalgetoksiner har således ikke kun akutte effekter. Samlet giver de konstaterede sygdomstilfælde med forbindelse til blågrønalgeopblomstringer grund til stor forsigtighed, både når blågrønalgeholdigt vand anvendes til drikkevand og til rekreative formål.

1.2 Hvilke toksiner producerer blågrønalger?

For at undersøge om blågrønalgers toksiner er årsag til sygdomstilfældene, er det nødvendigt at vide, hvilke toksiner blågrønalger kan danne, hvordan de skal detekteres, og hvilke effekter de har. Siden 1972, hvor den kemiske struktur af det første blågrønalgetoksin blev bestemt, er der beskrevet over 50 toksiner, som er særegne for blågrønalger (Carmichael 1994). Dertil kommer en række toksiner, som også findes i andre organismegrupper.

Blågrønalger i ferskvand producerer 4 forskellige typer toksiner: levertoksiner, nervetoksiner, endotoksiner og cytotoksiner, og i det følgende gives en nærmere beskrivelse af de 4 typer.

1.2.1 Levertoksiner

Levertoksiner er de hyppigst rapporterede toksiner hos blågrønalger. I dag kendes 3 forskellige typer levertoksiner: microcystiner, nodulariner og cylindrospermopsin (tabel 1-4).


Effekter
Hos pattedyr er målorganet for levertoksiner (microcystiner og nodulariner) først og fremmest leveren. Toksinerne bliver sandsynligvis optaget af cellerne via de samme transportveje som galdesyre (Falconer 1993), og intracellulært medfører de på grund af deres specifikke hæmning af proteinfosfataserne 1 og 2A, at cytoskelettet ændres og cellerne deformeres (Eriksson et al. 1990). Deformering af levercellerne medfører blodtab, og ved kraftig forgiftning kan dette medføre dødsfald i løbet af få timer. Målorganet for disse toksiner er dog ikke leveren hos alle dyregrupper. Forsøg med vagtler har vist, at milten hos fugle, som fik injiceret microcystin-RR, forstørredes til ca. dobbelt størrelse, mens leveren ikke blev påvirket (Takahashi & Kaya 1993).

Udover eventuelle akutte forgiftninger forårsaget af levertoksiner, vækker den hyppige forekomst af disse toksiner i stigende grad bekymring, da det har vist sig, at de kan fremme tumordannelse. Øget vækst af levertumorer ved injektion af microcystin-LR er således vist hos rotter, hvor tumordannelsen var initieret ved injektion af diethylnitrosamin (Nishiwaki-Matsushima et al. 1992). Tilsvarende resultater er fundet for nodularin, hvor det desuden blev vist, at dette toksin er et carcinogen (Ohta et al. 1994). Tilsyneladende initierer microcystinerne ikke i sig selv levertumor (Carmichael 1994).

I langtidsforsøg (op til 1 år) med mus, hvis drikkevand bestod af forskellige sublethale koncentrationer af ekstrakt af toksisk Microcystis aeruginosa, øgedes dødeligheden samt antallet af leverskader i gruppen, som fik den højeste dosering (Falconer et al. 1988). Andre forsøg med mus viste, at såfremt tumordannelse initieredes med dimethylbenzanthracene, fremmede tilsætning af microcystinholdigt Microcystis ekstrakt til dyrenes drikkevand signifikant væksten af tumorerne (Falconer 1991). Årsagen til den cancerfremmende virkning af levertoksiner menes at være hæmningen af proteinfosfataserne, idet disse er vigtige i kontrollen af celledelinger.

Det mest almindeligt forekommende levertoksin, microcystin-LR, kan forårsage DNA-skader i leveren hos forsøgsdyr (mus) samt i cellekulturer in vitro (Lakshmana Rao & Bhattacharya 1996).

Microcystiner
Inden den kemiske struktur af de almindeligste levertoksiner, microcystinerne, blev beskrevet, blev de benævnt:

- "fast death factor" (Bishop et al. 1959)
- microcystin (Konst et al. 1965)
- cyanoginosin (afledt af cyanobacteria og Microcystis aeruginosa) (Boteset al. 1984)
- cyanoviridin (afledt af cyanobacteria og Microcystis viridis) (Kusumi etal. 1987)
- cyanogenosin (forkert stavning af cyanoginosin) (Painuly et al. 1988)
- Microcystistoxin (Runnegar & Falconer 1986).
- Oscillatoriatoxin (Eriksson et al. 1989)

Bishop et al. (1959) angav, at "fast death factor" hos Microcystis aeruginosa var et peptid, men først i 1984 lykkedes det Botes et al. (1984) at beskrive den kemiske struktur af cyanoginosin-LA (= microcystin-LA). Stoffet var, ligesom tre andre toksiner isoleret fra Microcystis aeruginosa (Botes et al. 1982), et cyklisk peptid bestående af syv aminosyrer. Det viste sig, at forskellen imellem de fire toksiner lå i to L-aminosyrer, de såkaldt variable aminosyrer. Betegnelsen-LA angiver, at dette toksin indeholder leucin og alanin som de to variable aminosyrer.

Struktur
I 1988 blev en generel nomenklatur for de levertoksiske heptapeptider fra blågrønalger foreslået (Carmichael et al. 1988a). Toksinerne er siden blevet betegnet microcystin efterfulgt af to bogstaver, som angiver de variable aminosyrer. I figur 1-3 er vist strukturformlen for en række microcystiner. En række forskellige kombinationer af de variable aminosyrer i microcystin er fundet i såvel naturlige opblomstringer som i kulturer af blågrønalger. Desuden kendes et stort antal microcystiner, hvor en eller flere af de øvrige fem aminosyrer er delvist modificeret. Der er således nu beskrevet over 50 derivater af microcystin (Sivonen 1996).

Toksicitet
Toksiciteten af de forskellige microcystin derivater varierer fra 50 til > 1200 µg pr. kg (udtrykt som LD-50 ved intraperitoneal injektion i mus, hvor LD50 er den dosis, der slår 50% af forsøgsdyrene ihjel) afhængig af variationerne i aminosyrerne. Variationer i aminosyrerne 2 og 4 (Fig. 1-3) giver kun mindre ændringer i toksiciteten, mens ændringer i glutaminsyreenheden samt nogle ændringer i Adda enheden medfører en meget kraftig reduktion af toksiciteten (Rinehart et al. 1994).

Figur 1-3

Struktur af microcystiner med angivelse af molekylevægten af nogle af de mest almindelige varianter (fra Carmichael & Falconer 1993).


Arter
Microcystiner er blevet påvist hos mange arter af blågrønalger (tabel 1-3 og bilag 1-3). De fleste rapporter omhandler Microcystis aeruginosa, og microcystiner er fundet hos denne art i de fleste områder af verden. Slægten Anabaena, som oftest forbindes med nervetoksiner (f.eks. anatoxin-a) har også vist sig at producere microcystiner. Tilsvarende findes mange rapporter fra Norden om microcystiner hos Planktothrix agardhii (= Oscillatoria agardhii).

Nodularier
Cylindrospermopsin
De øvrige levertoksiner, hvis kemiske struktur er kendt (nodulariner og cylindrospermopsin, er kun fundet hos hhv. brakvandsarten Nodularia spumigena og den subtropiske art Cylindrospermopsis raciborskii.

Nodularia spumigena forekommer tilbagevendende i Østersøen i sensommeren og danner ofte toksiske opblomstringer (Sivonen et al. 1989, Kononen et al. 1993). Disse opblomstringer har ved flere lejligheder forårsaget dødsfald af hunde, kalve og ænder (Nehring 1993).

Tabel 1-3

Omdannelsesveje efter Larsen et al. (1993).

1.3.2 Biologisk nedbrydning

Microcystiner
Biologisk nedbrydning af microcystiner er undersøgt i laboratorieforsøg med rene toksiner (Watanabe et al. 1992a, Jones et al. 1994, Tsuji et al. 1994) og med toksinproducerende kulturer af blågrønalger (Kiviranta et al. 1991a, Watanabe et al. 1992a) samt i naturen under induceret lysis af en opblomstring af Microcystis aeruginosa (Jones & Orr 1994).

Undersøgelserne viser både direkte (Jones et al. 1994) og indirekte (Berg et al. 1987a, Watanabe et al. 1992a, Jones & Orr 1994), at microcystin kan nedbrydes mikrobielt, men samtidig, at der ikke altid er mikroorganismer til stede i vandet, som kan foretage denne nedbrydning (Kiviranta et al. 1991a). Kiviranta et al. (1991a) tilsatte flodvand med de naturligt forekommende mikrooganismer til axeniske (bakteriefri) kulturer af Oscillatoria agardhii. Mikroorganismerne øgede ikke nedbrydningen af toksin i vandfasen, og efter 8 uger fandtes stadig høj koncentration af toksin i kulturerne.

I forbindelse med nedbrydningen af en ikke axenisk Microcystis aeruginosa kultur observeredes ændringer af bakteriesammensætningen (Watanabe et al. 1992a). Målinger af toksinkoncentrationen i kulturmediet viste, at microcystin-YR blev nedbrudt hurtigere end microcystin-LR. Efter 70 dage var begge toksiner stadig til stede i kulturen. Parallelt med dette blev nedbrydningen af rent microcystin-YR og LR i hhv. destilleret vand og kulturmedium undersøgt over 45 dage. I begge tilfælde blev microcystin-YR nedbrudt hurtigere end microcystin-LR. Efter 45 dage var microcystin-YR koncentrationerne reduceret til 69,2 og 58,6% (i hhv. destilleret vand og kulturmedium), mens microcystin-LR koncentrationerne var faldet til hhv. 85,4 og 86,2% af startkoncentrationerne.

I begge laboratorieforsøg med algekulturer (Kiviranta et al. 1991a, Watanabe et al. 1992a) fandtes toksinerne (hhv. desmethyl3microcystin-RR fra Oscillatoria agardhii og microcystin-LR og YR fra Microcystis aeruginosa) overvejende intracellulært indtil afslutningen af algernes eksponentielle vækstfase og begyndende lysis af cellerne, hvor toksinerne blev frigivet til vandet.

I et laboratorieforsøg med nedbrydning af indsamlet naturligt materiale af Microcystis aeruginosa angav Berg et al. (1987a), at 90% af toksinet (microcystin-LR iflg. Krishnamurthy et al. [1989]) blev nedbrudt mikrobielt i løbet af 40 dage.

Jones & Orr (1994) undersøgte in situ nedbrydning af microcystin-LR efter algicid behandling af et Microcystis aeruginosa bloom i Australien. Toksinindholdet i vandet blev målt vha. HPLC samt med proteinfosfatase inhiberingsassay. HPLC analyserne viste, at efter ni dages lagfase blev 90-95% af toksinet nedbrudt på tre dage. Herefter fulgte en fase med langsommere nedbrydning af det resterende toksin. Inden den hurtige nedbrydning af toksinet startede, sås en markant stigning i inhibering af proteinfosfatase, hvilket indikerede en begyndende mikrobiel omsætning, som resulterede i et nedbrydningsprodukt med kraftigere effekt på proteinfosfatase end microcystin-LR.

Laboratorieforsøg med nedbrydning af rent toksin (microcystin-LR) sat til naturlige vandprøver, viste forskellige nedbrydningshastigheder i de forskellige vandtyper, men et generelt mønster med en lagfase eller en periode med langsom nedbrydning, efterfulgt af en hurtig nedbrydning af toksinet (Jones et al. 1994). Blev der efter den hurtige nedbrydning tilsat yderligere toksin, fortsatte den hurtige nedbrydning uden lagfase. Nedbrydningshastigheden (udtrykt som mg pr. liter pr. dag) var proportional med startkoncentrationen af toksin i forsøgene med tilsætning til flodvand. Nedbrydningen blev vist at foregå overvejende intracellulært, og en isoleret bakteriestamme (en Sphingomonas sp., Bourne et al. 1996) kunne nedbryde både microcystin-LR og RR, men ikke pentapeptidet nodularin. Nedbrydningen af microcystin-LR foregik ved hjælp af mindst 3 intracellulære hydrolytiske enzymer (Bourne et al. 1996).

Resultaterne af de ovenstående undersøgelser er samlet i tabel 1-6 og 1-7.

Anatoxin-a
Biologisk nedbrydning af anatoxin-a er undersøgt i studier med ikke-axceniske (ikke bakteriefri) kulturer af Anabaena circinalis (Kiviranta et al. 1991a). Anatoxin-a blev hovedsageligt fundet intracellulært under den eksponentielle vækstfase. Toksinet lækkede fra cellerne til kulturmediet, når cellerne lyserede. Den maksimale intracellulære anatoxin-a koncentration (ca. 750 µg pr. 100 ml kultur) var ca. 100 gange højere, end den højeste toksinkoncentration fundet i kulturmediet. Af 11 typer bakterier isoleret fra Anabaena kulturen kunne en Pseudomonas sp. (muligvis Pseudomonas fluorescence) nedbryde anatoxin-a. Nedbrydningshastigheden var i det pågældende forsøg 6-30 µg pr. ml pr. 3 dage (Kiviranta et al. 1991a).

Tabel 1-6

Nedbrydningsrater for microcystin-LR i laboratorieforsøg med kulturer, rent toksin og indsamlet naturligt materiale samt in situ studier af en naturlig opblomstring.

Tabel 1-6

a) Toksiciteten opgivet som "Mouse Units", hvor en mouse unit svarer til den mindste dosis algemateriale, som slår en 20 g mus ihjel indenfor fire timer ved musetest.
b) Vandtyper testet: Destilleret vand, filtreret flodvand, flodvand + næring og ufiltreret flodvand.

Tabel 1-7

Nedbrydningsrater for microcystin-YR, RR og desmethyl-3-microcystin-RR i laboratorieforsøg med kulturer samt rene toksiner.

Tabel 1-7

a) Toksinkoncentrationen givet som summen af toksin i algecellerne og i vandet.


PSP
Biologisk transformation af PSP-toksiner er undersøgt hos flere muslingearter, og generelt er toksinprofilen og toksiciteten i dyrene forskellig fra den, der findes hos de alger, der er årsag til akkumuleringen af toksiner. Jury et al. (1994) viste, at C-toksiner (C1-C4) og neo-saxitoxin i gonaderne på kammuslinger omdannes til gonyautoxinerne GTX2, GTX3 og til saxitoxin (STX) med deraf følgende øget toksicitet af muslingerne. Enzymatisk omdannelse af PSP-toksiner i muslinger er vist af Shimizu & Yoshioka (1981) og Sullivan et al. (1983). Kotaki et al. (1985) isolerede Psedomonas sp. og Vibrio sp. fra marine krabber og snegle og viste, at disse bakterier omdanner GTX2 og GTX3 til saxitoxin. Saxitoxinet blev derimod ikke påvirket af bakterierne.

1.3.3 Fjernelse af blågrønalger og toksiner ved vandrensning

Sandfiltrering og sandfiltrering kombineret med aktiv kulfiltrering
Undersøgelse af et vandrensningsanlæg i drift i Finland (Lepistö et al. 1994) viste, at hurtig sandfiltrering kun fjernede 14% af blågrønalgebiomassen, mens sandfiltrering efterfulgt af aktiv kulfiltrering fjernede 42%.

Reduktion af toksinkoncentration ved langsom filtrering gennem sandfiltre blev undersøgt i laboratorieforsøg af Keijola et al. (1988). To filtre med diameter 14 cm og sandhøjde 24 cm blev igangsat med sand fra et stort sandfilter i drift. Vand med hhv. anatoxin-a ekstraheret fra frysetørret Anabaena flosaquae og levertoksiner fra Microcystis aeruginosa (ét toksin) og Oscillatoria agardhii (= Planktothrix agardhii) (to toksiner) blev filtreret igennem sandet med en hastighed på 0,085 m pr. time, svarende til 1,42 l pr. m² pr. min. Anatoxin-a koncentrationen reduceredes hhv. 68 og 74% ved filtrering igennem filtrene og levertoksinet fra M. aeruginosa 86 og 82%. Et af levertoksinerne fra O. agardhii blev ikke fjernet ved filtreringen, mens det andet reduceredes med hhv. 29 og 65%.

Forsøg med filtrering gennem et 0,3 m², 0,7 m højt sandfilter med en vandgennemstrømning på 80-90 l pr. m² pr. min viste, at denne filtrering alene hverken kunne fjerne levertoksin fra Microcystis aeruginosa eller nervetoksin fra Anabaena circinalis (Falconer et al. 1983b, Falconer et al. 1989). Placeredes et 7-8 cm højt lag granuleret aktivt kul ovenpå sandet fjernedes toksinerne fuldkommen. Forskellige fabrikater af kul blev testet, og de kunne alle fjerne toksinerne, mens varigheden af evnen til adsorption af toksiner varierede imellem de forskellige kultyper. For levertoksinerne kunne filtret reducere toksinkoncentrationen til under detektionsgrænsen (svarende til < 5% af den oprindelige toksicitet) i 8-20 m³ toksinholdigt vand afhængig af typen af kul. To forskellige typer kul blev benyttet i forsøgene med nervetoksiner, og de kunne tilsvarende reducere toksinerne i hhv. 12 og 16 m³ vand (Falconer et al. 1989).

Adsorptionen af microcystin-LR har ligeledes vist sig at variere imellem en række aktive kulpulvere (Donati et al. 1994).

Fjernelse af alger og toksiner ved forskellige vandrensningsprocesser
I Norge er der lavet en undersøgelse af et vandrensningsanlæg i drift ved Akersvatn, som i mange år har haft store opblomstringer af levertoksisk Microcystis aeruginosa (Ohren 1988). Vandbehandlingen var filtrering gennem sand og antrasit med aluminium sulfat og Magnafloc LT-20 som koagulanter. Behandlingen fjernede 98% af såvel M. aeruginosa som toksinet fra algerne. På trods af den høje rensningseffekt var opkoncentreret vand, som havde passeret vandrensningsprocessen, levertoksisk ved musetest. Ohren (1988) betegner den mængde alger og toksiner, der akkumuleres i filtret under driften, som en "giftbombe". Uheld eller ændrede driftsforhold kunne eventuelt frigive noget af toksinet til det rensede vand, som når frem til forbrugerne.

Fjernelse af alger i anlæg i drift
I en undersøgelse af fire finske vandrensningsanlæg i drift i 1991 (Lepistö et al. 1994) kunne to af anlæggene fjerne over 95% af blågrønalgebiomassen fra det indtagne vand. Det ene anlæg (Rymättylä) benyttede kontakt filtrering med aluminiumsulfat efterfulgt af aktiv kulfiltrering og klorbehandling. Her fjernedes gennemsnitligt 98% af blågrønalgerne. I det mest effektive anlæg (Raisio-Naantali) blev vandet tilsat aktivt kulpulver, efterfulgt af flokkulering med aluminiumsulfat og sedimentation inden sandfiltrering og klorbehandling. I dette anlæg reduceredes blågrønalgebiomassen gennemsnitligt 99,9%, men alligevel passerede tråde af Oscillatoria agardhii (= Planktothrix agardhii) vandrensningsprocessen under en opblomstring. Denne finske undersøgelse er utilstrækkelig med hensyn til, hvorledes de forskellige anlæg fjerner toksiner fra vandet, idet der i perioden kun forekom en enkelt toksisk opblomstring. Dette var en opblomstring af Anabaena lemmermannii indeholdende et ukendt nervetoksin registreret ved musetest af frysetørret algemateriale indsamlet i søen. Opkoncentrerede prøver af det behandlede vand var ikke toksiske i musetest.

Fjernelse af toksiner i laboratorieforsøg
Fjernelse af hhv. levertoksiner (microcystiner) fra Microcystis aeruginosa og Oscillatoria agardhii og nervetoksinet anatoxin-a ved almindelige vandrensningsprocesser er blevet undersøgt i laboratorieskala (Keijola et al. 1988). Forsøgene blev udført med toksiner ekstraheret fra frysetørret algemateriale, dvs. frie toksiner i vandfasen. Toksinfjernelsen blev undersøgt ved følgende processer:

1) Flokkulering med aluminiumsulfat + sandfiltrering + klorering

2) Flokkulering med jernklorid + sandfiltrering + klorering

3) Tilsætning af aktivt kulpulver (5 mg pr. liter) + flokkulering med aluminiumsulfat + sandfiltrering + klorering

4) Flokkulering med aluminiumsulfat + sandfiltrering + filtrering gennem granuleret aktivt kul + klorering

5) Ozonbehandling (1 mg O₃ pr. liter) + flokkulering med aluminiumsulfat + sandfiltrering + klorering

Kloreringen foregik i alle processerne ved tilsætning af NaOCl svarende til en koncentration på 0,5 mg Cl₂ pr. liter.

Processerne 1-3 reducerede koncentrationen af levertoksiner 0-34% afhængig af metode og toksin. Koncentrationen af nervetoksinet anatoxin-a reduceredes 0-82% afhængig af metode samt startkoncentration af toksinet.

Effektiv fjernelse af toksiner blev fundet i processerne 4 og 5, hvor levertoksinerne fjernedes 100% og anatoxin-a koncentrationen reduceredes 94-100%.

I pilotforsøg i lidt større skala bekræftedes de generelle tendenser fundet i laboratorieforsøgene (Keijola et al. 1988). Disse forsøg blev foretaget med levertoksiner ekstraheret fra frysetørret algemateriale samt med friskt materiale fra en Microcystis aeruginosa opblomstring. Forsøgene bestod af en almindelig vandrensningsproces (flokkulering med aluminiumsulfat, sedimentation og filtrering) samt den almindelige proces indledt med enten ozonbehandling eller tilsætning af aktivt kulpulver.

Fjernelsen af toksiner var mest effektiv i forsøg med frisk blågrønalgemateriale. Alene den første ozonbehandling (1,0-1,5 mg pr. liter) reducerede her toksinkoncentrationen over 90%. Tilsvarende fjernede tilsætning af 20 mg aktivt kul pr. liter inden den normale proces over 99% af toksinet.

I forsøgene med ekstrakter fra frysetørrede alger reducerede den indledende ozonbehandling toksinkoncentrationen ca. 50%, og ca. 10% kunne genfindes efter hele rensningsprocessen. Indledende tilsætning af 20 mg aktivt kulpulver pr. liter fjernede 90% af toksinet, mens 100 eller 200 mg pr. liter fjernede toksinet totalt.

Effekten af klorbehandling på nedbrydning af microcystin-LR og LA ekstraheret fra Microcystis aeruginosa og nodularin ekstraheret fra Nodularia spumigena er blevet undersøgt i laboratorieforsøg (Nicholson et al. 1994).

Tilsætning af mere end 1 mg Cl₂ pr. liter eller 2,5 mg Ca(OCl)₂ pr. liter fjernede indenfor 30 min over 95% af microcystinerne og nodularin (startkoncentrationer 130-300 µg pr. liter). Derimod blev kun 70-80% af microcystinerne fjernet ved tilsætning af NaOCl (koncentration > 5 mg pr. liter).

Nedbrydningen af toksinerne var pH-afhængig. Ved pH < 8 fjernedes microcystinerne helt ved tilsætning af Cl₂ eller Ca(OCl)₂ i koncentrationer på 15 mg pr. liter i 30 min. Effekten af NaOCl var lidt mindre (ca. 95% reduktion i toksinkoncentrationen). Nedbrydningen af microcystinerne reduceredes markant ved pH > 8 ved brug af NaOCl og Ca(OCl)₂ og ved pH > 9, når Cl₂ blev benyttet.

Forsøg med nedbrydning af microcystin-LR og LA ved tilsætning af 20 mg monokloramin viste kun en meget lille reduktion (17%) i toksinkoncentrationen efter 5 dage (Nicholson et al. 1994).

Ved omvendt osmose kunne 96,7-99,9% af microcystin-LR og RR fjernes fra ferskvand og 3‰ saltvand (Neumann & Weckesser 1998) og nodularin fjernes fra brakvand (Vuori et al. 1997).

Fjernelse af alger og toksiner i anlæg i drift
En omfattende undersøgelse af forekomst af blågrønalger og toksiner fra disse ved to vandrensningsanlæg blev foretaget i Sverige i 1989 og 1991 (Annadotter 1993).

I anlægget ved Finjasjön filtreres søvandet først gennem en 55 µm si og siden gennem et 1,16 m højt sandfilter, inden det ledes ud i en infiltrationsdam. Herfra siver vandet ned igennem 30 m grus, inden det pumpes op og sendes ud til konsumenterne.

Vombsjöns anlæg filtrerer vandet gennem en 45 µm si og leder det så ud i en række infiltrationsbassiner. Herfra infiltreres vandet gennem et 25 m dybt lag grus og sand og klorbehandles, inden det sendes ud til konsumenterne.

Toksiciteten af algerne i søerne samt forskellige steder i vandrensningsprocesserne blev bestemt ved musetest samt ved HPLC-analyser for microcystiner. Desuden blev vandprøver udtaget forskellige steder i vandrensningsprocesserne og analyseret for opløste microcystiner i vandet ved hjælp af HPLC.

I Finjasjöns anlæg reduceredes mængden af alger (målt som klorofyl a koncentrationen) i september 1989 i gennemsnit 63% ved filtreringen gennem sien og sandfiltret. I tre ud af fire målinger fandtes der større mængder af alger i infiltrationsdammene end umiddelbart efter sandfiltret. I det ene tilfælde var algemængden endda større end ved vandindtaget i søen. Både ved vandindtaget lige inden sandfiltret og i infiltrationsdammen blev der i september 1989 fundet toksiske alger. Derimod blev der ikke registreret opløste microcystiner i vandet (detektiongrænse 0,5 µg pr. liter).

I Vombsjön i 1991 reduceredes algemængden (målt som klorofyl a koncentrationen) i gennemsnit 25% ved filtreringen igennem 45 µm sien. I denne sø var 15 ud af 18 algeprøver indsamlet i 1991 toksiske (musetest), og i en enkelt ud af i alt 36 vandprøver indsamlet i anlægget blev der påvist frit levertoksin. Denne prøve var taget efter 45 µm sien og indeholdt 827 ± 65 ng microcystin-LR pr. liter. Der kunne ikke spores toksiner i det færdigt behandlede vand.

Sammenfatning
Indvindes søvand til anvendelse som drikkevand skal der tages forholdsregler for at fjerne såvel blågrønalgeceller som eventuelle frie toksiner i vandet.

Placeres vandindtaget på forholdsvis dybt vand, kan de generelt højere koncentrationer af alger i overfladevandet undgås, men denne placering kan dog også være problematisk. Östra Kyrksundet på Ålandsøerne bliver benyttet til vandforsyning. I 1987 forekom store mængder af levertoksinproducerende Oscillatoria agardhii (= Planktothrix agardhii) i søen, og i august måned blev de højeste alge og toksinkoncentrationer fundet i 6 meters dybde, hvor vandindtaget er placeret (Lindholm et al. 1989).

Frafiltrering af algerne i forbindelse med vandindtaget er vigtigt for at fjerne eventuelle toksiner, idet blågrønalgetoksinerne overvejende findes intracellulært, så længe algerne er i vækst og først frigives til vandet i større mængde, når algepopulationen henfalder (NRA 1990, Kiviranta et al. 1991a, Watanabe et al. 1992b). Filtreringen skal så vidt muligt være skånsom for at forhindre ødelæggelse af algecellerne med efterfølgende frigivelse af toksiner til vandet.

Tilbageholdelse af algeceller og toksiner ved sandfiltrering er generelt ringe, om end varierende. Tilsætning af aktivt kulpulver, flokkulering og sedimentation inden sandfiltreringen giver en stor reduktion af algebiomassen og toksinindholdet.

Kombineres sandfiltreringen med aktivt kulfiltrering, kan toksinerne fjernes helt. Der er stor forskel på adsorptionskapaciteten for forskellige typer aktivt kul.

Langsom sandfiltrering kan give en vis reduktion af frie toksiner i vandet, men processen er afhængig af biofilmen i filtret (Keijola et al. 1988).

Indledende ozonbehandling af vandet kan fjerne toksinerne helt. Det er muligt, at ozonbehandling senere i processen vil være mere effektiv, idet en større del af den oxidative kapacitet vil kunne bruges på toksiner i stedet for reaktioner med andet organisk materiale (Keijola et al. 1988).

Fjernelse af microcystiner ved klorering vil afhænge af en kombination af den anvendte klorforbindelse, koncentrationen og pH. Laboratorieforsøg har vist en effektiv fjernelse ved tilsætning af Cl₂ eller Ca(OCl)₂ (15 mg pr. liter) ved pH lavere end 8 (Nicholson et al. 1994).

1.4 Detektion af blågrønalgetoksiner

Den første metode, der blev brugt til at eftervise toksinproduktionen hos blågrønalger, var injektion af algemateriale i bughulen på mus. Denne musetest anvendes stadig hyppigt, men er i takt med det stigende kendskab til toksinernes kemi blevet afløst af eller suppleret med en række kemiske analyser og biologiske assays. I det følgende beskrives en række metoder til detektion af toksinerne.

1.4.1 Bioassays

Musetest
Ved en musetest injiceres algemateriale i bughulen på forsøgsmus, som efterfølgende observeres for respons (Falconer 1993). Typisk anvendes hvide mus med en vægt på ca. 20 g. Generelt bruges frysetørret algemateriale, som inden injektionen opslemmes i 0,1- 1,0 ml 0,9% NaCl. Brugen af frysetørret materiale vil give bedre ekstraktion af de intracellulære toksiner, idet en stor del af cellerne under frysningen vil blive ødelagt. Desuden giver brugen af frysetørret materiale mulighed for at relatere respons direkte til algetørvægten. Ved injektion af varierende mængder af algemateriale i en række mus kan LD50 beregnes.

Musetesten er uspecifik, idet musens respons på injektionen af algerne ikke afslører nøjagtig, hvilket toksin prøven måtte indeholde (undtaget anatoxin-a(s)). Til gengæld er det en styrke ved denne test, at den i modsætning til specifikke kemiske analyser også vil registrere tilstedeværelsen af ukendte toksiner. På baggrund af det tidsrum der går fra injektionen til musens død, musens opførsel samt leverens udseende ved efterfølgende obduktion, kan der dog med denne test skelnes mellem nervetoksiner og levertoksiner (tabel 1-8). En tredje type toksicitet, som kan registreres med musetesten, er blevet betegnet "protracted" (langtrukken) toksicitet. Her dør musene i løbet af 4-24 timer uden tegn på organskader (Skulberg et al. 1994). Det vides ikke, hvilke stoffer toksiciteten kan tilskrives.
Musetesten er benyttet til at vurdere toksiciteten af forskellige rene toksiner isoleret fra blågrønalger og er bl.a. blevet anvendt til at bestemme, hvilke kemiske strukturændringer i microcystinerne, der har betydning for toksiciteten (Stotts et al. 1993).

Tabel 1-8
Symptomer samt overlevelse hos mus injiceret med lever eller nervetoksinholdigt blågrønalgemateriale.

Sivonen et al. (1990a).

Musetesten kan i nogle tilfælde overvurdere toksiciteten. F.eks. ekstraheres PSP-toksiner ud af algematerialet inden injektion i musene ved brug af saltsyre, og i det sure miljø kan de lavtoksiske PSP-toksiner (N-sulfocarbamattoksiner) omdannes til de mere toksiske carbamattoksiner (Larsen et al. 1993). Desuden kan forekomst af nogle salte og metaller påvirke udfaldet af testen.

Musetest er den internationalt anerkendte metode til testning af PSP-toksicitet (metode ifølge Association of Official Analytical Chemists, AOAC, 1984) i fødevarer som f.eks. blåmuslinger. Toksiciteten måles i museenheder, hvor 1 museenhed (MU) = den mængde, der skal til at slå en 20 grams mus ihjel indenfor 15 minutter. Grænseværdien for PSP-toksiner er 80 µg STX pr. 100 g muslingekød svarende til 444 museenheder (MU) pr. 100 g muslingekød. Den aktuelle omregningsfaktor afhænger af den anvendte musestamme. Er PSP-koncentrationen målt med HPLC (se under HPLC), omregnes toksiciteten af de enkelte toksiner til STX-ækvivalenter (se figur 1-4). Detektionsgrænsen for musetesten er ca. 40 µg STX pr. 100 g (Sullivan & Wekell 1986). Tilsvarende grænseværdier findes ikke for de andre blågrønalgetoksiner.

Microtox assay
Anvendelsen af Microtox assay (Microtox Toxicity Analyzer Model 500, Microbics Corporation, Carlsbad, CA (Microbics 1982)) til hurtig screening for toksicitet i prøver af blågrønalger blev foreslået af Lawton et al. (1990). I dette bioassay vurderes toksiciteten af prøven udfra en bestemmelse af den koncentration, som giver 50% hæmning af bioluminescencen hos bakterien Photobacterium phosphoreum (EC₅₀). Metoden blev anvendt af Volterra et al. (1992), som dog angav afvigelser af toksicitetsbestemmelsen i forhold til HPLC analyser. Ved en sammenlignende undersøgelse af Microtox assayet med bl.a. HPLC analyser af toksinindhold i en række ekstraherede fraktioner af blågrønalgeprøver viste det sig, at der ikke var korrelation mellem forekomsten af microcystin-LR og toksicitet registreret med Microtox assayet (Campbell et al. 1994), og dette assay anses derfor som uegnet til påvisning af microcystin, men kan eventuelt benyttes til påvisning af andre bioaktive stoffer hos blågrønalger.

Artemia salina bioassay
Et biologisk assay, som benytter saltsørejen Artemia salina er beskrevet af Kiviranta et al. (1991b). I dette assay sættes forskellige koncentrationer af vandige ekstrakter fra frysetørrede blågrønalgeprøver til nyklækkede Artemia larver, og efter 24 timers inkubation relateres dødeligheden af larverne til algekoncentrationen. Der er fundet god overensstemmelse mellem prøver, som er fundet toksiske med dette assay og prøver, hvor microcystiner (Kiviranta et al. 1991b, Campbell et al. 1994, Damsø et al. 1994, Lawton et al. 1994a) eller anatoxin-a (Kiviranta et al. 1991b) er påvist med HPLC. Artemia bioassayet er meget simpelt og billigt at udføre, men kræver større mængder af algemateriale end f.eks. HPLC. Desuden er det uspecifikt, idet det ikke kan skelne mellem forskellige toksintyper.

Celle assay
Flere typer af celle assay er anvendt til detektion af algetoksiner. Aune & Berg (1986) beskrev et in vitro assay, hvor friskt isolerede rotteleverceller inkuberes med vandigt ekstrakt af frysetørrede blågrønalgeprøver for at screene for tilstedeværelsen af levertoksiner. Et in vitro assay, hvor lækage af intracellulære enzymer fra museleverceller benyttes til detektion af levertoksiner (mikrocystiner) er beskrevet af Bhattacharya et al. (1996).
Jellett et al. (1995) har udviklet en procedure, hvor neuroblaster bruges til detektion af PSP-toksiner.

1.4.2 ELISA og enzyminhiberingsassays

En række analysemetoder anvender mere eller mindre toksinspecifikke antibodies eller detekterer hæmning af bestemte enzymer.

Antibodies og ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Både mono og polyklonale antibodies mod microcystiner er blevet fremstillet i hhv. mus og kaniner (Kfir et al. 1986, Saito et al. 1994, Brooks & Codd 1988). Kfir et al. (1986) fremstillede monoklonale antibodies mod cyanoginosin-LA (= microcystin-LA), som viste sig at binde sig ligeså effektivt til seks andre varianter af microcystiner. Tilsvarende viste Saito et al. (1994) ved hjælp af ELISA, at monoklonale antibodies mod microcystin-LR reagerede med tre andre microcystiner samt med celleekstrakter af både toksiske og ikke toksiske Microcystis aeruginosa stammer. Undersøgelser af Brooks & Codd (1988) viste derimod, at polyklonale antibodies mod toksiner fra Microcystis aeruginosa ikke krydsreagerede med microcystiner fra Oscillatoria eller Anabaena.

Chu et al. (1989) fremstillede antibodies mod microcystin-LR, og detekterede disse med forskellige assays. Disse antibodies krydsreagerede med andre microcystiner og nodularin i forskellig grad (An & Carmichael 1994). Et ELISA til påvisning af microcystiner i alger og vand blev beskrevet af Chu et al. (1990). For microcystinLR var den nedre detektionsgrænse 0,2 µg pr. liter. Tilsvarende er der udviklet ELISA og EIA (enzyme immune assay) til påvisning af PSP-toksiner (Chu & Fan 1985, Usleber et al. 1991, Usleber et al. 1994).

ELISA er en hurtig og følsom metode til påvisning af microcystiner, men en række microcystinvarianter vil ikke blive detekteret på grund af manglende binding mellem de anvendte antibodies og toksinet (An & Carmichael 1994). Tilsvarende vil en række microcystiner reagere mindre end microcystin-LR med de anvendte antibodies, hvorved kvantificering af microcystinindholdet i algemateriale vil kunne være væsentligt forskellig ved anvendelsen af henholdsvis ELISA og HPLC (Henriksen & Moestrup 1997).

Proteinfosfatase inhiberingsassay
Toksiciteten af microcystiner kan tilskrives deres specifikke hæmning af de celleregulerende enzymer proteinfosfatase 1 og 2A (PP1 og PP2A) (Eriksson et al. 1990, MacKintosh et al. 1990). Denne egenskab udnyttes i proteinfosfatase inhiberingsassay, hvor in vitro hæmning af proteinfosfatase aktivitet benyttes til kvantificering af microcystiner (Boland et al. 1993, Holmes et al. 1994, Jones & Orr 1994, Lambert et al. 1994) samt okadainsyre (Holmes 1991, Boland et al. 1993), som tilsvarende hæmmer PP1 og PP2A. Okadainsyre er et diarréfremkaldende skaldyrstoksin, som er fundet hos nogle marine dinoflagellater.

Proteinfosfatase inhiberingen bestemmes ved at inkubere et 32P-mærket substrat (fosfoprotein), PP1/PP2A samt algeekstrakt i et givet tidsrum og bestemme frigivelsen af 32P ved scintillationstælling. Hæmningen af proteinfosfataserne bestemmes ved sammenligning med en kendt standard samt en kontrol (MacKintosh & MacKintosh 1994).

Holmes et al. (1994) angiver, at dette assay i kombination med en opkoncentrering af toksinerne vil kunne registrere microcystinkoncentrationer ned til 0,02 µg pr. liter.

An & Carmichael (1994) og Ward et al. (1997) beskrev proteinfosfatase inhiberingsassays baseret på en farveaktion, hvor proteinfosfataseaktiviteten blev bestemt udfra frigivelsen af pnitrophenol fra pnitrophenolfosfat. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at der ikke anvendes radioaktive isotoper.

Et af problemerne med dette assay er, at eventuel fosfataseaktivitet i algematerialet vil kunne skjule en hæmmende effekt forårsaget af microcystiner (Sim & Mudge 1993).

Acetylcholinesterase inhiberingsassay
Nervetoksinet anatoxin-a(s) virker ved at hæmme acetylcholinesterase. Ved at inkubere acetylcholinesterase med acetylthiocholin og dithiobisnitrobenzoat dannes et gult produkt, som kan registreres spektrofotometrisk. Tilsættes algeekstrakt med anatoksin-a(s) hæmmes reaktionen og dermed udviklingen af den gule farve (Ellman et al. 1961, Henriksen et al. 1997).

1.4.3 Kromatografi

Tyndtlagskromatografi
Tyndtlagskromatografi er blevet benyttet til at separere og identificere toksiske peptider (levertoksiner) fra blågrønalgeopblomstringer og kulturer (Codd et al. 1989, Poon et al. 1987, Ojanperä et al. 1995, Pelander et al. 1996). Denne metode har også vist sig anvendelig til isolering og oprensning af både peptid og alkaloid toksiner (hhv. lever- og nerve-toksiner) fra en kultur af Anabaena flosaquae, som producerede begge typer toksiner (Al-Layl et al. 1988).

Højtryksvæskekromatografi (HPLC)
HPLC er blevet benyttet til analyser af toksiner hos blågrønalger i en række undersøgelser. Analyserne er lavet på enten de intracellulære toksiner i tørret algemateriale eller toksiner i vand/kulturmedium. Analyseres tørret algemateriale, skal toksinerne først ekstraheres fra dette. Undersøges toksinindhold i vand vil toksinerne generelt skulle opkoncentreres inden analyserne.

Microcystiner
I tabel 1-9 er angivet en række eksempler på hvilke ekstraktionsmidler, opkoncentreringsmetoder samt HPLC-betingelser, der er blevet benyttet til analyser af microcystiner. Ved HPLC analyser af microcystiner i naturligt algemateriale eller søvand vil der være mulighed for at andre naturligt forekommende ikke toksiske stoffer elueres med samme retentionstid som standarderne. Derfor er det ikke tilstrækkeligt kun at basere analyserne på retentionstider og detektion ved en enkelt bølgelængde. Microcystiner har karakteristiske absorbtionsspektre med maksima ved 238 nm (eller 222 nm for enkelte tryptofan holdige derivater) (Lawton et al. 1994b), og analyserne bør derfor foretages med en Photo Diode Array (PDA) detektor, hvor absorbtionsspektrene i hele intervallet 200-300 nm registreres ved hver dataopsamling. Denne type detektion giver desuden mulighed for at analysere for microcystiner uden et stort udvalg af standarder (Lawton et al. 1994b). Af de over 50 beskrevne derivater findes der i dag kommercielt tilgængelige standarder af 4 microcystiner og 1 af nodularin.

Anatoxin-a
Detektion af anatoxin-a fra naturlige opblomstringer af blågrønalger (Edwards et al. 1992), blågrønalgekulturer (Harada et al. 1989, Rapala et al. 1993) og maveindholdet fra forgiftede hunde (Edwards et al. 1992) er udført ved hjælp af HPLC. Ekstraktion samt opkoncentrering af toksinet og HPLC betingelserne er angivet i tabel 1-10.

Som for microcystiner vil der også ved HPLC analyser for anatoxin-a være mulighed for eluering af ikke toksiske stoffer med samme retentiontid som standarden. Detektion med PDA detektor giver mulighed for sammenligning af standardens absorbtionsspektrum med spektre i mulige anatoxin-a toppe i de analyserede prøver (Edwards et al. 1992, Rapala et al. 1993), idet anatoxin-a har et karakteristisk absorbtionsmaksimum ved 227 nm (Devlin et al. 1977). Anatoxin-a standard er kommercielt tilgængelig.

Ved anvendelse af fluorescensdetektion er det muligt at sænke detektionsgrænsen for anatoxin-a til 10 ng pr. liter (James et al. 1998). Denne metode kan endvidere adskille anatoxina, homo-anatoxin-a samt flere nedbrydningsprodukter.

Tabel 1-9
HPLC-betingelser for microcystinanalyser angivet i fem forskellige undersøgelser.

Tabel 1-9

a) Metoden anvender en Photo Diode Array (PDA) detektor, hvor hele absorbtionsspektret fra 200 til 300 nm bruges til at bestemme microcystiner på baggrund af deres karakteristiske spektre.


Tabel 1-10
HPLC-betingelser for anatoxin-a analyser angivet i tre forskellige undersøgelser.

a) Kun i analyser af maveindholdet fra døde hunde blev toksinet opkoncentreret.
b) Metoden benytter en Photo Diode Array (PDA) detektor, hvor absorbtionsspektret i bølgelængdeintervallet 200-300 nm registreres og benyttes til genkendelse af toksinet.
c) Metoden benytter en PDA detektor. Toksinet identificeres ud fra retentionstid og absorbtionsspektrum. Kvantificering af toksinet blev foretaget ved 230 nm.


PSP-toksiner
Selv om musetest er den officielt accepterede metode til detektion af PSP-toksiner, bruges HPLC i stadig højere grad, også i overvågningsprogrammer. I modsætning til analyserne for microcystiner og anatoxiner, detekteres PSP-toksiner med en fluorescensdetektor, idet toksinerne oxideres til fluorescerende derivater. Larsen et al. (1993) beskriver 4 almindeligt brugte HPLC-procedurer, hvoraf 2 (Sullivan & Wekell 1984 og Oshima et al. 1989) er de mest anvendte i Europa. Oshimametoden (Oshima et al. 1989) har de laveste detektionsgrænser og kan detektere det højeste antal toksiner (tabel 1-11). Metoden er enklere end Sullivanmetoden (Sullivan & Wekell 1984, 1986, Sullivan 1990), idet der bruges et enkelt solvent (dvs. isokratisk eluering i modsætning til gradient eluering). Til gengæld kræver den 3 (mod 2) kørsler pr. prøve, fordi STX-toksinerne, GTX-toksiner og C-toksiner kræver hver sit solvent. Dette kan imidlertid afhjælpes ved at opbygge et system, der er i stand til automatisk at skifte mellem de 3 solventsystemer (Ravn et al. 1995). Da målet er at detektere så mange toksiner som muligt, er Oshimametoden at foretrække. Ravn et al. (1995) angiver en række forbedringer af Oshimametoden. I korte træk omfatter proceduren: ekstraktion af toksinerne, injektion i forkolonne, adskillelse af toksiner på kolonne, oxidation af toksiner til fluorescerende derivater i postkolonne, stop af oxidationsproces, detektion i fluorescensdetektor. Metoden er nærmere beskrevet i kapitel 5: Materialer og metoder.

Saxitoxin (STX), dc-saxitoxin (dc-STX), neosaxitoxin (neo-STX) og gonyautoxinerne GTX 1-6 kan i dag fås som kommercielle standarder. Enkelte laboratorier har udviklet deres egne C-toksinstandarder. Sammenlignet med den autoriserede musetest er detektionsgrænsen for HPLC-analyserne lavest -10-30 µg pr. 100 g muslingekød mod 40 µg pr. 100 g muslingekød.

Tabel 1-11
Detekterbare toksiner og detektionsgrænser for PSP-toksiner bestemt med henholdsvis Oshimametoden og Sullivanmetoden.

* Metoden er nu udviklet, så den også kan detektere C3 og C4, men detektionsgrænserne er
ikke angivet (Sullivan 1990).

Sammenfatning
Ud over direkte kemisk detektion findes der i dag en række mere eller mindre specifikke assays til detektion af blågrønalgetoksiner. Musetesten har den fordel, at den giver et akkumuleret udtryk for en bade/drikkevandsprøves totale toksicitet testet på et pattedyr. Et problem ved musetesten er, at der skal bruges levende forsøgsdyr, hvilket gør metoden dyr og langsommelig. Desuden får flere og flere lande en lovgivning, der forbyder eller begrænser muligheden for brug af forsøgsdyr. Er der tale om PSP-toksiner, kan musetesten overvurdere toksiciteten. Artemia testen er et andet uspecifikt bioassay, men foreløbig er pålideligheden af denne test ikke verificeret nok, til at den kan bruges som rutinemetode.

Ud over musetest er HPLC, proteinfosfataseassay og ELISA de mest anvendte. Det er hurtige metoder til screening for algetoksiner. Proteinfosfataseassay kan detektere microcystiner, nodularin og okadainsyre, mens der er beskrevet antibody/ ELISA-procedurer til både microcystiner og PSP-toksiner. Et generelt problem med denne type tests er, at der optræder falskpositive og falsknegative reaktioner, dvs. tilfælde hvor assay indikerer toksiner uden, at dette kan verificeres med de kvalitative kemiske analyser og vice versa. Det kan derfor ikke anbefales at bruge disse metoder enkeltstående.

HPLC er i dag den accepterede metode til kemisk analyse af blågrønalgetoksiner. HPLC giver et præcist overblik over de tilstedeværende toksiner. Fordelen ved HPLC-analyser er, at de, når rutinerne er indkørt og udstyr indkøbt, er hurtigere og billigere end musetest. På baggrund af et præcist kendskab til toksinsammensætningen forbedres muligheden for at forudse, hvilke effekter der kan forventes, og hvordan toksiciteten vil udvikle sig. Detektionsgrænserne er lavere end for musetesten. Problemer med HPLC er, at alle toksiner ikke kan bestemmes med den samme procedure (dvs. screening kræver en række kørsler), og at kun toksiner med tilgængelige standarder kan detekteres. Der er derfor risiko for, at metoden ikke giver et billede af prøvens totale toksicitet.

2. Toksiske blågrønalger i danske søer

2.1 Screening for toksicitet og toksiner

Algeprøverne blev indsamlet med planktonet (maskevidde = 20 µm), frysetørret og opbevaret i fryser, indtil toksiciteten blev testet med musetest og HPLC analyser for microcystiner, anatoxin-a og PSP-toksiner. Resultaterne er samlet i bilag 2-1, 2-2 og 2-3, som giver nærmere oplysninger om søer, datoer, toksicitet og artssammensætning.

I 89 ud af de 96 undersøgte søer blev der observeret toksisk respons ved musetest og/eller HPLC-analyser (svarende til 93% af prøverne). Det toksiske respons skyldes i langt de fleste tilfælde lever-toksiner. I 65% af de 102 algeprøver blev der observeret lever-toksicitet ved musetest og/eller HPLC, mens der kun var nerve-toksisk og protracted respons i henholdsvis 14 og 21,5% af prøverne. I 13 prøver blev der observeret flere toksintyper i samme prøve. 13 prøver var ikke toksiske (mus overlevede >24 timer, og toksiner kunne ikke påvises med HPLC). Mønsteret var ens for Jylland, Fyn og Sjælland (tabel 2-1).

Tabel 2-1
Toksicitet af blågrønalgeprøver fra Jylland, Fyn og Sjælland bestemt ved musetest og HPLC analyse for microcystiner. Flere nervetoksiske prøver indeholdt desuden microcystiner og er derfor både medregnet som lever- og nerve-toksiske.

a) Prøver med indhold af microcystin påvist vha. HPLC er medregnet som levertoksiske uafhængigt af udfaldet af musetesten.
b) Prøver med nervetoksisk respons i musetest og/eller HPLC-analyse.


Nervetoksicitet
Nervetoksicitet blev ved musetest påvist i 12 prøver (11 søer). Nervetoksinet anatoxin-a blev ikke fundet i nogen prøver. PSP-toksiner blev konstateret ved HPLC-analyser i 11 prøver (11 søer), hvoraf 8 prøver gav et tilsvarende nervetoksisk respons ved musetesten. I 3 prøver (Knud Sø 28. juli, Ravn Sø 6. juli og Salten Langsø 27. juli), som gav nervetoksisk respons i musetesten, kunne hverken anatoxin-a eller PSP-toksiner påvises. I musetesten fik de lavest doserede mus en smule spyt omkring munden, hvilket indikerer tilstedeværelsen af anatoxin-a(s) eller et lignende cholinesterase-hæmmende toksin. Dette blev efterfølgende bekræftet ved påvisning af in vitro hæmning af acetylcholinesterase (Henriksen et al. 1997).

Protracted toksicitet blev ved musetest fundet i 22 prøver. I 5 af disse kunne lave koncentrationer af microcystiner påvises vha. HPLC. Hvad der forårsager denne type toksicitet vides ikke.

Microcystin
Kvantificering af microcystinindholdet i algeprøverne viste, at 53 ud af i alt 66 prøver, hvor der kunne påvises microcystiner, indeholdt under 500 µg toksin pr. g algetørvægt (figur 2-1). Kun i 4 søer (Bryrup Langsø 27. juli, Torup Sø 27. juli, Halle Sø 27. juli og Sankt Jørgen Sø (syd) 21. juni) indeholdt algematerialet microcystinkoncentrationer højere end 1 mg toksin (pr. g tørvægt). Den højeste toksinkoncentration (1695 µg pr. g) blev fundet i Halle Sø den 27. juli.

Microcystinkoncentrationerne i de danske prøver svarer til koncentrationer fundet i japanske blågrønalgeopblomstringer (Watanabe et al. 1989a, Park et al. 1993, Watanabe et al. 1994), mens betydeligt højere koncentrationer er fundet i opblomstringer af Microcystis i f.eks Norge (ca. 4 mg pr. g, Berg et al. 1987a) og Kina (op til 7,28 mg pr. g, Zhang et al. 1991).


Figur 2-1
Microcystinindholdet i prøver, hvor microcystiner kunne påvises med HPLC i 1994. Intervalbredde = 100 µg pr. g.


PSP-toksiner
Koncentrationen af PSP-toksiner varierede fra 4 til 160 µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof) (figur 2-2), hvilket svarer til niveauerne fundet i Lyngbya wollei (Carmichael et al. 1997) og i opblomstringer og kulturer af Anabaena circinalis (Humpage et al. 1994). I Lyngbya wollei varierede koncentrationen fra 0-58 µg STX-ækvivalenter pr. g tørstof. Undersøgelser af den PSP-producerende Anabaena circinalis i Australien gav koncentrationer på 14,7 til 568,6 µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof) med de fleste værdier liggende over 150 µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof) (Humpage et al. 1994). Sammenlignet hermed var koncentrationen i de danske søer generelt lav: 9 ud af 11 søer indeholdt < 40 µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof), og gennemsnitskoncentrationen for disse 9 søer var 17 µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof). Kun i Hvidsø (Sjælland) og Vissinggård Sø (Jylland) (figur 2-3) blev der målt koncentrationer over 100 µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof). Forekomsten af PSP-toksiner i Hvidsø blev også undersøgt 22. juni, 14 dage før den høje værdi blev målt, og på denne dag var koncentrationen 59 µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof).




Figur 2-2
Koncentrationen af PSP-toksiner (angivet som µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof) i de søer, hvor der blev fundet nervetoksiner ved HPLC-analyse. Indsamlingsdatoerne fremgår af bilag 2-1 til 2-3.




Figur 2-3
HPLC-analyser for saxitoxiner (STX, neo-STX, dc-STX) i Vissinggård Sø (27.7.94). Standarderne er vist i øverste diagram og kørslen af prøven i nederste.


Saxitoxin (STX) var det dominerende PSP-toksin i søerne med over 10 µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof) (figur 2-4). Gonyautoxin IV (GTX4) var det næst almindeligste toksin, og dette toksin dominerede i søprøverne med < 10 µg STX-ækvivalenter (pr. g tørstof). STX og GTX3 er de mest toksiske PSP-toksiner, mens toksiciteten af GTX4 er 1/3 af STX.

Overensstemmelsen mellem musetest og HPLC-analyse var generelt god. For 8 ud af de 11 prøver, hvori der blev konstateret PSP-toksiner med HPLC, indikerede musetesten også tilstedeværelse af nervetoksiner. De 3 søer, for hvilke musetesten ikke påviste nervetoksiner, var Bastrup Sø, Maglesø v. Bromme og Hesselager Gadekær. I Bastrup Sø var PSP-indholdet meget lavt. I Maglesø indikerede musetesten tilstedeværelse af lever-toksiner, og HPLC viste et relativt højt indhold af microcystiner. I prøven fra Hesselager Gadekær blev der ikke fundet levertoksiner, og musetesten gav et "protracted" respons. For både Hesselager Gadekær og Maglesø var der kun algemateriale til at injicere 1 mus med 1 koncentration af toksin, og resultatet af musetesten er derfor usikker. Ifølge den autoriserede musetest bør der injiceres 3 mus (AOAC 1984).

2.2 Artssammensætning

Artssammensætningen af blågrønalgerne i prøverne fremgår af bilag 2-1, 2-2 og 2-3. I de levertoksiske algeprøver, hvor biomassen var domineret af en enkelt/enkelte art-(er), var de hyppigst dominerende arter Microcystis aeruginosa, M. botrys, M. wesenbergii, Planktothrix agardhii, Anabaena cf. flosaquae og Aphanizomenon flosaquae var. klebahnii (figur 2-5). I de nerve-toksiske prøver, som var domineret af en enkelt/enkelte art(er), var den vigtigste art Anabaena lemmermannii, idet den dominerede i 5 af i alt 12 nervetoksiske prøver (figur 2-6).

Figur 2-4
Den relative betydning af de 8 PSP-toksiner, der blev analyseret for ved screeningen for blågrønalgetoksiner i danske søer. Procentfordelingen angiver µmol toksin pr. g tørvægt.

Figur 2-5
Dominerende arter i levertoksiske prøver, hvor biomassen var domineret af enkelte arter. For hver art er angivet, i hvor mange prøver den var dominerende/blandt de dominerende arter.


De 12 hyppigste arters forekomst i samtlige prøver er illustreret i figur 2-7. De hyppigst forekommende var fire Microcystis arter, M. aeruginosa, M. botrys, M. wesenbergii og M. viridis, samt Aphanizomenon flosaquae var. klebahnii.

Figur 2-6
Dominerende arter i nervetoksiske prøver, hvor biomassen var domineret af enkelte arter. For hver art er angivet, i hvor mange prøver den var dominerende/blandt de dominerende arter.

Figur 2-7
Forekomst af de 12 hyppigste arter i samtlige prøver. For hver art er angivet, hvor mange prøver den totalt forekom i samt antallet af lever- og nervetoksiske prøver, hvor den var til stede.

Udover at være hyppigt forekommende var det karakteristisk for de fire Microcystis arter, at en meget stor del (79-94%) af de prøver, hvor arterne var tilstede, var toksiske (figur 2-8).


Figur 2-8
Toksiciteten af prøver i hvilke de 12 hyppigste arter forekom. For hver art er angivet, hvor stor en procentdel af de prøver, den forekom i, der var lever- eller nervetoksiske.

Den mest bemærkelsesværdige sammenhæng mellem forekomst af en art og toksicitet af prøverne fandtes for Anabaena lemmermannii (figur 2-8). Samtlige 15 prøver, hvor denne art var til stede, var enten nerve- eller levertoksiske.

2.3 Variabilitet

Screeningsundersøgelsen havde ikke til formål at undersøge den rumlige og tidslige variabilitet i toksiciteten, men 4 søer blev besøgt flere gange, og resultaterne herfra illustrerer, at toksiciteten hurtigt kan ændre sig (tabel 2-2). Observationerne illustrerer også, at toksiciteten i søer inden for samme søsystem kan variere (tabel 2-2). Rumlig (i meter-skala) og tidsmæssig (i dag-skala) variation i blågrønalgetoksiciteten er velkendt, og det er vigtigt at tage højde for dette ved planlægning af overvågnings-programmer.

For at undersøge den tidsmæssige variation i toksicitet og forekomst af blågrønalger blev der gennem sommeren 1995 indsamlet prøver fra 2 badevandssøer: Bryrup Langsø og Ravn Sø. Søerne blev udvalgt som repræsentanter for henholdsvis levertoksiske og nervetoksiske badevandssøer. I Bryrup Langsø er der tidligere påvist høje koncentrationer af levertoksiner (bilag 2-1). I Ravn Sø blev der i begyndelsen af 1994 ved musetest påvist kraftig nervetoksisk effekt (bilag 2-1) i forbindelse med en opblomstring af Anabaena lemmermannii. Begge søer indgår i Århus Amts overvågningsprogram, og Århus Amt har stået for indsamlingen af prøver.

Tabel 2-2
Spatial og temporal variation i toksiciteten. Variation observeret i musetest og/eller HPLC analyser af prøver fra screeningsundersøgelser 1994.

Bryrup Langsø 1995
I Bryrup Langsø blev prøver indsamlet i perioden fra den 18. maj til den 23. august. Fytoplanktonbiomassen (udtrykt som algevolumen pr. liter) varierede imellem de forskellige prøvetagninger (figur 2-9), og den højeste biomasse (7,57 mm³ pr. liter) blev fundet den 23. august.

Figur 2-9
Fytoplankton i Bryrup Langsø, sommeren 1995. Den total fytoplanktonbiomasse samt blågrønalgebiomassen er vist. Desuden er vist artssammensætningen af blågrønalgerne udtrykt som procent af den samlede blågrønalgebiomasse.


Blågrønalgebiomassen steg igennem hele perioden og nåede 3,47 mm³ pr. liter, svarende til 45,8% af den totale biomasse den 23. august. De kvantitativt vigtigste blågrønalgearter var i hele perioden Microcystis aeruginosa og Woronichinia naegeliana, som udgjorde hhv. 29,8 - 51,4% og 18,4 - 70,3% af blågrønalgebiomassen. Anabaena spiroides udgjorde den 27. juli 35,4% af blågrønalgerne.

Den 18. maj var biomassen så lav, at blågrønalgerne ikke blev kvantificeret. I en netprøve fandtes dog Woronichinia naegeliana, Microcystis aeruginosa og M. viridis.

Musetest med algemateriale fra Bryrup Langsø viste tilstedeværelsen af lever-toksiner den 27. juli samt den 9. og 23. august. Dette blev bekræftet ved HPLC-analyser for microcystiner. Figur 2-10 viser et kromatogram for materiale indsamlet den 23. august, hvor der kunne påvises otte forskellige microcystiner. Koncentrationen af microcystiner stiger gennem sommeren svarende til den stigende blågrønalgebiomasse og er ved sidste prøvetagning den 23. august 737 µg (pr. g tørstof).

Figur 2-10
Kromatogram fra microcystin-analyse af algemateriale fra Bryrup Langsø den 23. august 1995. De otte toppe med angivne retentionstider kunne identificeres som microcystiner på baggrund af deres absorptionsspektre (ikke vist). Analysen blev foretaget på en Waters Symmetry C18 kolonne med mobil fase af acetonitril og 0,01 M ammoniumacetat (pH 5,0).


Algematerialet fra den 18. maj samt den 12. juli havde ikke toksisk effekt ved de anvendte doser i musetesten (max. 50 mg pr. mus), men lave koncentrationer af microcystiner (hhv. 11 og 23 µg pr. g) kunne påvises ved hjælp af HPLC (figur 2-11). Disse koncentrationer svarer til, at mus (vægt ca. 20 g) doseret med den maksimale algekoncentration, har fået injiceret 27,5-57,5 µg microcystin pr. kg kropsvægt. LD50 (i mus) for de mest toksiske microcystiner (f.eks. microcystin-LR) er 50 µg pr. kg, hvorimod en række af de øvrige microcystiner har LD50 værdier > 250 µg pr. kg (Rinehart et al. 1994). Dette kan forklare de tilsyneladende modstridende resultater af musetest og HPLC-analyser.

I samtlige prøver, hvor der fandtes levertoksiner, var varianten [Dha7]microcystin-RR det kvantitativt vigtigste toksin, dernæst [Dha7]microcystin-LR. Det var karakteristisk, at de i litteraturen hyppigst omtalte microcystiner (LR, RR og YR) kun blev fundet den 23. august (RR og YR) og den 9. samt den 23. august (LR), og her udgjorde hvert af disse toksiner mindre end 10% af det samlede microcystinindhold (figur 2-11). Fundet af stadig flere forskellige microcystin varianter i takt med stadig stigende samlet microcystinindhold i prøverne kan skyldes ændret toksinproduktion i algepopulationen (som følge af ændrede fysisk-kemiske parametre eller ændring i arts-/stammesammensætningen) eller afspejle detektionsgrænsen for toksinerne (3,5-5 µg pr. g) ved den pågældende analysemetode.

Figur 2-11
Microcystiner i algeprøver fra Bryrup Langsø 1995. a: det totale toksinindhold udtrykt som µg microcystin pr. g alge (tørvægt). Søjlerne repræsenterer gennemsnit af to analyser og desuden er angivet min. og max. af disse analyser. b: retentionstider for de forskellige microcystiner detekteret i prøverne samt for syv microcystin standarder. Markeringen af de enkelte microcystiner angiver desuden, hvor stor en procentdel det pågældende toksin udgjorde af det samlede microcystinindhold.


Det er nærliggende at antage, at forekomsten af microcystiner i Bryrup Langsø kan tilskrives Microcystis aeruginosa, idet denne art var til stede i samtlige toksiske prøver og generelt udgjorde en væsentlig del af blågrønalgebiomassen. Desuden er det den hyppigst rapporterede toksinproducerende blågrønalge. Woronichinia naegeliana fandtes også i alle toksiske prøver, men der er ikke påvist microcystiner hos denne art.

Ravn Sø 1995
I Ravn Sø blev prøvetagningerne foretaget i perioden 8. juni til 16. august. Blågrønalgebiomassen var på intet tidspunkt høj og udgjorde altid en lille del af den totale algebiomasse. Fytoplanktonbiomassen steg indtil et maksimum på 7,33 mm³ pr. liter den 19. juli (figur 2-12). Her var blågrønalge-biomassen 0,94 mm³ pr. liter svarende til 12,8% af den totale fytoplanktonbiomasse.

Den målte blågrønalgebiomasse bestod i hele perioden af 1-3 af følgende arter: Woronichinia naegeliana, Anabaena lemmermannii og Aphanizomenon flosaquae. A. lemmermannii var den dominerende art i perioden fra den 4. juli til den 3. august, og den udgjorde op til 84% af blågrønalgerne (den 19. juli). Samme dag udgjorde dinoflagellaten Ceratium hirundinella 58% af den totale biomasse (data ikke vist).

Figur 2-12
Fytoplankton i Ravn Sø, sommeren 1995. Den total fytoplanktonbiomasse samt blågrønalgebiomassen er vist. Desuden er vist artssammensætningen af blågrønalgerne udtrykt som procent af den samlede blågrønalgebiomasse.


Anabaena lemmermannii er tidligere vist at være nervetoksisk i Ravn Sø (bilag 2-1), og prøver, hvori denne art fandtes i undersøgelsen af danske søer i 1994, var alle toksiske. Selvom denne art var den dominerende blågrønalge ved flere af indsamlingerne i Ravn Sø i 1995, kunne der hverken påvises toksiner (HPLC) eller toksicitet (musetest) i nogen af prøverne.

Ravn Sø har via Knud Å afløb til Knud Sø, hvor der både i 1993 og 1994 er vist et tilsvarende kraftigt nervetoksisk respons ved musetest som i Ravn Sø i 1994. Siden 1981 har der været gentagne rapporter om døde fugle, hunde og fisk i forbindelse med opblomstringer af Anabaena flosaquae/ lemmermannii i Knud Sø (tabel 2-3). Ved screenings-undersøgelsen i 1994 kunne der hverken påvises anatoxin-a eller PSP-toksiner i Ravn Sø eller Knud Sø selvom musetesten indikerede tilstedeværelse af nervetoksiner. Ligeledes kunne ingen af disse toksiner påvises i 2 algeprøver indsamlet fra Knud Sø i 1995. Symptomer ved musetest af Anabaena materiale fra Knud Sø i 1994 og 1995 samt efterfølgende analyser viste, at toksiciteten i stedet skyldtes nervetoksinet anatoxin-a(s), der indtil da kun var fundet i Nordamerika/Canada (se kapitel 1).

Tabel 2-3
Registreringer af døde dyr fundet ved Knud Sø, Århus Amt, i forbindelse med blågrønalgeopblomstringer. Data fra journaler fra Århus Amt.

Prøven fra Knud Sø indsamlet den 10. juli 1995 var helt domineret af dinoflagellater (Ceratium), men indeholdt også kolonier af Anabaena lemmermannii (figur 2-13). Denne prøve var ikke toksisk i musetest, hvorimod prøven indsamlet et andet sted i søen (ved Sdr. Ege) den 13. juli gav et typisk nerve-toksisk respons i musetesten. Denne prøve var helt domineret af A. lemmermannii. Det var karakteristisk, at de højest doserede mus i musetesten havde en anelse spyt omkring munden, mens mus, som fik injiceret lavere doser, fik tydeligt spyt omkring munden og tårer i øjnene (figur 2-14), hvilket er en typisk reaktion på anatoxin-a(s). Mus doseret med mindre end 2,5 mg algemateriale overlevede uden disse symptomer.

Figur 2-13
Anabaena lemmermannii fra Knud Sø.

Figur 2-14
Resultater af musetest på Anabaena lemmermannii domineret algeprøve indsamlet ved Sdr. Ege, Knud Sø, den 13. juli 1995. Overlevelsen og symptomer hos musene efter injektion af algemateriale er vist for injektion af forskellige mængder algemateriale.


Af figur 2-14 kan estimeres en LD50 værdi på ca. 2,5 mg pr. mus for Anabaena materialet indsamlet ved Sdr. Ege den 13. juli. Til sammenligning viser figur 2-15 tilsvarende musetest udført på materiale indsamlet i Knud Sø under en Anabaena opblomstring den 28. juni 1994. Her kan LD50 estimeres til ca. 0,05 mg pr. mus, svarende til at toksinkoncentrationen i dette algemateriale var 50 gange højere end i prøven indsamlet ved Sdr. Ege i 1995.

Figur 2-15
Resultater af musetest på Anabaena lemmermannii domineret algeprøve indsamlet i Knud Sø den 28. juni 1994. Overlevelsen og symptomer hos musene efter injektion af algemateriale er vist for injektion af forskellige mængder algemateriale.

En række fysiske/kemiske parametre som lysintensitet (van der Westhuizen & Eloff 1985, Watanabe & Oishi 1985, Sivonen 1990b, Utkilen & Gjølme 1992), temperatur (van der Westhuizen & Eloff 1985, Watanabe & Oishi 1985, Wicks & Thiel 1990), pH (van der Westhuizen & Eloff 1983, Wicks & Thiel 1990) og næringssaltkoncentrationer (Watanabe & Oishi 1985, Sivonen 1990b) vides at kunne påvirke toksinproduktionen hos blågrønalger. Det er på baggrund af det meget begrænsede materiale fra Knud Sø ikke muligt at vurdere, hvad der er årsagen til de meget store forskelle i toksicitet på materialet fra hhv. 1994 og 1995.

3. Undersøgelse af toksiske blågrønalger i drikkevandsreservoirer og vandværker

1) Søren Lind, Københavns Vandforsyning, pers. comm.
2) Jørgen Beck, Gentofte Vandforsyning, pers. comm.


Formålet med undersøgelsen var at vurdere, om toksiske blågrønalger er en risikofaktor for vandforsyningen. Prøver til analyse for forekomst af blågrønalger og blågrønalgetoksiner blev indsamlet fra Sjælsø, Sjælsø Vandværk og Regnemark Vandværk i sommeren 1995, og fra Haraldsted Sø og Gyrstinge Sø i perioden juni 1994 til oktober 1995. Der blev undersøgt for blågrønalgetoksiner bundet i algerne såvel som opløst i vandet. Toksinanalyserne omfattede anatoxin-a og microcystiner. Se tabel 3-2 og 3-3.

Tabel 3-2
Oversigt over hvilke prøver, der er analyseret for anatoxin-a og microcystiner.

Undersøgelsen viser, at der er store forekomster af blågrønalger indeholdende blågrønalgetoksiner i de 3 søer, der bruges til indvinding af drikkevand. Der er derfor risiko for forekomst af algetoksiner i det vand, der kommer ind på vandværkerne. Eksperimenter med et pilotanlæg viste, at Sjælsø Vandværks renseproces er i stand til at fjerne selv høje koncentrationer af microcystiner. Udenlandske undersøgelser indikerer, at Regnemark Vandværk ligeledes er effektivt. Det bør imidlertid vurderes, om der skal indføres en systematisk kontrol af forekomst af blågrønalgetoksiner.


Tabel 3-3
Oversigt over hvilke steder i vandrensningsprocessen i de to vandværker, der blev indsamlet vand til analyser for anatoxin-a og microcystiner.

4. Generelle sammenhænge mellem blågrønalgers udbredelse og omgivelsesfaktorer

Figur 4-2
Sammenhængen mellem den procentvise fordeling af dominante planteplanktonklasser og A. Totalfosfor (TP). B. Totalkvælstof (TN). C. N/P-forholdet (TN/TP). Gennemsnit for sommerperioden (maj-september).

Figur 4-3
Sammenhængen mellem den procentvise fordeling af dominante planteplanktonklasser og A. pH. B. Vandtemperaturen. Gennemsnit for sommerperioden (maj-september).


Temperaturen har vist sig at have stor indflydelse på konkurrence om næringsstoffer mellem forskellige planteplanktontyper, f.eks. viste Tilman et al. (1982), at blågrønalgers konkurrenceevne øgedes ved højere temperaturer. Dette stemmer overens med resultaterne fra de danske søer, idet blågrønalgerne øger deres dominans med øget vandtemperaturen (figur 4-3b). En tilsvarende konklusion gav sammenligningen af situationen for hele sommeren med situationen i juli-august (Jeppesen et al. 1990). I juli-august blev der fundet en tilsvarende sammenhæng til totalfosfor som for hele sommeren (figur 4-2a), men med den forskel, at blågrønalgernes andel var større ved alle fosforniveauer.

Med hensyn til de uorganiske fraktioner (opløste) af henholdsvis fosfor og kvælstof er billedet lidt mindre klart. Dette skyldes bl.a., at dynamikken af disse fraktioner er stor. De opløste fraktioner kan optages i den partikulære fraktion, herefter frigøres igen eller ende i sedimentet, hvorfra det også kan frigives igen. Analyser af opløst fosfor viste således et mindre signifikant men samstemmende billede som for total fosfor med hensyn til planteplanktonsammensætningen.

En række blågrønalger er i stand til at fiksere atmosfærisk kvælstof, og nogle har endog specialiserede celler (heterocyter) til at udføre denne funktion. På trods af at denne proces er ret energikrævende, leder det naturligt til hypotesen, at disse blågrønalger (specielt slægterne Anabaena og Aphanizomenon i danske søer) især ville kunne dominere i søer med lave kvælstofkoncentrationer. Dette kan dog ikke eftervises på materialet fra de danske søer, idet dominans af disse typer blågrønalger ikke i højere grad er knyttet sammen med lave uorganiske kvælstofkoncentrationer end f.eks. dominansen af de øvrige blågrønalger eller grønalger (figur 4-4).

Figur 4-4
Den akkumulerede procentvise fordeling af dominans af kvælstoffikserende blågrønalger, ikke kvælstoffikserende blågrønalger og grønalger i forhold til koncentrationen af uorganisk kvælstof.


Jensen et al. (1994) videreførte analyserne, men kom dog frem til samme konklusioner, som ovenfor beskrevet, nemlig at totalfosfor er den faktor, som bedst forklarer skiftet i dominansforholdene af planteplankton i lavvandede danske søer. Denne konklusion er sammenfaldende med den, Olrik (1978) fandt ved analyse af data fra 15 danske søer og også med en række udenlandske undersøgelser, specielt hvad gælder den øgede dominans af blågrønalger ved øgede totalfosforkoncentrationer i søer (Reynolds 1984; Smith 1986; Pick & Lean 1987; Reynolds 1987; Smith et al. 1987; Trimbee & Prepas,1987; Sas 1989; Schreurs 1992). Jensen et al. (1994) beskrev derudover modeller for bl.a. blågrønalgers dominans ved forskellige totalfosforkoncentrationer og sammenlignede dem med andre publicerede sammenhænge (figur 4-5).

Figur 4-5
Sammenligning af en række modeller for planteplanktonsdominans i forhold til totalfosfor. Blågrønalger: Eq. 1., Seip (1988) og Trimbee & Prepas (1987). Blågrønalger med heterocyter: Eq. 3. Grønalger: Eq. 5. Eq. 1, 3 & 5 er fra Jensen et al. (1994).


Sammenligningen af den danske model for dominans af blågrønalger med den norske Seip (1988) og den canadiske Trimbee & Prepas (1987) viste en stor forskel. Dels begyndte dominansen af blågrønalger senere i danske søer og dels forsvandt dominansen af blågrønalger ved de højeste totalfosforkoncentrationer i danske søer. Forskellene blev henført til forskellige dybdeforhold i de undersøgte søer. I de ikke-lagdelte danske søer vil der i højere grad end i dybe søer til stadighed være en regenerering af fosfor fra sedimentet, hvilket kan favorisere planteplanktontyper med en hurtigere væksthastighed end blågrønalger. Samtidigt er disse lavvandede søer mere vindpåvirkede, hvorfor blågrønalgernes specielle evne til at modstå sedimentation ved dannelse af vakuoler, ikke favoriserer dem så meget, idet vandmasserne er mere turbulente. Sas (1989) har tidligere for en række europæiske søer vist, at dybe og lavvandede søer har et forskellig respons med hensyn til dominans af blågrønalger (figur 4-6). I dybe lagdelte søer begynder blågrønalgedominansen ved ca. 0,01 mg P pr. liter og i lavvandede ikke-lagdelte søer ved ca. 0,1 mg P pr. liter (faktisk antydede disse resultater også, at i lavvandede søer aftager dominansen af blågrønalger igen ved de højeste totalfosforkoncentrationer, men dette var dog stort set kun baseret på resultaterne fra den danske sø Søbygård Sø).

Figur 4-6
Sammenhængen mellem den relative biomasse af blågrønalger og den gennemsnitlige totalfosforkoncentration i en række europæiske søer. Sommergennemsnit på nær Fuschl søen. Efter Sas (1989); linierne er ikke originale.

Figur 4-7
Den relative biomasse af blågrønalger i forhold totalfosfor koncentrationen og middeldybden i de 37 danske overvågningssøer. Sommergennemsnit. Efter Windolf et al. (1993).


Windolf et al. (1993) fandt tilsvarende forskelle mellem dybe og lavvandede søer ved analyser af resultater fra de 37 danske søer, der indgår i Vandmiljøplanens overvågningsprogram (figur 4-7). Der var samtidig en tendens til en glidende overgang mellem de helt lavvandede og de dybe søer, men datamaterialet var ikke stort nok til en egentlig analyse af dette.

Figur 4-8
Den relative biomasse (%) af blågrønalger i forhold til totalfosfor (mg P pr. liter) og middeldybde (m). Baseret på regressionsmodel for sommerperioden.


I forbindelse med nærværende projekt er datamaterialet blevet stort nok til, at en egentlig analyse har kunnet gennemføres. Resultaterne bekræftede hypotesen, at i de dybe søer starter dominansen af blågrønalger ved lavere totalfosforkoncentrationer, og at i de lavvandede søer bliver dominansen af blågrønalger mindre markant end i de dybe søer ved de samme totalfosforkoncentrationer og endelig, at blågrønalgedominansen brydes i de lavvandede søer ved de højeste fosforniveauer (figur 4-8). Det nuværende datamateriale viser desuden glidende overgange med hensyn til blågrønalgedominansen både i forhold til dybdeforholdene og totalfosfor.

Der blev gennemført en CCA-analyse af sammenhængen mellem planteplanktonsammensætningen dels som absolut biomasse og dels som relativ biomasse (% af totalen) i forhold til de mulige forklarende variable. Analysen blev gennemført på en række udvalgte perioder (bl.a. år, sommer, juli-august), men her er kun vist resultaterne fra sommeren, da konklusionerne var sammenfaldende. Variablerne, der efter CCA-analysen og Monte Carlo test viste sig at bidrage signifikant til forklaringen af variationen i såvel den absolutte som relative planteplanktonsammensætning i søerne, var i prioriteret rækkefølge: totalfosforkoncentrationen, middeldybden, vandtemperaturen, uorganisk kvælstof, vindhastigheden og endelig dyreplanktonets græsningstryk. Tilsammen forklarede disse variable 41% og 44% af variationen i henholdsvis den absolutte og den relative planteplanktonsammensætning (tabel 4-1, figur 4-9).


Tabel 4-1
CCA-analyse af den absolutte (mm3 pr. liter) og relative (% af total biomasse) planteplanktonsammensætning og forklarende variable (alle sommergennemsnit). Signifikante (P < 0,05) variable medtaget. TP: totalfosfor (mg P pr. liter), Z: middeldybde (m), T: vandtemperatur (oC), IN: uorganisk kvælstof (mg N pr. liter), V: vindhastighed (m pr. sek.), G: dyreplanktons græsningstryk (%).

Med hensyn til blågrønalgerne fandtes en tilsvarende unimodal (med toppunkt) sammenhæng til totalfosfor som ved tidligere analyser, ligesom sammenhængen mellem blågrønalger og middeldybden generelt var positiv, svarende til en relativ højere blågrønalgedominans ved en højere middeldybde. Dog fandtes der ingen positiv sammenhæng til middeldybden ved analyse af blågrønalger med heterocyter alene, idet disse slægter (især Anabaena og Aphanizomenon) ved denne analyse ikke viste dominans i dybe søer sammenlignet med lavvandede. Modsat tidligere resultater viste analyserne en relativ svag, men dog signifikant positiv sammenhæng mellem lave uorganiske kvælstofkoncentrationer og dominansen af blågrønalger med heterocyter. Dette resultat kan tolkes således, at de udnytter deres evne til at fiksere kvælstof, men at det samtidigt ikke er den mest afgørende faktor for deres forekomst i danske søer.

Som ved tidligere analyser fandtes der også en tydelig positiv sammenhæng mellem vandtemperatur og dominans af blågrønalger. Mod forventning blev der derimod også fundet en positiv sammenhæng mellem vindhastigheden og dominansen af blågrønalger, således at i søer med en højere vindpåvirkning var der generelt en højere dominans end i søer med en lavere vindpåvirkning. Hvordan dette skal tolkes er usikkert, men det kunne eventuelt være et spørgsmål om vindinduceret resuspension af sedimentet, der dels frigiver fosfor til vandet og dels ændrer lysforholdene - begge dele kunne fremme dominansen. Men resultatet strider imod den generelle erfaring med øget blågrønalgedominans i varme og vindstille perioder.

Et øget græsningstryk virker negativt på dominansen af blågrønalger dog i mindre grad for de filamentdannende typer (især Anabaena og Aphanizomenon). Et resultat der i nogen grad strider mod tidligere undersøgelser, hvor det ofte blev hævdet, at blågrønalger var mere eller mindre resistente overfor dyreplanktonets græsning. Andre nyere undersøgelser (bl.a. af Gliwicz, Polen) tyder dog på, at et højt græsningstryk specielt i "opbygningsfasen" af en blågrønalgepopulation kan virke kraftig negativt på denne.

Figur 4-9
Joint Biplot af forklarende variable og den absolutte og relative planteplanktonsammensætning efter CCA-analyse for sommerperioden, jf. tabel 4-1. A. absolut biomasse (mm3 pr. liter) . B. Relativ biomasse (% af total biomasse). B1: blågrønalger, B2: rekylalger, B3: furealger, B5 gulalger, B8: kiselalger, B13: grønalger. lptot: totalfosfor, lmiddyb: middeldybde, tempv: vandtemperatur, luorgn: uorganisk kvælstof, meanvh: vindhastighed, graspro: græsningstryk.

Hovedkonklusionerne er, at:

- totalfosfor er en væsentlig faktor i forbindelse med planteplanktonsammensætningen i søer

- i lavvandede søer dominerer blågrønalger generelt ved totalfosforkoncentrationer mellem 0,1 og 0,5-1 mg P pr. liter

- i dybe søer dominerer blågrønalger planteplanktonet helt ned fra koncentrationer på omkring 0,01 mg P pr. liter, og deres dominans brydes ikke ved de højeste koncentrationer som i lavvandede søer

- overgangen mellem de ovennævnte forhold i lavvandede og dybe søer ser ud til at foregå gradvist, antageligt betinget af lagdelingen af vandmasserne

- vandtemperaturen er også en væsentlig faktor for blågrønalger; deres dominans fremmes tydeligt af højere vandtemperaturer

- effekterne af kvælstof er ikke entydige; det kan ikke afvises, at lave kvælstofkoncentrationer har en fremmende effekt på dominansen af visse typer blågrønalger, men samtidigt ser det ikke ud til at være en primær mekanisme

- effekten af vindforholdene er ikke entydige, men muligvis hænger dette sammen med for ringe geografisk opløsning af de tilrådighedværende vinddata

- dyreplanktonets græsningstryk ser også ud til at have en vis om end mindre effekt på blågrønalger. Således kan høje græsningstryk i en vis grad mindske blågrønalgernes dominans.

4.1 De potentielt giftige slægter og arters forekomst - autøkologiske beskrivelser

I det følgende afsnit gennemføres en analyse af de enkelte slægters forekomst. Dette foretages ud fra en forventning om, at der på trods af de generelle fællestræk, der kan påvises for overordnede blågrønalgegrupper i forhold til omgivelsesparametre, også findes artsspecifikke mønstre. Tilsvarende individuelle forskelle i forekomst udnyttes i dag eksempelvis indenfor palæolimnologien, hvor man ud fra forekomsten af forskellige kiselalgearter og slægter i sedimenter søger at rekonstruere tidligere tiders næringsstofniveau (totalfosfor) (se f.eks. Patrick & Anderson 1995). De tilhørende teknikker, specielt "weighting averaging", har også været anvendt mere generelt til at forbedre forståelsen af individuelle planteplanktonslægter og arters forekomst (Windolf et al. 1993).

Da en sådan analyse kræver et stort datagrundlag, blev der udvalgt en række potentielt giftige slægter, der ofte forekommer i danske søer, som udgangspunkt for analysen (tabel 5-4). Endvidere er der kun arbejdet med data, samt fra sommerperioden (maj-september) kun medtaget resultater, på slægtsniveau, da slægternes forekomst i det væsentlige var præget af en enkel eller to arters forekomst (jf. tabel 5-4). Slægternes forekomst er beskrevet i forhold til fosforkoncentrationen (total og opløst), kvælstofkoncentrationen (total og opløst) samt vandtemperaturen. Som reference for slægternes forekomst er medtaget resultaterne for alle slægter og arter fra DMU’s planteplanktondatabase i forhold til den givne parameter. Forekomsterne er givet som det vægtede gennemsnit ± spredningen i forhold til de givne parametre. De fuldstændige fordelinger findes i bilag 4-1.

Slægterne adskiller sig væsentligt med hensyn til udbredelsesmønster i forhold til totalfosfor (figur 4-10). Eksempelvis er Coelosphaerium’s forekomst lokaliseret ved betydeligt lavere totalfosforkoncentrationer end den, der er fundet for såvel de øvrige udvalgte blågrønalgeslægter som for referencen. Også slægten Aphanizomenon forekommer typisk ved noget lavere koncentrationer end de øvrige slægter. Anabaena og Microcystis forekomst er typisk ved de noget højere totalfosforkoncentrationer (middel 0,3 mg P pr. liter, range: 0,1-0,5). Slægterne Oscillatoria (inkl. Planktothrix) og Gomphosphaeria (inkl. Woronichinia) har en udbredelse, der strækker over hele totalfosfor spannet i søerne. For Oscillatoria’s vedkommende kunne det skyldes, at det drejer sig om flere arter med forskelligt optimum og spredning, mens dette synes derimod ikke at være tilfældet for Gomphosphaeria (jf. bilag 4-1).

Figur 4-10
Biomassevægtede gennemsnit (*) ± spredning (+) for udvalgte slægter i forhold til total fosforkoncentrationen for observationer af udvalgte blågrønalgeslægter for sommerperioden. Reference angiver resultater for alle slægter og arter fra DMU's database.


Billedet i forhold til opløst fosfat er stort set det samme som for totalfosfor (figur 4-11). Dog er der en tendens til, at Microcystis forekommer ved relativt højere opløst fosfor end totalfosforkoncentrationer end de øvrige slægter samt referencen; dette kan være et udtryk for, at denne slægt har en mindre sedimentationsrate end de øvrige slægter, hvorfor der kan opretholdes en højere koncentration af opløst fosfor i vandfasen ved kraftige biomasser af netop denne slægt.

Figur 4-11
Biomassevægtede gennemsnit (*) ± spredning (+) for udvalgte slægter i forhold til den opløste fosforkoncentration for observationer af udvalgte blågrønalgeslægter for sommerperioden. Reference angiver resultater for alle slægter og arter fra DMU's database.


Rækkefølgen af slægter i forhold til totalkvælstofkoncentrationen er noget anderledes end den var i forhold til fosfor (figur 4-12), dog findes Gomphosphaeria atter dels bredspektret og dels ved de højeste koncentrationer og Coelosphaerium forekommer atter ved de laveste koncentrationer. De to slægter Anabaena og Aphanizomenon, der ofte findes med heterocyster i danske søer, findes ikke udpræget under forhold med lave totalkvælstofkoncentrationer. Microcystis og Oscillatoria forekommer typisk ved de middelhøje koncentrationer.

Figur 4-12
Biomassevægtede gennemsnit (*) ± spredning (+) for udvalgte slægter i forhold til total kvælstofkoncentrationen for observationer af udvalgte blågrønalgeslægter for sommerperioden. Reference angiver resultater for alle slægter og arter fra DMU's database.


Modsat fosfor genfindes billedet fra totalfraktionen ikke ved den uorganiske fraktion af kvælstof (figur 4-13). Der er dog en høj grad af overlap af forekomsten i forhold til uorganisk kvælstof for slægterne, men Anabaena skiller sig noget ud ved generelt at forekomme kun ved de relativt lave koncentrationer af uorganisk kvælstof.

Figur 4-13
Biomassevægtede gennemsnit (*) ± spredning (+) for udvalgte slægter i forhold til den uorganiske kvælstofkoncentration for observationer for sommerperioden. Reference angiver resultater for alle slægter og arter fra DMU's database.


Med hensyn til vandtemperaturen forekommer Coelosphaerium også ved de laveste niveauer (uden sammenligning i øvrigt). Gomphosphaeria afviger ikke markant fra referencen, mens de øvrige 4 slægter, specielt når den nedre grænse betragtes, forekommer ved højere vandtemperaturer. Mest markant skiller slægterne Oscillatoria og Aphanizomenon sig ud; disse to slægter har tydeligvis en præference for højere temperaturer end de øvrige.

Figur 4-14
Biomassevægtede gennemsnit (*) ± spredning (+) for udvalgte slægter i forhold til vandtemperaturen for observationer af udvalgte blågrønalgeslægter for sommerperioden. Reference angiver resultater for alle slægter og arter fra DMU's database.


Generelt er det tydeligt, at Coelosphaerium adskiller sig fra de andre analyserede slægter og i øvrigt blågrønalger i almindelighed, dels fordi slægten i modsætning til de andre typisk forekommer ved forholdsvis lave næringsstofkoncentrationer, og dels fordi slægten typisk forekommer ved relativt lave vandtemperaturer.

I forhold til de totale fraktioner af fosfor og kvælstof er Gomphosphaeria tilsyneladende ret indifferent med hensyn til niveauet. Om dette er reelt eller skyldes, at en anden faktor (f.eks. pH) overskygger næringsstofeffekterne er ikke analyseret. Oscillatoria er tilsvarende bredspektret i forhold til totalfosfor, men ikke i forhold til totalkvælstof. Resultaterne tyder på, at der i forhold til totalfosfor er tale om 2 arter med forskellig respons - en art med et lavt optimum og en art med et højt optimum.

Resultaterne for slægterne Anabaena, Aphanizomenon og Microcystis er i højere grad i overensstemmelse med de generelle konklusioner, der er fundet for blågrønalger. De forekommer typisk ved totalfosforkoncentrationer mellem 0,1 og 0,5 mg P pr. liter og ved noget højere vandtemperaturer end planteplankton generelt.

For slægterne Anabaena og Aphanizomenon, der ofte findes med heterocyter, har det ikke endeligt kunne afklares, om deres forekomst i større eller mindre grad hænger sammen med evnen til at kunne fiksere atmosfærisk kvælstof.

Resultaterne viser, at der er et klart potentiale i analyser af slægter og arters udbredelsesmønstre for at fremme forståelsen for, hvornår og hvorfor bl.a. potentielt giftige blågrønalger dominerer planteplanktonet i søer.

5. Materialer og metoder

5.1 Screening og badevandsundersøgelse

Til screening for blågrønalgetoksiner blev der i sommeren 1994 indsamlet 102 plankton-algeprøver fra 96 lokaliteter på Sjælland, Fyn og i Jylland. Lokaliteter og datoer fremgår af bilag 2-1, 2-2 og 2-3. Prøverne blev indsamlet med et 20 µm planktonnet. Til supplering af undersøgelserne for PSP-toksiner blev der i 1995 indsamlet yderligere kvalitative samt kvantitative prøver fra Agersø, Esrum Å, Søndersø og Bastrup Sø. Desuden blev der indsamlet supplerende kvalitative prøver til musetest fra 2 lokaliteter i Knud Sø henholdsvis den 10. og 13. juli.

Fra alle indsamlede prøver blev en lille delprøve fikseret i sur lugol, og senere brugt til bestemmelse af artssammensætningen ved lysmikroskopi.

Til beskrivelse af årstidsvariationen i toksinforekomst indsamledes 6 gange i 1995 net-prøver af planktonalger i Bryrup Langsø (ved Bryrup) og Ravn Sø (ved Ry). Parallelt med net-prøverne indsamledes kvantitative prøver til bestemmelse af artssammensætning. Prøverne blev udtaget og oparbejdet som beskrevet i Århus Amt (1992a, b).

Alle prøver til toksinanalyse blev ved hjemkomst frysetørret. Algematerialet i de kvantitative PSP-prøver blev først filtreret ned på GF/F-filtre og derefter frysetørret. Testen for toksicitet omfattede musetest (afsnit 5.6), og HPLC-analyser for microcystiner (afsnit 5.3), anatoxin-a (afsnit 5.4) og PSP-toksiner (afsnit 5.5).

5.2 Toksiner i drikkevand

Til undersøgelse af blågrønalgetoksiner i drikkevand blev der indsamlet prøver fra Regnemark og Sjælsø vandværker og fra de 3 søer, der bruges som drikkevandsreservoirer for vandværkerne (henholdsvis Haraldsted Sø, Gyrstinge Sø og Sjælsø). I Haraldsted Sø og Gyrstinge Sø indsamledes planktonprøver med et 20 µm net fra juni 1994 til oktober 1995. Fra Sjælsø indsamledes netprøver i sommeren 1995. Som for badevandssøerne blev artssammensætningen bestemt, og forekomsten af microcystiner og anatoxin-a blev analyseret (se afsnit 5.1, 5.3, 5.4).

Da toksiner kan lække fra algerne til søvandet, specielt i den afsluttende fase af en algeopblomstring, blev toksinforekomsten i vandet i søen samt efter hvert rensningstrin i vandværkerne analyseret. For hvert trin blev der indsamlet 10 l vand.

I Regnemark rensningsanlæg løber vandet først igennem en mikrositromle med maskevidder på 64 og 40 µm. Derefter renses vandet ved en flokkuleringsproces, der binder det organiske materiale, hvorefter det flokkulerede materiale bundfældes i et sedimentationsbassin. Det rensede vand steriliseres med klor (18 mg klor/l). Herefter fjernes kloret igen, og efter en række finfiltre og behandling med monokloraminer (MCA) sendes vandet ud til forbrugerne. Vand blev indsamlet i overfladen af søen, før mikrosien, efter mikrosien, efter sedimentation af det flokkulerede materiale samt fra det færdigbehandlede vand.

I Sjælsø Vandværk består rensningsprocessen af sandfiltrering, flokkulering, sedimentering og ozonbehandling efterfulgt af granulære biologisk aktive kulfiltre samt dosering med MCA. Vand blev indsamlet umiddelbart efter, det var kommet ind på vandværket, efter sedimentering, efter ozonbehandling og efter kulfiltrene.

Da toksinkoncentrationen i vandet normalt er meget lavere end i algerne, blev vandprøverne forbehandlet inden HPLC-analyse. Dette skete ved at filtrere vandet gennem GF/C-filtre (Whatman), så alt partikulært materiale blev fjernet, og herefter opkoncentrere eventuelle toksiner i vandet på Isolute C18-kolonner som beskrevet i tabel 5-1. Ved analyse for anatoxin-a blev pH hævet til 9,5-10 med NaOH før opkoncentrering på Isolute C-18-kolonner. Kolonnerne blev efter opkoncentreringen behandlet som beskrevet i afsnit 5.3 og 5.4. Til microcystin-analyserne blev der taget 3 x 2 l vand og til anatoxin-a-analyserne 3 x 1 l . GF/C-filtrene blev opbevaret ved -20^oC og senere analyseret for toksiner i det partikulære materiale.

På et pilotanlæg på Sjælsø Vandværk blev effektiviteten af vandrensningsprocessen under en simuleret blågrønalgeopblomstring undersøgt. 15 g frysetørret microcystin-holdigt algemateriale (7,5 g fra Bryrup Langsø og 7,5 g fra Birkerød Sø) blev blandet med 2 l vand og udsat for ultralyd (120W) i 30 min afbrudt af kraftig omrystning efter 15 min. Homogenatet fik lov at stå natten over i køleskab for at ekstrahere toksinerne fra cellerne, hvorefter det blev blandet op i 50 l søvand og sendt gennem pilotanlægget. Efter hvert trin i rensningsprocessen aftappedes 6 l vand, der blev GF/C-filteret. Filtrene blev behandlet som beskrevet ovenfor. Det GF/C-filtrerede vand (triplikate 2 l prøver) blev opkoncentreret, som beskrevet i tabel 5-1.

5.3 HPLC-analyser af microcystiner

Analyseudstyr og kemikalier
HPLC-analyser af microcystiner blev foretaget med følgende udstyr:

- Waters 600E pumpe
- Waters 717 plus autoinjector
- Waters 996 Photo Diode Array detector
- Waters Millennium 2.0 software til dataopsamling og -bearbejdning

Standarder af microcystin-LR og -YR stammede fra Calbiochem. Alle solventer var af HPLC-kvalitet og kemikalier af analytisk kvalitet. I alle tilfælde, hvor der blev benyttet vand (vandige buffere, ekstraktion osv.), var dette vand renset på Kinetico Reverse Osmosis Drinking Water System (model # 518), Kinetico, Newbury, USA.

Betingelserne ved analyse af microcystiner er angivet i tabel 5-1. GF/C-filtre fra drikkevands-undersøgelsen (se afsnit 5.2) blev ekstraheret tre gange i 20 ml methanol i 60 min. De 60 ml methanol blev fortyndet med vand til 300 ml og derefter opkoncentreret og analyseret som anført i tabel 5-1. Kvantificering af toksinerne skete på baggrund af arealerne af toksintoppene i kromatogrammer ved 239 nm. Kvantificeringen blev foretaget mod kalibreringskurver for microcystin-LR (ekstern standard).

Tabel 5-1
HPLC-betingelserne ved analyse af microcystiner.