| Indhold |

Miljøprojekt nr. XX, 2001

MTBE-nedbrydning i grundvand vha. alkanoxiderende mikroorganismer

Fase 1: Resultater og vurdering

Indholdsfortegnelse

Forord

Denne rapport skitserer de foreløbige resultater fra et samarbejdsprojekt mellem Dansk Miljørådgivning A/S og Afdeling for Miljøteknik, Aalborg Universitet. Projektet er udført under og finansieret af Miljøstyrelsens Teknologiudviklingsprogram for jord- og grundvandsforurening.

Rapporten er udarbejdet af Per Loll og Claus Larsen, Dansk Miljørådgivning A/S, samt Kaj Henriksen, Afdeling for Miljøteknik på Aalborg Universitet.

Rapporten er udarbejdet på baggrund af laboratorieundersøgelser udført af Rasmus Johansen, Laila Kleis Pedersen og Steingerður Gná Kristjánsdóttir, Afdeling for Miljøteknik på Aalborg Universitet.

Resumé

Formål

Formålet med dette projekt er, at undersøge om MTBE-forurenet grundvand, i forbindelse med afværgepumpninger, kan renses cost-effektivt i en on-site bioreaktor vha. alkanoxiderende mikroorganismer. Denne rapport skitserer resultaterne af en række batchforsøg, der har haft til formål at danne grundlag for en indledende vurdering af metodens tekniske potentiale.

MTBE-nedbrydende berigelseskulturer

Ud fra sphagnumholdig havejord har det været muligt at opformere tre forskellige berigelseskulturer af mikroorganismer med potentiale til cometabolisk nedbrydning af MTBE. Der er således konstateret MTBE-nedbrydning af kulturer beriget med hhv. propan, isobutan og isopentan. På trods af, at den isopentanberigede kultur umiddelbart udviste det største MTBE-nedbrydningspotentiale blev det, af håndteringsmæssige årsager, fravalgt at arbejde videre med denne kultur.

Nedbrydning af MTBE

Der er for de propan- og isobutanberigede kulturer observeret MTBE-nedbrydningsrater på hhv. 10,1 og 15,7 mg MTBE/(g protein·time). Der er indledende fundet halvmætningskonstanter, K_m, for MTBE-nedbrydning på ca. 130 – 150 mg MTBE/L.

Omsætning af substrat

For omsætningen af propan er der fundet en maksimal omsætningsrate, v_max, på 405 mg propan/(g protein·time) og en halvmætningskonstant, K_m, på 9 mg propan/L. For isobutan er der tilsvarende fundet v_max- og K_m-værdier på hhv. 289 mg isobutan/(g protein·time) og 3,5 mg isobutan/L.

Mikrobielle væksthastigheder

Der er fundet maksimale væksthastigheder, m_max, på ca. 0,5 til 1,2 d^-1. Disse væksthastigheder vurderes ikke at være tilstrækkelige til at sikre opretholdelse af biomassekoncentrationen i en given on-site reaktor og der bør etableres en enhed til tilbageholdelse af biomasse.

Overslagsmæssig dimensionering

Ved overslagsmæssig dimensionering af en optimeret bioreaktor med isobutanoxiderende mikroorganismer, kan der f.eks. ved 90% massefjernelse samt en hydraulisk belastning på 2 m³/time beregnes et nødvendigt reaktorvolumen på ca. 4,6 m³.

Potentiale for on-site rensning

Samlet vurderes det, at der forholdsvist simpelt kan fremelskes mikroorganismer med potentiale til nedbrydning af MTBE samt at være sandsynliggjort, at disse kulturer har potentiale til massefjernelse i forbindelse med on-site rensning af MTBE-forurenet grundvand i en bioreaktor.

Summary

Purpose

The purpose of this project is to investigate whether MTBE contaminated groundwater can be treated cost-effectively in on-site bioreactors containing alkane-oxidizing microorganisms. This report summarizes the results from a series of batch tests with the purpose of revealing the technical potential of the method.

enrichment cultures

Three different alkane-oxidizing enrichment cultures with potential for co-metabolic MTBE degradation were obtained from peat enriched garden soil. Hence, co-metabolic degradation of MTBE was demonstrated for cultures enriched with propane, iso-butane, and iso-pentane. Although the culture enriched with iso-pentane exhibited the greatest degradation potential of the three cultures examined, this culture was excluded from further study due to substrate handling problems.

Degradation of MTBE

MTBE degradation rates of 10.1 and 15.7 mg MTBE/(g protein·h) were observed for the propane and iso-butane enriched cultures, respectively. Preliminary results suggests half-saturation constants, K_m, for MTBE degradation of approx. 130 – 150 mg MTBE/L.

Substrate degradation

For the propane-oxidizing culture, a maximum degradation rate, v_max, of 405 mg propane/(g protein·h) and a half-saturation constant, K_m, of 9 mg propane/L were found. For iso-butane, v_max and K_m were found at 289 mg iso-butane/(g protein·h) and 3.5 mg iso-butane/L.

Microbial growth rates

Maximum microbial growth rates of approx. 0.5 to 1.2 d^-1 were found. These growth rates are not sufficient for ensuring the necessary biomass concentration in an on-site bioreactor, and a unit for biomass retention should be installed.

Preliminary reactor dimensions

Preliminary dimensions can be estimated for an optimized on-site bioreactor designed for e.g. 90% mass removal and a hydraulic load of 2 m³/hour. Based on the results for the iso-butane oxidizing microorganisms a necessary volume of approx. 4.6 m³ is calculated.

Potential for on-site treatment

In conclusion, it has been shown that it is relatively easy to produce enrichment cultures of microorganisms with a potential for MTBE degradation. It has also been shown that these cultures has a MTBE mass removal potential for groundwater treatment in on-site bioreactors.

1. Indledning

I forbindelse med afværgepumpning på MTBE-forurenede grunde oppumpes ofte grundvand indeholdende MTBE og evt. andre benzinrelaterede forureningskomponenter, herunder BTEX’er.

På grund af MTBE’s relativt høje vandopløselighed og dårlige adsorptionsegenskaber, set i forhold til f.eks. BTEX’er og chlorerede opløsningsmidler, er der ikke umiddelbart nogen af de almindeligvis anvendte on-site teknikker, der er cost-effektive som eneste behandlingsenhed til rensning af MTBE-forurenet grundvand, sammenlignet med løsninger til rensning for f.eks. BTEX’er (Skøt, 1998; Keller et al., 2000a).

Hvor aktiv-kulfiltrering er en velkendt og cost-effektiv metode til on-site rensning af oppumpet grundvand for indhold af f.eks. BTEX’er noteres det ofte, at aktiv-kul løsninger ikke umiddelbart udgør nogen hverken teknisk eller økonomisk optimal løsning til on-site rensning af MTBE-forurenet grundvand (Stub, 1998). Dette udsagn skal bl.a. ses i lyset af, at kulforbruget under sammenlignelige betingelser er ca. en faktor 10 større ved rensning for MTBE end ved rensning for BTEX’er (Arvin og Broholm, 2001).

Keller et al. (2000a) har således beregnet, at det er ca. 2 - 4 gange dyrere at rense for MTBE end for benzen ved en indløbskoncentration på 1 mg/L og et flow på mellem 2 – 20 m³/time. I (Miljøstyrelsen, 1999) anføres det dog, at rensning for MTBE ikke nødvendigvis vil fordyre en afværgeforanstaltning baseret på aktiv-kulfiltrering væsentligt, hvis der alligevel skal fjernes BTEX’er, og når kapitalomkostningerne udgør en væsentlig andel af de samlede omkostninger i forbindelse med afværgeforanstaltningen.

F.eks. har Keller et al. (2000b) dog vist, at der ved at kombinere forskellige teknikker; f.eks. air stripning, membranfiltrering og aktiv-kulfiltrering, kan oprenses cost-effektivt til meget lave MTBE-koncentrationer.

Det vurderes dog, at der er basis for at udvikle og afprøve alternative teknikker, der ved at være specielt designede til behandling af MTBE-forurenet grundvand, kan være cost-effektive i forhold til teknikker, der oprindeligt er designet til frarensning af andre forureningskomponenter.

Biologiske filtre, baseret på mikroorganismer, der direkte eller indirekte omsætter MTBE, kan potentielt udfylde en plads i rækken af on-site teknikker til rensning for MTBE (Miljøstyrelsen, 1999). Rensning i biofiltre har endvidere potentiale til omdannelse af MTBE til ufarlige nedbrydningsprodukter.

Biofiltre kan enten benyttes som eneste løsning eller i kombination med konventionelle on-site løsninger til for- og/eller efterbehandling af det forurenede grundvand, alt afhængigt af de aktuelle mikroorganismers nedbrydningsmæssige egenskaber og deres robusthed overfor øvrige forureningskomponenter.

Selvom der generelt er bred enighed om, at MTBE er forholdsvist svært bionedbrydeligt, især in-situ, (Miljøstyrelsen, 1998), foreligger der i litteraturen flere eksempler på, at f.eks. alkanoxiderende mikroorganismer med held er benyttet til at omsætte MTBE cometabolisk (Steffan et al., 1997; Heick og Sørensen, 1999; Hyman og O’Reilly, 1999). Nærværende projekt tager afsæt i resultaterne opnået i disse studier.

1.2 Formål og projektstruktur

Formål

Formålet med det nærværende projekt er, gennem en række laboratorieforsøg, at afklare om der er teknisk og økonomisk potentiale i at rense MTBE-forurenet grundvand i en bioreaktor indeholdende en berigelseskultur af alkanoxiderende mikroorganismer.

Projektstruktur

Projektets laboratoriearbejde er opdelt i to faser:

1. Første fase omfatter en række batchforsøg til indledende afklaring af metodens tekniske potentiale i forhold til on-site rensning af MTBE-forurenet grundvand.
2. Anden fase vil primært omhandle indkøring og drift af en laboratorieskala bioreaktor samt fastlæggelse af optimale driftsbetingelser for denne.

Samlet vurdering

På baggrund af resultaterne fra begge faser vil der blive foretaget en samlet vurdering af metodens tekniske og økonomiske potentiale.

Nærværende rapport

Nærværende rapport har til formål at beskrive projektets status efter første fase.

2. Laboratoriearbejde og resultater

Undersøgte primærsubstrater

I det oprindelige projektoplæg var der lagt op til at undersøge potentialet i en bioreaktor med propanoxiderende mikroorganismer, men på baggrund af resultaterne i et nyere amerikansk studie af Hyman og O’Reilly (1999) blev det, efter de indledende forsøg, besluttet at inddrage to andre alkaner, hhv. isobutan og isopentan, som mulige primærsubstrater.

Forsøg i projektets første fase

For at undersøge om der er teknisk potentiale i at oprense MTBE-forurenet grundvand i en on-site bioreaktor indeholdende en berigelseskultur af propan-, isobutan- eller isopentanoxiderende mikroorganismer blev der i projektets første fase udført følgende laboratorieforsøg:

1. Opformering og screening af berigelseskulturer.
2. Yderligere selektion med iso-alkaner.
3. Nedbrydningskinetik for primærsubstrat.
4. Nedbrydningskinetik for MTBE.
5. Bestemmelse af maksimale væksthastigheder.

Vurdering af teknisk potentiale

De opnåede resultater vil danne grundlag for en vurdering af om det er muligt at tilvejebringe berigelseskulturer med potentiale til at nedbryde MTBE. Resultaterne vil endvidere give et indtryk af hvilke nedbrydningshastigheder, der kan opnås for MTBE samt hvilken tilsætning af substrat, der modsvarer denne MTBE-nedbrydning. Resultaterne kan på denne baggrund give et indledende billede af mulige dimensioner på en on-site bioreaktor i forhold til krav om massefjernelse (% MTBE fjernet).

Laboratorieprocedurer

En række detaljer omkring fremgangsmåden i forbindelse med de gennemførte forsøg er nærmere beskrevet i bilag A.

2.1 Opformering og screening af berigelseskulturer

Denne del af projektet havde til formål at tilvejebringe naturligt forekommende mikroorganismer med potentiale til nedbrydning af MTBE. Proceduren er baseret på et tidligere studie udført ved Afdeling for Miljøteknik, Aalborg Universitet (Heick og Sørensen, 1999). Berigelsesproceduren er gengivet skematisk i figur B.1, bilag B.

2.1.1 Procedure for berigelse og opformering

Tre forskellige berigelseskulturer blev indledende fremelsket ved udtagning af 100 g sphagnumholdig havejord til inkubering ved 23°C i 1 L flasker med gastætte propper. De tre flasker blev tilsat vand, propan og MTBE som specificeret i tabel 2.1. Gasfasen i flaskerne blev udskiftet ca. hver anden uge med frisk atmosfærisk luft og propan.

Tabel 2.1: Stimulering af berigelseskulturer i jord.

Efter en uge blev 5 mL repræsentativ væskeblanding, efter grundig omrystning, udtaget fra hver flaske og overført til nye 0,5 L flasker med 145 mL frisk vækstmedie. Disse flasker inkuberedes derefter under samme forhold som beskrevet ovenfor. For at sikre tilstrækkelig selektion af de propanoxiderende bakterier blev proceduren gentaget tre gange.

Under selektions- og opformeringsprocessen observeredes der visuelt en betydelig bakterievækst i kulturerne beriget med propan (flaske 1 og 2), mens der kun blev observeret begrænset vækst i kulturen beriget alene med MTBE (flaske 3). Disse indledende observationer vedr. mikroorganismernes vækst stemmer overens med det forventede, da der i litteraturen generelt er observeret betydeligt højere vækstrater for mikroorganismer, der benytter alkaner som primærsubstrat end for mikroorganismer der anvender MTBE som eneste energi- og kulstofkilde; f.eks. (Salanitro et al., 1994; Garnier et al., 1999).

2.1.2 Screening af propanoxiderende kulturer

Til afklaring af hvilken af de afprøvede berigelsesprocedurer, der medfører en bakteriekultur med det største MTBE-nedbrydningspotentiale blev der foretaget en indledende screening af hver kultur. Idet der ikke var sket en nævneværdig vækst i flaske 3, der kun blev beriget med MTBE, blev denne kultur ikke medtaget i screeningen. Kulturen blev fortsat opformeret til screening i projektets fase 2.

Kulturerne blev placeret i serumflasker ved 23°C og MTBE-koncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 75 timer. Den nærmere fremgangsmåde ved screeningen er beskrevet i bilag A.1.

Tabel 2.3 viser de opnåede resultater, herunder MTBE-nedbrydningsrater, for berigelseskulturerne i flaske 1 og 2 samt for parallelle blindtests til dokumentation af, at der ikke skete abiotisk fjernelse af MTBE i serumflaskerne (Blind A og B).

Tabel 2.3: Screening for berigelseskulturernes MTBE-nedbrydningsrater ved 23°C.

Den lavere tilsætning af isopentan blev valgt på baggrund af et studie af (Garnier et al., 1999), der opnåede maksimal væksthastighed for pentan-oxiderende bakterier ved en koncentration på 0,085 mg pentan/L. Der blev således lavet to forskellige berigelser; én hvor der blev tilsat 4 mL isopentangas (svarende til 0,083 mg isopentan/L) og én hvor der blev tilsat 6 mL isopentangas, jf. tabel 2.4. Der blev observeret kraftigst vækst i kulturen tilsat 6 mL, hvorfor denne berigelse benyttedes til de efterfølgende forsøg.

2.2.2 Screening efter yderligere selektion

Der er udført nedbrydningsforsøg med de tre kulturer, beriget med hhv. propan, isobutan og isopentan, for dels at afgøre hvilket substrat, der medfører det største omsætningspotentiale for MTBE og dels for, om muligt, at fastlægge den optimale tilsætning af primærsubstrat, set i forhold til MTBE-nedbrydning.

Screeningen er udført ved fem forskellige koncentrationsniveauer for hvert primærsubstrat. Kulturerne blev placeret i serumflasker ved 23°C og MTBE-koncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 24 timer. Den nærmere fremgangsmåde ved screeningen er beskrevet i bilag A.2.

MTBE-nedbrydningsraten for de tre berigelseskulturer ved fem forskellige koncentrationer af hvert primærsubstrat fremgår af tabel D.1 i bilag D. Resultaterne er afbildet i figur 2.2.

Figur 2.2: MTBE-nedbrydningsrate som funktion af primærsubstratkoncentration.

Som det fremgår af figur 2.2 er der observeret ca. 125 til 400% højere nedbrydningsrater for kulturen beriget med isopentan end for de øvrige kulturer. Resultaterne for den isopentanoxiderende kultur tyder således umiddelbart på, at der er et væsentligt potentiale for at benytte dette primærsubstrat ved cometabolisk omsætning af MTBE. Desværre blev der, ved høje koncentrationer af isopentan, observeret delvis opløsning af de tefloncoatede gummipropper, der benyttes til lukning af serumflaskerne. Isopentan er samtidig det af substraterne, der er mindst vandopløseligt og sværest at håndtere i praksis, hvorfor det umiddelbart blev vurderet uegnet til brug i feltapplikationer. Det ligger dog uden for rammerne af nærværende projekt at undersøge om de praktiske problemer med håndteringen af substratet kan løses, hvorfor der ikke blev udført yderligere forsøg med den isopentanberigede kultur.

Som det fremgår af figur 2.2 blev der for kulturen beriget med isobutan observeret MTBE-nedbrydningsrater, der var ca. 30 – 75% højere end for kulturen beriget udelukkende med propan. Da der samtidig ikke er problemer med håndteringen af isobutan blev denne berigelseskultur medtaget i det efterfølgende forsøgsprogram.

For propan og isobutan blev der observeret faldende MTBE-nedbrydningsrater ved øget tilsætning af primærsubstrat, samt maksimale rater uden tilsætning af primærsubstrat. Dette indikerer umiddelbart, at der er tale om en form for substratinhibering mellem primærsubstrat og cosubstrat (MTBE), hvor primærsubstrat og cosubstrat kæmper om et endeligt antal enzymer. Det vurderes dog, at raterne opnået uden tilsætning af primærsubstrat ikke kan opretholdes over længere perioder, idet der kræves en vis mængde substrat for at dække mikroorganismernes energibehov til basalmetabolisme samt opretholdelse af deres enzymsystem.

I forhold til optimal tilsætning af primærsubstrat er der stort set observeret uændrede MTBE-nedbrydningsrater for de to kulturer indenfor en faktor 10 af substratkoncentration, jf. figur 2.2. MTBE-nedbrydningsraten for den propanoxiderende berigelseskultur er således stort set uændret i koncentrationsintervallet 0,06 – 0,6 mg propan/L, mens raten for den isobutanoxiderende kultur stort set er uændret i koncentrationsintervallet 0,05 – 0,5 mg isobutan/L. På baggrund af de foreliggende resultater kan det ikke afgøres, hvor i koncentrationsintervallet der opnås den optimale afvejning mellem opretholdelse af enzymaktiviteten og substratinhibering, hvorfor denne problemstilling vil blive forsøgt nærmere afdækket i projektets fase 2.

På baggrund af resultaterne vist i figur 2.2 samt ovenstående, blev det valgt at benytte substratkoncentrationer på ca. 0,6 mg propan/L og 0,5 mg isobutan/L, i forhold til en optimal omsætningsrate af MTBE samt opretholdelse af mikroorganismernes enzymaktivitet. Der observeredes ved disse substratkoncentrationer MTBE-nedbrydningsrater på 10,1 og 15,7 mg MTBE/(g protein·time) for hhv. den propan- og den isobutanoxiderende kultur, jf. tabel D.1 i bilag D. Begge rater er observeret ved 23°C og en initialkoncentration af MTBE på ca. 10 mg MTBE/L.

2.3 Nedbrydningskinetik for primærsubstrat

Da en given bioreaktor i princippet kan køres ved forskellige primærsubstratkoncentrationer og da omsætningshastigheden, og dermed den nødvendige tilsætning, for primærsubstratet afhænger af koncentrationsniveauet, blev der udført forsøg til bestemmelse af nedbrydningskinetik for primærsubstraterne propan og isobutan.

Nedbrydningskinetikken for substraterne kan beskrives vha. Michaelis-Menten relationen, ligning 2.1:

hvor S er substratkoncentrationen [mg substrat/L], v er den aktuelle substratomsætningshastighed [mg substrat/(g protein·time)], v_max er den maksimale omsætningshastighed [mg substrat/(g protein·time)] og K_m er halvmætningskonstanten [mg substrat/L], dvs. den substratkoncentration, hvor der opnås 0,5·v_max.

Substratomsætningsraten blev bestemt ved 11 propankoncentrationer og ved 9 isobutankoncentrationer. Kulturerne blev placeret i serumflasker ved 23°C og substratkoncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 6 timer. Den nærmere fremgangsmåde ved forsøget er beskrevet i bilag A.3.

Nedbrydningsraterne for de to berigelseskulturer ved de forskellige koncentrationer af primærsubstrat fremgår af tabel D.2 i bilag D. Resultaterne fremgår grafisk af figur 2.3, sammen med ligning 2.1 fittet til resultaterne. Raterne ved de to højeste propankoncentrationer (hvor der var størst overtryk i serumflaskerne) er ikke medtaget idet propperne i disse flasker blev konstateret utætte efter gentagne kanylestik. Da der således, udover den biologiske omsætning, er sket en abiotisk substratfjernelse blev de tilsyneladende nedbrydningsrater i disse flasker kunstigt høje.

Figur 2.3: Michaelis-Menten kurver til beskrivelse af omsætningen af propan og isobutan.

Ved fitningen af ligning 2.1 til de opnåede resultater, jf. figur 2.3, beskriver Michaelis-Menten relationerne givet ved ligning 2.2 og 2.3, altså substratomsætningshastigheden som funktion af substratkoncentrationen for hhv. propan og isobutan.

  (2.2)

  (2.3)

Ved de benyttede primærsubstratkoncentrationer på hhv. ca. 0,6 mg propan/L og 0,5 mg isobutan/L, jf. afsnit 2.2.2, kan der vha. ligning 2.2 og 2.3 beregnes omsætningshastigheder for primærsubstraterne på hhv. ca. 25,3 og 36,1 mg substrat/(g protein·time). Disse rater er fundet ved 23°C.

2.4 Nedbrydningskinetik for MTBE

For at kunne udføre såvel hydraulisk som biologisk dimensionering af en bioreaktor til en given rensningsopgave; herunder for at kunne designe reaktoren, så den kan leve op til givne krav til oprensningsniveau (mg/L i udløb) og rensningsgrad (% massefjernelse), er det nødvendigt at have en god bestemmelse af berigelseskulturens nedbrydningskinetik for MTBE.

Ved tidligere forsøg udført på Aalborg Universitet, (Heick og Sørensen, 1999), blev der fundet v_max og K_m værdier for en berigelseskultur af propanoxiderende bakterier på hhv. ca. 43 mg MTBE/(g protein·time) og 142 mg MTBE/L ved ca. 0,6 mg propan/L og 23°C.

I den første fase af nærværende projekt blev der derfor ikke udført forsøg til bestemmelse af Michaelis-Menten parametrene for den propanoxiderende berigelseskultur, da det blev vurderet mere relevant at opnå parametre for den isobutanberigede kultur, der kunne danne grundlag for en sammenligning af de to kulturer.

MTBE-nedbrydningsraten blev bestemt ved fem forskellige MTBE-koncentrationer. Kulturerne blev placeret i serumflasker ved 23°C og MTBE-koncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 1 – 7 døgn. Den nærmere fremgangsmåde ved forsøget er beskrevet i bilag A.4.

Nedbrydningsraterne ved de forskellige koncentrationer af MTBE fremgår af tabel D.3 i bilag D. Resultaterne fremgår grafisk af figur 2.4, sammen med ligning 2.1, fittet til resultaterne.

Figur 2.4: Michaelis-Menten kurve for nedbrydning af MTBE vha. den isobutanberigede bakteriekultur.

Som det fremgår af figur 2.4 er der bestemt en halvmætningskonstant, K_m, på 128 mg MTBE/L og en maksimal MTBE-nedbrydningsrate, v_max, på 7,3 mg MTBE/(g protein·time).

Det bemærkes, at den fundne v_max ligger væsentligt under den i afsnit 2.2.2 bestemte rate. Her blev nedbrydningsraten således bestemt til 15,7 mg MTBE/(g protein·time) ved samme koncentration af isobutan (ca. 0,5 mg/L) og ved 10 mg MTBE/L. Dette forhold tilskrives, at en del af biomassen under automatisk omrystning adsorberede til tørre områder af glasvæggen i forsøgsflaskerne og dermed ikke var i god kontakt med opløsningen. Under den indledende screening blev flaskerne rystet manuelt med jævne mellemrum, hvorved dette problem kunne undgås.

I de følgende beregninger tages der udgangspunkt i den MTBE-nedbrydningsrate på 15,7 mg MTBE/(g protein·time), der blev bestemt under den indledende substratscreening, jf. afsnit 2.2.2.

Den fundne K_m-værdi på 128 mg MTBE/L kan antages at være repræsentativ for berigelseskulturen under forudsætning af, at andelen af adsorberet biomasse var ens i de fem forsøgsflasker, der ligger til grund for resultaterne i figur 2.4. Dette skyldes, at K_m, i modsætning til v_max, er en bakteriespecifik parameter, der ikke afhænger af biomassens absolutte størrelse. Til sammenligning med den fundne K_m-værdi på 128 mg/L opnåede (Heick og Sørensen, 1999) en K_m-værdi på 142 mg/L for en berigelseskultur af propanoxiderende bakterier. I litteraturen er der angivet et generelt niveau for K_m på ca. 80 – 210 mg/L, ved cometabolisk omsætning af MTBE vha. forskellige alkanoxiderende bakterier (f.eks. Hyman et al., 1998; Garnier et al., 1999). Samlet vurderes det således, at den opnåede K_m-værdi ligger forholdsvis tæt på den "sande" K_m-værdi for berigelseskulturen.

Hvis det antages, at den ovenfor bestemte K_m-værdi på 128 mg MTBE/L er repræsentativ for den isobutanoxiderende kultur og, hvis MTBE-nedbrydningsraten (ved 10 mg MTBE/L) på 15,7 mg MTBE/(g protein·time), jf. afsnit 2.2.2, benyttes, kan der vha. ligning 2.1 beregnes en v_max-værdi på ca. 217 mg MTBE/(g protein·time).

Hvis det for den propanoxiderende kultur tilsvarende antages, at K_m-værdien på 142 mg MTBE/L er repræsentativ for kulturen, og hvis MTBE-nedbrydningsraten (ved 10 mg MTBE/L) på 10,1 mg MTBE/(g protein·time), jf. afsnit 2.2.2, benyttes, kan der vha. ligning 2.1 beregnes en v_max-værdi på ca. 152 mg MTBE/(g protein·time).

På baggrund af ovenstående forudsætninger kan der opstilles Michaelis-Menten relationer til beskrivelse af MTBE-nedbrydningsraten som funktion af MTBE-koncentrationen for hhv. den propan- og den isobutanoxiderende berigelseskultur; ligning 2.4 og 2.5.

   (2.4)

  (2.5)

hvor S_MTBE er MTBE-koncentrationen i væskefasen [mg MTBE/L] og v_MTBE er MTBE-nedbrydningsraten [mg MTBE/(g protein·time)].

Hvis forudsætningerne holder har den isobutanberigede kultur altså ca. 40% højere maksimalt nedbrydningspotentiale for MTBE end den propanberigede kultur.

Det foreliggende datagrundlag vurderes dog ikke at være tilstrækkeligt som redskab ved dimensionering af on-site rensningsløsninger, hvorfor forsøget til fastlæggelse af Michaelis-Menten kinetikken for den isobutanoxiderende kultur gentages i projektets fase 2, sammen med et tilsvarende forsøg for den propanoxiderende kultur.

2.5 Bestemmelse af maksimale væksthastigheder

Opretholdelse af ønsket biomassekoncentration

For at afklare om det er realistisk at opretholde en ønsket biomassekoncentration, under drift af en given bioreaktor, ved mikrobiel vækst alene, blev der udført forsøg til bestemmelse af de maksimale væksthastigheder for den propan- og den isobutanoxiderende berigelseskultur. Det er således undersøgt om bakterierne kan vokse hurtigt nok til ikke at blive skyllet ud, eller om der kræves en enhed til tilbageholdelse af biomasse i forbindelse med reaktordriften.

Fremgangsmåde

Den maksimale specifikke væksthastighed blev for hver af de to berigelseskulturer bestemt ved to forskellige temperaturer (23 og 30°C). Kulturerne blev tilsat substrat og ilt i overskud og biomassekoncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 2 – 5 døgn. Den nærmere fremgangsmåde ved forsøget er beskrevet i bilag A.5.

Resultater

Biomassekoncentrationerne som funktion af tiden fremgår af tabel D.4 i bilag D. Resultaterne for de udførte forsøg ved hhv. 23 og 30°C er afbildet i figur 2.5.

Figur 2.5: Vækstkurver for propan- og isobutanoxiderende berigelseskulturer ved 23 og 30°C.

Vækstrater

Som det fremgår af figur 2.5 er der fundet vækstrater for de to berigelseskulturer på ca. 0,5 – 1,2 d^-1 ved 23 – 30°C. Disse rater ligger umiddelbart i den lave ende af det der i litteraturen er rapporteret for alkanoxiderende bakterier, men i den høje ende af værdier rapporteret for bakterier, der gror udelukkende på MTBE. Typiske vækstrater for alkanoxiderende bakterier ved 20 – 30°C ligger således i intervallet 1,1 – 4,6 d^-1 (Heick og Sørensen, 1999; Garnier et al., 1999), mens vækstrater for rene MTBE-nedbrydere tilsvarende ligger i intervallet <0,01 – 1,45 d^-1 (Salanitro et al., 1994; Park og Cowan, 1997).

Hydraulisk opholdstid; tilbageholdelse af biomasse påkrævet

Hvis biomassekoncentrationen i en reaktor skal kunne opretholdes ved vækst alene kan det, på baggrund af de observerede vækstrater, konkluderes, at der kræves hydrauliske opholdstider på mindst 20 timer. Dette er vel at mærke ved 30°C og høje substratkoncentrationer, der ikke er ønskelige i forhold til en effektiv MTBE-nedbrydning, jf. figur 2.2. Væksten ved 10°C må endvidere forventes at være ca. 4 – 10 gange mindre end ved 30°C, hvorved de påkrævede hydrauliske opholdstider tilsvarende vil blive 4 – 10 gange større. En afværgepumpning på 1 m³/time ville således skulle matches af en reaktor på minimum 80 m³, hvilket vurderes at være urealistisk i forhold til on-site anvendelse af teknologien. Det er således nødvendigt med en form for tilbageholdelse af biomassen i den kontinuerte bioreaktor, f.eks. ved membranfiltrering og recirkulation, som angivet af (Pitre og Steffan, 1997).

3. Perspektiver for on-site rensning af grundvand

På baggrund af de opnåede laboratorieresultater vil der i det følgende blive udført indledende overslagsberegninger for dimensionering af en on-site bioreaktor til fjernelse af MTBE. Beregningerne skal udelukkende benyttes til indledende diskussion af de tekniske perspektiver for etablering af on-site biofiltre baseret på cometabolisk nedbrydning og ikke som nogen endelig dimensioneringsvejledning.

Der er i beregningerne ikke taget hensyn til en eventuel tilstedeværelse af øvrige forureningskomponenter, f.eks. BTEX’er, der evt. kan medføre yderligere iltforbrug og/eller hæmning af MTBE-nedbrydningen. Der er ligeledes set bort fra den mulige betydning af grundvandets kemiske beskaffenhed, ligesom forhold omkring substrat- og ilttilsætning kun er diskuteret på et overordnet plan. En række af disse problemstillinger vil blive undersøgt nærmere i projektets anden fase.

3.1 Korrektion for temperatur og biomassekoncentration

Idet nedbrydningsraterne for substrater og MTBE er bestemt ved 23°C skal disse korrigeres til en temperatur, der anses for at være realistisk i forbindelse med praktisk drift af en on-site reaktor. Nedbrydningsraterne kan temperaturkorrigeres vha. en relation baseret på Q₁₀ (Helweg, 1988):

   (3.1)

hvor T1 er temperaturen, hvor nedbrydningsraten er målt [°C], T2 er den temperatur, som raten ønskes korrigeret til [°C], v_T1 er nedbrydningsraten svarende til T1 [mg/(g protein·time)], v_T2 er nedbrydningsraten svarende til T2 [mg/(g protein·time)], Q₁₀ er en korrektionsfaktor, der angiver hvor mange gange raten mindskes, hvis temperaturen sænkes 10°C.

I det følgende antages det, at driften af en given on-site reaktor vil ske ved en temperatur på 10°C (T2), svarende ca. til grundvandstemperaturen under dansk forhold. For nedbrydning af miljøfremmede stoffer i jord og grundvand observeres typisk Q₁₀-værdier i intervallet 2 – 4 (Helweg, 1988). I det følgende antages en Q₁₀-værdi på 3 at være gældende. I projektets anden fase udføres der bl.a. supplerende batchforsøg til fastlæggelse af nedbrydningsrater ved 10°C, der kan benyttes til fastlæggelse af Q₁₀-værdier for de aktuelle berigelseskulturer.

Da de fundne nedbrydningsrater endvidere er normeret til biomassekoncentrationen, udtrykt ved koncentrationen af celleprotein, må der ved disse overslagsberegninger antages en biomassekoncentration for en given on-site reaktor.

I (Pitre og Steffan, 1997), hvor der blev opstillet en pilot-skala bioreaktor til cometabolisk rensning af MTBE-forurenet grundvand, blev der under testperioden opnået en biomassekoncentration svarende til ca. 2 g protein/L. (Pitre og Steffan, 1997) vurderer, at der ved optimeret reaktordrift, incl. ultrafiltrering og recirkulation, kan opnås en biomassekoncentration svarende til ca. 10 - 15 g protein/L. I de følgende beregninger antages der en biomassekoncentration på 10 g protein/L, svarende til en optimeret bioreaktor med ultrafiltrering og recirkulation til tilbageholdelse af biomasse. I projektets anden fase udføres der bl.a. reaktorforsøg med tilbageholdelse og recirkulation af biomasse, der kan give en indikation af hvilke biomassekoncentrationer, der potentielt kan opnås.

3.2 Korrigerede nedbrydningsrater

Med hensyn til omsætningsraten for MTBE, observeredes der nedbrydningsrater på hhv. 10,1 og 15,7 mg MTBE/(g protein·time), ved primærsubstratkoncentrationer på hhv. ca. 0,6 mg propan/L og 0,5 mg isobutan/L, jf. afsnit 2.2.2. Disse rater er bestemt ved en temperatur på 23°C og en MTBE-koncentration på 10 mg MTBE/L. Hvis raterne korrigeres til 10°C for en optimeret bioreaktor med 10 g protein/L, beregnes rater på hhv. 24 og 38 g MTBE/(m³ reaktor·time) for de propan- og isobutanberigede kulturer, ved 10 mg MTBE/L.

Hvis bioreaktoren, pga. mekanisk omrøring, regnes ideelt opblandet, vil MTBE-koncentrationen i udløbet svare til koncentrationen i reaktoren, og dermed til driftspunktet på Michaelis-Menten kurven for MTBE-nedbrydning. Hvis der således ønskes en MTBE-koncentration på f.eks. 1 mg MTBE/L i udløbet skal de ovenfor beregnede MTBE-nedbrydningsrater korrigeres til denne MTBE-koncentration.

I det følgende antages ligning 2.4 og 2.5, afsnit 2.4, at være gældende til beskrivelse af MTBE-nedbrydningsratens afhængighed af MTBE-koncentrationen (ved 23°C). Hvis nedbrydningsraterne korrigeres til 10°C for en optimeret bioreaktor med 10 g protein/L, kan der beregnes MTBE-nedbrydningsrater på hhv. ca. 2,5 og 4 g MTBE/(m³ reaktor·time) ved 10°C og 1 mg MTBE/L i udløbet.

For primærsubstraterne, observeredes der, ved 23°C og koncentrationer på hhv. ca. 0,6 mg propan/L og 0,5 mg isobutan/L, nedbrydningsrater på ca. 25,3 mg propan/(g protein·time) og 36,1 mg isobutan/(g protein·time), jf. afsnit 2.3. Hvis raterne korrigeres til 10°C for en optimeret bioreaktor med 10 g protein/L, beregnes vha. ligning 2.5 rater på hhv. ca. 60 og 85 g substrat/(m³ reaktor·time) for de propan- og isobutanberigede kulturer.

3.3 Overslagsberegninger

Hydraulisk belastning og massefjernelse

I de følgende beregninger dimensioneres en hypotetisk bioreaktor til en hydraulisk belastning på 2 m³/time og 90% massefjernelse for MTBE. Der tages udgangspunkt i den isobutanberigede kultur og der ses på to forskellige scenarier; ét hvor der fra 100 mg MTBE/L i indløbet renses ned til 10 mg MTBE/L og ét hvor der renses fra 10 til 1 mg MTBE/L.

100 til 10 mg MTBE/L

I det første tilfælde skal der fjernes 180 g MTBE/time. Da nedbrydningsraten for den optimerede bioreaktor er ca. 38 g MTBE/(m³ reaktor·time) bliver det nødvendige reaktorvolumen ca. 4,7 m³. Ved denne driftssituation skal der tilsættes ca. 400 g isobutan, svarende til ca. 2,2 g isobutan pr. g MTBE, der fjernes. Den hydrauliske opholdstid bliver ca. 2 timer og 20 min.

10 til 1 mg MTBE/L

I det andet tilfælde skal der fjernes 18 g MTBE/time. Da nedbrydningsraten under disse forhold er ca. 4 g MTBE/(m³ reaktor·time) bliver det nødvendige reaktorvolumen ca. 4,5 m³. Ved denne driftssituation skal der tilsættes ca. 380 g isobutan, svarende til ca. 21 g isobutan pr. g MTBE, der fjernes. Den hydrauliske opholdstid bliver ca. 2 timer og 15 min.

Propanoxiderende bakterier

Tilsvarende beregninger kan foretages for den propanberigede kultur, hvorved der opnås nødvendige reaktorvoluminer på hhv. 7,5 og 7,0 m³ og substratforbrug på hhv. ca. 2,6 og 25 g propan/g MTBE, der fjernes. De hydrauliske opholdstider bliver hhv. 3 timer og 45 min, og 3 timer og 30 min.

Ilt- og substratbehov

Det bør bemærkes, at ovenstående overslagsberegninger er udført under forudsætning af, at bakterierne har ideelle betingelser mht. ilt- og substrattilførsel. Det støkiometriske iltforbrug ved oxidation af propan- og isobutan er hhv. 1,2 og 0,9 g O₂/g substrat, hvilket for ovenstående scenarier vil medføre iltbehov på ca. 180 – 280 g O₂/m³ vand, der behandles. Da der samtidig skal tilføres 190 – 240 g substrat/m³ vand, skal der altså overføres betydelige gasmængder til væskefasen, hvorved masseoverførsel og stripning af forureningskomponenter kan vise sig, at blive væsentlige aspekter ved dimensionering af et givent on-site biofilter.

Mulig faktor 10 reduktion af ilt- og substrattilsætning

Som anført i afsnit 2.2.2 er der mulighed for, at stort set samme MTBE-nedbrydningsrater, som skitseret i de ovenstående beregninger, kan opretholdes med substratkoncentrationer der er ca. en faktor 10 lavere end de umiddelbart anvendte; med en tilsvarende reduktion af den nødvendige ilttilsætning til følge. Disse forhold vil blive søgt nærmere afdækket under indkøringen af en laboratorieskala bioreaktor i projektets 2. fase.

4. Sammenfatning

Opformering af berigelseskultur på propan

Det kan på nuværende tidspunkt konkluderes, at det har været muligt at stimulere og opformere berigelseskulturer med potentiale til cometabolisk nedbrydning af MTBE. Der er således opformeret to berigelseskulturer af propanoxiderende mikroorganismer ved berigelse af sphagnumholdig havejord med 1) propan alene og 2) propan og MTBE. Ved screening af MTBE-nedbrydningen for de to berigelseskulturer viste det sig, at nedbrydningspotentialet var ca. 2 – 7 gange så stort for kulturen beriget med både propan og MTBE, som for kulturen beriget med propan alene.

Opformering af berigelseskulturer på isobutan og isopentan

På baggrund af et amerikansk studie blev der iværksat en yderligere selektion for mikroorganismer med potentiale til MTBE-nedbrydning ud fra den propanoxiderende berigelseskultur; dels ved berigelse med af isobutan og dels ved berigelse med isopentan. For disse kulturer blev der opnået MTBE-nedbrydningsrater, der var op mod hhv. 75 og 400% højere end for den propanoxiderende berigelseskultur, med de højeste rater opnået for kulturen beriget med isopentan. Desværre viste isopentan sig, at være svært at håndtere samt, at opløse de teflonbelagte gummipropper, der blev benyttet til forsøgene. Isopentan blev derfor af praktiske årsager fravalgt som muligt primærsubstrat.

Nedbrydningsrater for MTBE

På baggrund af substratscreeningen anbefales det umiddelbart, for de propan- og isobutanoxiderende berigelseskulturer, at benytte substratkoncentrationer på hhv. ca. 0,6 mg propan/L og 0,5 mg isobutan/L. Ved disse koncentrationer blev der observeret MTBE-nedbrydningsrater, svarende til hhv. 24 og 38 g MTBE/(m³ reaktor·time), for en optimeret reaktor med 10 g protein/L, ved 10 mg MTBE/L og 10°C.

K_m-værdier for MTBE-nedbrydning

Der er indledende fundet halvmætningskonstanter, K_m, for MTBE-nedbrydning ved hhv. ca. 0,5 mg isobutan/L og 0,6 mg propan/L på ca. 130 – 150 mg MTBE/L. Disse K_m-værdier vil blive forsøgt bedre fastlagt i projektets fase 2.

Kinetik for omsætning af primærsubstrat

Der er, for omsætningen af propan, fundet v_max- og K_m-værdier på hhv. 405 mg propan/(g protein·time) og 9 mg propan/L. For isobutan er der tilsvarende fundet v_max- og K_m-værdier på hhv. 289 mg isobutan/(g protein·time) og 3,5 mg isobutan/L. Ved koncentrationer på hhv. ca. 0,6 mg propan/L og 0,5 mg isobutan/L kan der således beregnes omsætningshastigheder på hhv. 60 og 85 g substrat/(m³ reaktor·time), for en optimeret reaktor med ca. 10 g protein/L ved 10°C.

Mikrobielle væksthastigheder

Ved forsøg udført ved 23 og 30°C og med høje substratkoncentrationer, er der fundet maksimale væksthastigheder på mellem 0,5 og 1,2 d^-1. På denne baggrund vurderes det, at mikroorganismernes væksthastigheder ikke er tilstrækkelige til at sikre opretholdelse af biomassekoncentrationen i en given on-site reaktor ved vækst alene. I tilknytning til en on-site reaktor skal der således etableres en enhed til tilbageholdelse af biomasse.

Perspektiver for on-site reaktor

Ved en indledende dimensionering af en on-site bioreaktor, baseret på de opnåede resultater for den isobutanberigede kultur, kan der f.eks. ved 90% massefjernelse for MTBE samt en hydraulisk belastning på 2 m³/time beregnes et nødvendigt reaktorvolumen på hhv. 4,7 og 4,5 m³, afhængigt af om der skal renses fra 100 til 10 mg MTBE/L eller fra 10 til 1 mg MTBE/L. Der kan i disse to tilfælde beregnes et forbrug af primærsubstrat på hhv. ca. 2,2 og 21 g isobutan/g MTBE.

Forbehold ved opskalering

Ovenstående beregninger er udført som simple overslagsberegninger ud fra de opnåede laboratorieresultater; dvs. under forudsætning af, at der kan opretholdes ideelle betingelser mht. ilt- og substrat for al biomasse i en given on-site reaktor. Der kan dog vise sig, at være væsentlige praktiske problemer med tilførsel af tilstrækkelige mængder ilt og substrat samt evt. stripning af forureningskomponenter ved opskalering fra laboratorieskala til pilot-/on-site skala. Disse forhold vil blive søgt nærmere afdækket i projektets 2. fase.

Potentiale for on-site rensning

Samlet vurderes det at være dokumenteret, at der forholdsvist simpelt kan fremelskes berigelseskulturer, med et væsentligt potentiale til nedbrydning af MTBE samt at være sandsynliggjort, at disse kulturer har potentiale til massefjernelse i forbindelse med on-site rensning af MTBE-forurenet grundvand i en kontinuert bioreaktor.

5. Referencer

Arvin og Broholm (2001)

Arvin, E. og K. Broholm (2001). Effektivitet af on-site teknikker til oprensning af MTBE forurenet grundvand. ATV-møde: Vintermøde om jord- og grundvandsforurening, 6.-7. marts 2001.

Garnier et al. (1999)

Garnier, P. M., R. Auria, C. Augur og S. Revah (1999). Cometabolic biodegradation of methyl t-butyl ether by Pseudomonas aeruginosa grown on pentane. Appl. Environ. Microbiol., 51, 498-503.

Heick og Sørensen (1999)

Heick, O. og S. B. Sørensen (1999). Mikrobiel nedbrydning af MTBE – Propanoxiderende bakterier. Afgangsprojekt ved civilingeniøruddannelsen i miljøteknik, Institut for vand, jord og miljøteknik, Aalborg Universitet.

Helweg (1998)

Helweg, A. (red.) (1988). Kemiske stoffer i landjords miljøer. Teknisk Forlag A/S.

Hyman et al. (1998)

Hyman, M, P. Kwon, K. Williamson og K. O’Reilly (1998). Cometabolism of MTBE by alkane-utilizing microorganisms, 321 – 326, (C1-3) af Proceedings of the first international conference on remediation of chlorinated and recalcitrant compounds, Battelle Press. (Editors) G. B. Wickramanayake og R. E. Hinchee.

Hyman og O’Reilly (1999)

Hyman, M, og K. O’Reilly (1999). Physiological and enzymatic features of MTBE-degrading bacteria, 7 - 12. I "In Situ Bioremediation of Petroleum Hydrocarbon and Other Organic Compounds", 5(3) af Proceedings of the fifth international in situ and on-site bioremediation symposium, Battelle Press. (Editors) B. C. Alleman og A. Leeson.

Keller et al. (2000a)

Keller, A. A., O. C. Sandall, R. G. Rinker, M. M. Mitani, B. Bierwagen, og M. J. Snodgrass (2000a). An evaluation of physicochemical treatment technologies for water contaminated with MTBE. Groundwater Monitoring and Remediation, fall 2000, 114-126.

Keller et al. (2000b)

Keller, A. A., S. Sirivithiyapakorn, og M. L. Kram (2000b). Remediation of Water and Soil Contaminated with MTBE, 73 - 80. I "Case Studies in the Remediation of Chlorinated and Recalcitrant Compounds", (C2-7), Proceedings of the second international conference on remediation of chlorinated and recalcitrant compounds, Battelle Press. (Editors) G. B. Wickramanayake, A. R. Gavaskar, J. T. Gibbs og J. L. Means.

Miljøstyrelsen (1998)

Miljøstyrelsen (1998). M. Kjærgaard, J. P. Ringsted, H.-J. Albrechtsen og P. L. Bjerg. Miljøprojekt nr. 408. Naturlig nedbrydning af miljøfremmede stoffer i jord og grundvand.

Miljøstyrelsen (1999)

Miljøstyrelsen (1999). E. Arvin og K. Broholm. Miljøprojekt nr. 483. Afværgeteknikker for MTBE-forurenet grundvand.

Park og Cowan (1997)

Park, K. og R. M. Cowan (1997). Biodegradation of gasoline oxygenates, 17. I "In Situ and On-Site Bioremediation: Volume 1", 4(1) af Proceedings of the fourth international in situ and on-site bioremediation symposium, Battelle Press. (Editors) B. C. Alleman og A. Leeson.

Pitre og Steffan (1997)

Pitre, M. P. og R. Steffan (1997). Biotreatment of MTBE-contaminated groundwater in membrane bioreactor. AlChE 1997 Spring National Meeting, Envirogen, Inc.

Salanitro et al. (1994)

Salanitro, J. P., L. A. Diaz, M. P. Williams og H. L. Wisniewski (1994). Isolation of a bacterial culture that degrades methyl t-butyl ether. Appl. Environ. Microbiol., 60(7), 2593-2596.

Skøt (1998)

Skøt, M. (1998). Miljøtruslen der bekymrer enhver. Vand og Jord, 5(3), 105-108.

Steffan et al. (1997)

Steffan, R.J., K. McClay, S. Vainberg, C. W. Condee, and D. Zhang (1997). Biodegradation of the gasoline oxygenates methyl tert-butyl ether, ethyl tert-butyl ether, and tert-amyl methyl ether by propane-oxidizing bacteria. Appl. Environ. Microbiol, 63(11), 4216-4222.

Stub (1998)

Stub, L. (1998). Status for MTBE. ATV-møde: Olie- og benzingrunde, Schæffergården 7. oktober, 1998, 39-54.

Bakteriekulturerne i flaske 1 og 2, jf. afsnit 2.1.1, blev centrifugeret ned, tilsat en 120 mL serumflaske og fortyndet med vækstmedie til et volumen på 20 mL. Efter grundig homogenisering blev biomassekoncentrationen målt som optisk densitet ved 550 nm (OD₅₅₀) og omregnet til koncentration af celleprotein vha. standardkurverne præsenteret i bilag C. Serumflaskerne blev herefter lukket med teflonbelagte gummipropper og tilsat 5 mL propangas, svarende til en væskekoncentration på ca. 3,1 mg propan /L, samt en initialkoncentration af MTBE på 10 mg/L.

Der blev udført parallelle blindtest til dokumentation af, at der ikke skete abiotisk fjernelse af MTBE i serumflaskerne (Blind A og B).

Serumflaskerne blev placeret ved 23°C og MTBE-koncentrationen blev moniteret ved head-space analyse over en periode på ca. 75 timer.

A.2 Screening efter yderligere selektion

Hver bakteriekultur blev centrifugeret ned og fortyndet med vækstmedie til et væskevolumen på 100 mL. Efter grundig homogenisering blev biomassekoncentrationen for hver kultur målt som optisk densitet ved 550 nm (OD₅₅₀) og omregnet til koncentration af celleprotein vha. standardkurverne i bilag C. Herefter blev hver kultur opdelt i fem serumflasker (20 mL i hver) med volumen på 120 mL. Serumflaskerne blev efterfølgende lukket med teflonbelagte gummipropper og tilsat ca. 10 mg MTBE/L.

Der blev anvendt fem forskellige niveauer af hvert primærsubstrat, jf. tabel D.1 i bilag D. Propan blev tilsat i koncentrationer fra 0 til 6,3 mg/L, isobutan blev tilsat i koncentrationer fra 0 til 4,9 mg/L og isopentan blev tilsat i koncentrationer fra 0 til 1,06 mg/L.

Serumflaskerne blev placeret ved 23°C og MTBE-koncentrationen blev moniteret ved head-space analyse over en periode på ca. 24 timer.

A.3 Nedbrydningskinetik for primærsubstrat

Til disse forsøg blev der anvendt 60 mL serumflasker, indeholdende 40 mL vækstmedie med biomasse. Efter grundig homogenisering blev biomassekoncentrationen målt som optisk densitet ved 550 nm (OD₅₅₀) og omregnet til koncentration af celleprotein vha. standardkurverne præsenteret i bilag C. Serumflaskerne blev herefter lukket med teflonbelagte gummipropper og placeret med omrystning ved 150 rpm.

Der blev anvendt 11 forskellige propankoncentrationer og 9 forskellige isobutankoncentrationer, jf. tabel D.2 i bilag D. Propan blev tilsat i koncentrationer fra 0,06 til 30 mg/L og isobutan blev tilsat i koncentrationer fra 0,048 til 24 mg/L.

Serumflaskerne blev placeret ved 23°C og substratkoncentrationen blev moniteret ved head-space analyse over en periode på ca. 6 timer.

A.4 Nedbrydningskinetik for MTBE

Til disse forsøg blev der anvendt 120 mL serumflasker, indeholdende 20 mL vækstmedie med biomasse. Efter homogenisering blev biomassekoncentrationen målt som optisk densitet ved 550 nm (OD₅₅₀) og omregnet til koncentration af celleprotein vha. standardkurven for den isobutanoxiderende kultur i bilag C. Serumflaskerne blev herefter lukket med teflonbelagte gummipropper og der blev injiceret 1 mL isobutan, svarende til en væskefasekoncentration på ca. 0,5 mg isobutan/L, svarende til den i afsnit 2.2.3 foreslåede koncentration af isobutan. Flaskerne blev omrystet ved 150 rpm.

Der blev anvendt fem forskellige MTBE-koncentrationer i intervallet 1 til 500 mg/L, jf. tabel D.3 i bilag D.

Serumflaskerne blev placeret ved 23°C og MTBE-koncentrationen blev løbende moniteret ved head-space analyse over en periode på ca. 1 – 7 døgn, afhængigt af koncentrationsniveauet.

A.5 Bestemmelse af maksimale vækstrater

Til disse forsøg blev der anvendt 1 L flasker, indeholdende en tynd biomassesuspension i 250 mL vækstmedie. Flaskerne blev lukket med teflonbelagte gummipropper og tilsat 375 mL propan hhv. isobutan, svarende til væskefasekoncentrationer på ca. 31 mg propan/L og 24 mg isobutan/L. Hver flaske blev ligeledes tilsat 40 mL ren ilt, svarende til at der, inklusiv atmosfærebidraget, til start var omkring 10 mg O₂/L i hver flaske. Flaskerne blev omrystet ved 150 rpm. Der blev placeret en flaske med hver berigelseskultur ved hhv. 23 og 30°C og væksten blev fulgt over ca. 2 – 5 døgn ved, efter grundig omrystning, at udtage en repræsentativ prøvemængde til bestemmelse af OD₅₅₀ gennem en gastæt ventil. Prøverne blev ført tilbage til flaskerne efter endt måling. OD₅₅₀ er omregnet til koncentration af celleprotein vha. standardkurverne i bilag C.

Bilag B: Berigelsesprocedure

Figur B.1:
Skematisk fremstilling af den anvendte berigelsesprocedure.

Bilag C: Biomasse standardkurver (OD₅₅₀ – protein)

Figur C.1:
Standardkurve OD₅₅₀ - protein.

Figur C.2:
Standardkurve OD₅₅₀ - protein.

Figur C.3:
Standardkurve OD₅₅₀ - protein.

Tabel D.1:
Nedbrydningsrater for MTBE ved forskellige koncentrationer af primærsubstrat. Forsøgene er udført ved 23°C over ca. 24 timer med en initialkoncentration af MTBE på 10 mg/L.

OD₅₅₀ blev målt til 0,315 for de propan- og isobutanoxiderende kulturer og til 0,130 for den isopentanoxiderende kultur. Dette svarer til biomassekoncentrationer på hhv. 53, 100 og 23 mg protein/L.

D.2 Nedbrydningskinetik for primærsubstrat

Tabel D.2:
Nedbrydningsrater for propan og isobutan ved forskellige koncentrationer af primærsubstrat. Forsøgene er udført ved 23°C over ca. 6 timer.

D.3 Nedbrydningskinetik for MTBE

Tabel D.3:
Nedbrydningsrater for MTBE ved forskellige koncentrationer af MTBE for den isobutanoxiderende berigelseskultur. Forsøgene er udført ved 23°C og med en initialkoncentration af isobutan på ca. 0,5 mg/L.

D.4 Bestemmelse af maksimale væksthastigheder

Tabel D.4:
Rådata fra vækstforsøg til bestemmelse af maksimale vækstrater for propan- og isobutanoxiderende berigelseskulturer.

Klik Her