| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

MTBE-nedbrydning i grundvand vha. alkanoxiderende mikroorganismer

2. Laboratoriearbejde og resultater

Undersøgte primærsubstrater

I det oprindelige projektoplæg var der lagt op til at undersøge potentialet i en bioreaktor med propanoxiderende mikroorganismer, men på baggrund af resultaterne i et nyere amerikansk studie af Hyman og O’Reilly (1999) blev det, efter de indledende forsøg, besluttet at inddrage to andre alkaner, hhv. isobutan og isopentan, som mulige primærsubstrater.

Forsøg i projektets første fase

For at undersøge om der er teknisk potentiale i at oprense MTBE-forurenet grundvand i en on-site bioreaktor indeholdende en berigelseskultur af propan-, isobutan- eller isopentanoxiderende mikroorganismer blev der i projektets første fase udført følgende laboratorieforsøg:

1. Opformering og screening af berigelseskulturer.
2. Yderligere selektion med iso-alkaner.
3. Nedbrydningskinetik for primærsubstrat.
4. Nedbrydningskinetik for MTBE.
5. Bestemmelse af maksimale væksthastigheder.

Vurdering af teknisk potentiale

De opnåede resultater vil danne grundlag for en vurdering af om det er muligt at tilvejebringe berigelseskulturer med potentiale til at nedbryde MTBE. Resultaterne vil endvidere give et indtryk af hvilke nedbrydningshastigheder, der kan opnås for MTBE samt hvilken tilsætning af substrat, der modsvarer denne MTBE-nedbrydning. Resultaterne kan på denne baggrund give et indledende billede af mulige dimensioner på en on-site bioreaktor i forhold til krav om massefjernelse (% MTBE fjernet).

Laboratorieprocedurer

En række detaljer omkring fremgangsmåden i forbindelse med de gennemførte forsøg er nærmere beskrevet i bilag A.

2.1 Opformering og screening af berigelseskulturer

Denne del af projektet havde til formål at tilvejebringe naturligt forekommende mikroorganismer med potentiale til nedbrydning af MTBE. Proceduren er baseret på et tidligere studie udført ved Afdeling for Miljøteknik, Aalborg Universitet (Heick og Sørensen, 1999). Berigelsesproceduren er gengivet skematisk i figur B.1, bilag B.

2.1.1 Procedure for berigelse og opformering

Tre forskellige berigelseskulturer blev indledende fremelsket ved udtagning af 100 g sphagnumholdig havejord til inkubering ved 23°C i 1 L flasker med gastætte propper. De tre flasker blev tilsat vand, propan og MTBE som specificeret i tabel 2.1. Gasfasen i flaskerne blev udskiftet ca. hver anden uge med frisk atmosfærisk luft og propan.

Tabel 2.1:
Stimulering af berigelseskulturer i jord.

Efter en uge blev 5 mL repræsentativ væskeblanding, efter grundig omrystning, udtaget fra hver flaske og overført til nye 0,5 L flasker med 145 mL frisk vækstmedie. Disse flasker inkuberedes derefter under samme forhold som beskrevet ovenfor. For at sikre tilstrækkelig selektion af de propanoxiderende bakterier blev proceduren gentaget tre gange.

Under selektions- og opformeringsprocessen observeredes der visuelt en betydelig bakterievækst i kulturerne beriget med propan (flaske 1 og 2), mens der kun blev observeret begrænset vækst i kulturen beriget alene med MTBE (flaske 3). Disse indledende observationer vedr. mikroorganismernes vækst stemmer overens med det forventede, da der i litteraturen generelt er observeret betydeligt højere vækstrater for mikroorganismer, der benytter alkaner som primærsubstrat end for mikroorganismer der anvender MTBE som eneste energi- og kulstofkilde; f.eks. (Salanitro et al., 1994; Garnier et al., 1999).

2.1.2 Screening af propanoxiderende kulturer

Til afklaring af hvilken af de afprøvede berigelsesprocedurer, der medfører en bakteriekultur med det største MTBE-nedbrydningspotentiale blev der foretaget en indledende screening af hver kultur. Idet der ikke var sket en nævneværdig vækst i flaske 3, der kun blev beriget med MTBE, blev denne kultur ikke medtaget i screeningen. Kulturen blev fortsat opformeret til screening i projektets fase 2.

Kulturerne blev placeret i serumflasker ved 23°C og MTBE-koncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 75 timer. Den nærmere fremgangsmåde ved screeningen er beskrevet i bilag A.1.

Tabel 2.3 viser de opnåede resultater, herunder MTBE-nedbrydningsrater, for berigelseskulturerne i flaske 1 og 2 samt for parallelle blindtests til dokumentation af, at der ikke skete abiotisk fjernelse af MTBE i serumflaskerne (Blind A og B).

Tabel 2.3:
Screening for berigelseskulturernes MTBE-nedbrydningsrater ved
23°C.

Den lavere tilsætning af isopentan blev valgt på baggrund af et studie af (Garnier et al., 1999), der opnåede maksimal væksthastighed for pentan-oxiderende bakterier ved en koncentration på 0,085 mg pentan/L. Der blev således lavet to forskellige berigelser; én hvor der blev tilsat 4 mL isopentangas (svarende til 0,083 mg isopentan/L) og én hvor der blev tilsat 6 mL isopentangas, jf. tabel 2.4. Der blev observeret kraftigst vækst i kulturen tilsat 6 mL, hvorfor denne berigelse benyttedes til de efterfølgende forsøg.

2.2.2 Screening efter yderligere selektion

Der er udført nedbrydningsforsøg med de tre kulturer, beriget med hhv. propan, isobutan og isopentan, for dels at afgøre hvilket substrat, der medfører det største omsætningspotentiale for MTBE og dels for, om muligt, at fastlægge den optimale tilsætning af primærsubstrat, set i forhold til MTBE-nedbrydning.

Screeningen er udført ved fem forskellige koncentrationsniveauer for hvert primærsubstrat. Kulturerne blev placeret i serumflasker ved 23°C og MTBE-koncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 24 timer. Den nærmere fremgangsmåde ved screeningen er beskrevet i bilag A.2.

MTBE-nedbrydningsraten for de tre berigelseskulturer ved fem forskellige koncentrationer af hvert primærsubstrat fremgår af tabel D.1 i bilag D. Resultaterne er afbildet i figur 2.2.

Figur 2.2:
MTBE-nedbrydningsrate som funktion af primærsubstratkoncentration.

Som det fremgår af figur 2.2 er der observeret ca. 125 til 400% højere nedbrydningsrater for kulturen beriget med isopentan end for de øvrige kulturer. Resultaterne for den isopentanoxiderende kultur tyder således umiddelbart på, at der er et væsentligt potentiale for at benytte dette primærsubstrat ved cometabolisk omsætning af MTBE. Desværre blev der, ved høje koncentrationer af isopentan, observeret delvis opløsning af de tefloncoatede gummipropper, der benyttes til lukning af serumflaskerne. Isopentan er samtidig det af substraterne, der er mindst vandopløseligt og sværest at håndtere i praksis, hvorfor det umiddelbart blev vurderet uegnet til brug i feltapplikationer. Det ligger dog uden for rammerne af nærværende projekt at undersøge om de praktiske problemer med håndteringen af substratet kan løses, hvorfor der ikke blev udført yderligere forsøg med den isopentanberigede kultur.

Som det fremgår af figur 2.2 blev der for kulturen beriget med isobutan observeret MTBE-nedbrydningsrater, der var ca. 30 – 75% højere end for kulturen beriget udelukkende med propan. Da der samtidig ikke er problemer med håndteringen af isobutan blev denne berigelseskultur medtaget i det efterfølgende forsøgsprogram.

For propan og isobutan blev der observeret faldende MTBE-nedbrydningsrater ved øget tilsætning af primærsubstrat, samt maksimale rater uden tilsætning af primærsubstrat. Dette indikerer umiddelbart, at der er tale om en form for substratinhibering mellem primærsubstrat og cosubstrat (MTBE), hvor primærsubstrat og cosubstrat kæmper om et endeligt antal enzymer. Det vurderes dog, at raterne opnået uden tilsætning af primærsubstrat ikke kan opretholdes over længere perioder, idet der kræves en vis mængde substrat for at dække mikroorganismernes energibehov til basalmetabolisme samt opretholdelse af deres enzymsystem.

I forhold til optimal tilsætning af primærsubstrat er der stort set observeret uændrede MTBE-nedbrydningsrater for de to kulturer indenfor en faktor 10 af substratkoncentration, jf. figur 2.2. MTBE-nedbrydningsraten for den propanoxiderende berigelseskultur er således stort set uændret i koncentrationsintervallet 0,06 – 0,6 mg propan/L, mens raten for den isobutanoxiderende kultur stort set er uændret i koncentrationsintervallet 0,05 – 0,5 mg isobutan/L. På baggrund af de foreliggende resultater kan det ikke afgøres, hvor i koncentrationsintervallet der opnås den optimale afvejning mellem opretholdelse af enzymaktiviteten og substratinhibering, hvorfor denne problemstilling vil blive forsøgt nærmere afdækket i projektets fase 2.

På baggrund af resultaterne vist i figur 2.2 samt ovenstående, blev det valgt at benytte substratkoncentrationer på ca. 0,6 mg propan/L og 0,5 mg isobutan/L, i forhold til en optimal omsætningsrate af MTBE samt opretholdelse af mikroorganismernes enzymaktivitet. Der observeredes ved disse substratkoncentrationer MTBE-nedbrydningsrater på 10,1 og 15,7 mg MTBE/(g protein·time) for hhv. den propan- og den isobutanoxiderende kultur, jf. tabel D.1 i bilag D. Begge rater er observeret ved 23°C og en initialkoncentration af MTBE på ca. 10 mg MTBE/L.

2.3 Nedbrydningskinetik for primærsubstrat

Da en given bioreaktor i princippet kan køres ved forskellige primærsubstratkoncentrationer og da omsætningshastigheden, og dermed den nødvendige tilsætning, for primærsubstratet afhænger af koncentrationsniveauet, blev der udført forsøg til bestemmelse af nedbrydningskinetik for primærsubstraterne propan og isobutan.

Nedbrydningskinetikken for substraterne kan beskrives vha. Michaelis-Menten relationen, ligning 2.1:

(2.1)

hvor S er substratkoncentrationen [mg substrat/L], v er den aktuelle substratomsætningshastighed [mg substrat/(g protein·time)], v_max er den maksimale omsætningshastighed [mg substrat/(g protein·time)] og K_m er halvmætningskonstanten [mg substrat/L], dvs. den substratkoncentration, hvor der opnås 0,5·v_max.

Substratomsætningsraten blev bestemt ved 11 propankoncentrationer og ved 9 isobutankoncentrationer. Kulturerne blev placeret i serumflasker ved 23°C og substratkoncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 6 timer. Den nærmere fremgangsmåde ved forsøget er beskrevet i bilag A.3.

Nedbrydningsraterne for de to berigelseskulturer ved de forskellige koncentrationer af primærsubstrat fremgår af tabel D.2 i bilag D. Resultaterne fremgår grafisk af figur 2.3, sammen med ligning 2.1 fittet til resultaterne. Raterne ved de to højeste propankoncentrationer (hvor der var størst overtryk i serumflaskerne) er ikke medtaget idet propperne i disse flasker blev konstateret utætte efter gentagne kanylestik. Da der således, udover den biologiske omsætning, er sket en abiotisk substratfjernelse blev de tilsyneladende nedbrydningsrater i disse flasker kunstigt høje.

Figur 2.3:
Michaelis-Menten kurver til beskrivelse af omsætningen af propan og isobutan.

Ved fitningen af ligning 2.1 til de opnåede resultater, jf. figur 2.3, beskriver Michaelis-Menten relationerne givet ved ligning 2.2 og 2.3, altså substratomsætningshastigheden som funktion af substratkoncentrationen for hhv. propan og isobutan.

        (2.2)

  (2.3)

Ved de benyttede primærsubstratkoncentrationer på hhv. ca. 0,6 mg propan/L og 0,5 mg isobutan/L, jf. afsnit 2.2.2, kan der vha. ligning 2.2 og 2.3 beregnes omsætningshastigheder for primærsubstraterne på hhv. ca. 25,3 og 36,1 mg substrat/(g protein·time). Disse rater er fundet ved 23°C.

2.4 Nedbrydningskinetik for MTBE

For at kunne udføre såvel hydraulisk som biologisk dimensionering af en bioreaktor til en given rensningsopgave; herunder for at kunne designe reaktoren, så den kan leve op til givne krav til oprensningsniveau (mg/L i udløb) og rensningsgrad (% massefjernelse), er det nødvendigt at have en god bestemmelse af berigelseskulturens nedbrydningskinetik for MTBE.

Ved tidligere forsøg udført på Aalborg Universitet, (Heick og Sørensen, 1999), blev der fundet v_max og K_m værdier for en berigelseskultur af propanoxiderende bakterier på hhv. ca. 43 mg MTBE/(g protein·time) og 142 mg MTBE/L ved ca. 0,6 mg propan/L og 23°C.

I den første fase af nærværende projekt blev der derfor ikke udført forsøg til bestemmelse af Michaelis-Menten parametrene for den propanoxiderende berigelseskultur, da det blev vurderet mere relevant at opnå parametre for den isobutanberigede kultur, der kunne danne grundlag for en sammenligning af de to kulturer.

MTBE-nedbrydningsraten blev bestemt ved fem forskellige MTBE-koncentrationer. Kulturerne blev placeret i serumflasker ved 23°C og MTBE-koncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 1 – 7 døgn. Den nærmere fremgangsmåde ved forsøget er beskrevet i bilag A.4.

Nedbrydningsraterne ved de forskellige koncentrationer af MTBE fremgår af tabel D.3 i bilag D. Resultaterne fremgår grafisk af figur 2.4, sammen med ligning 2.1, fittet til resultaterne.

Figur 2.4:
Michaelis-Menten kurve for nedbrydning af MTBE vha. den isobutanberigede bakteriekultur.

Som det fremgår af figur 2.4 er der bestemt en halvmætningskonstant, K_m, på 128 mg MTBE/L og en maksimal MTBE-nedbrydningsrate, v_max, på 7,3 mg MTBE/(g protein·time).

Det bemærkes, at den fundne v_max ligger væsentligt under den i afsnit 2.2.2 bestemte rate. Her blev nedbrydningsraten således bestemt til 15,7 mg MTBE/(g protein·time) ved samme koncentration af isobutan (ca. 0,5 mg/L) og ved 10 mg MTBE/L. Dette forhold tilskrives, at en del af biomassen under automatisk omrystning adsorberede til tørre områder af glasvæggen i forsøgsflaskerne og dermed ikke var i god kontakt med opløsningen. Under den indledende screening blev flaskerne rystet manuelt med jævne mellemrum, hvorved dette problem kunne undgås.

I de følgende beregninger tages der udgangspunkt i den MTBE-nedbrydningsrate på 15,7 mg MTBE/(g protein·time), der blev bestemt under den indledende substratscreening, jf. afsnit 2.2.2.

Den fundne K_m-værdi på 128 mg MTBE/L kan antages at være repræsentativ for berigelseskulturen under forudsætning af, at andelen af adsorberet biomasse var ens i de fem forsøgsflasker, der ligger til grund for resultaterne i figur 2.4. Dette skyldes, at K_m, i modsætning til v_max, er en bakteriespecifik parameter, der ikke afhænger af biomassens absolutte størrelse. Til sammenligning med den fundne K_m-værdi på 128 mg/L opnåede (Heick og Sørensen, 1999) en K_m-værdi på 142 mg/L for en berigelseskultur af propanoxiderende bakterier. I litteraturen er der angivet et generelt niveau for K_m på ca. 80 – 210 mg/L, ved cometabolisk omsætning af MTBE vha. forskellige alkanoxiderende bakterier (f.eks. Hyman et al., 1998; Garnier et al., 1999). Samlet vurderes det således, at den opnåede K_m-værdi ligger forholdsvis tæt på den "sande" K_m-værdi for berigelseskulturen.

Hvis det antages, at den ovenfor bestemte K_m-værdi på 128 mg MTBE/L er repræsentativ for den isobutanoxiderende kultur og, hvis MTBE-nedbrydningsraten (ved 10 mg MTBE/L) på 15,7 mg MTBE/(g protein·time), jf. afsnit 2.2.2, benyttes, kan der vha. ligning 2.1 beregnes en v_max-værdi på ca. 217 mg MTBE/(g protein·time).

Hvis det for den propanoxiderende kultur tilsvarende antages, at K_m-værdien på 142 mg MTBE/L er repræsentativ for kulturen, og hvis MTBE-nedbrydningsraten (ved 10 mg MTBE/L) på 10,1 mg MTBE/(g protein·time), jf. afsnit 2.2.2, benyttes, kan der vha. ligning 2.1 beregnes en v_max-værdi på ca. 152 mg MTBE/(g protein·time).

På baggrund af ovenstående forudsætninger kan der opstilles Michaelis-Menten relationer til beskrivelse af MTBE-nedbrydningsraten som funktion af MTBE-koncentrationen for hhv. den propan- og den isobutanoxiderende berigelseskultur; ligning 2.4 og 2.5.

   (2.4)

  (2.5)

hvor S_MTBE er MTBE-koncentrationen i væskefasen [mg MTBE/L] og v_MTBE er MTBE-nedbrydningsraten [mg MTBE/(g protein·time)].

Hvis forudsætningerne holder har den isobutanberigede kultur altså ca. 40% højere maksimalt nedbrydningspotentiale for MTBE end den propanberigede kultur.

Det foreliggende datagrundlag vurderes dog ikke at være tilstrækkeligt som redskab ved dimensionering af on-site rensningsløsninger, hvorfor forsøget til fastlæggelse af Michaelis-Menten kinetikken for den isobutanoxiderende kultur gentages i projektets fase 2, sammen med et tilsvarende forsøg for den propanoxiderende kultur.

2.5 Bestemmelse af maksimale væksthastigheder

Opretholdelse af ønsket biomassekoncentration

For at afklare om det er realistisk at opretholde en ønsket biomassekoncentration, under drift af en given bioreaktor, ved mikrobiel vækst alene, blev der udført forsøg til bestemmelse af de maksimale væksthastigheder for den propan- og den isobutanoxiderende berigelseskultur. Det er således undersøgt om bakterierne kan vokse hurtigt nok til ikke at blive skyllet ud, eller om der kræves en enhed til tilbageholdelse af biomasse i forbindelse med reaktordriften.

Fremgangsmåde

Den maksimale specifikke væksthastighed blev for hver af de to berigelseskulturer bestemt ved to forskellige temperaturer (23 og 30°C). Kulturerne blev tilsat substrat og ilt i overskud og biomassekoncentrationen blev moniteret over en periode på ca. 2 – 5 døgn. Den nærmere fremgangsmåde ved forsøget er beskrevet i bilag A.5.

Resultater

Biomassekoncentrationerne som funktion af tiden fremgår af tabel D.4 i bilag D. Resultaterne for de udførte forsøg ved hhv. 23 og 30°C er afbildet i figur 2.5.

Figur 2.5:
Vækstkurver for propan- og isobutanoxiderende berigelseskulturer ved 23 og 30°C.

Vækstrater

Som det fremgår af figur 2.5 er der fundet vækstrater for de to berigelseskulturer på ca. 0,5 – 1,2 d^-1 ved 23 – 30°C. Disse rater ligger umiddelbart i den lave ende af det der i litteraturen er rapporteret for alkanoxiderende bakterier, men i den høje ende af værdier rapporteret for bakterier, der gror udelukkende på MTBE. Typiske vækstrater for alkanoxiderende bakterier ved 20 – 30°C ligger således i intervallet 1,1 – 4,6 d^-1 (Heick og Sørensen, 1999; Garnier et al., 1999), mens vækstrater for rene MTBE-nedbrydere tilsvarende ligger i intervallet <0,01 – 1,45 d^-1 (Salanitro et al., 1994; Park og Cowan, 1997).

Hydraulisk opholdstid; tilbageholdelse af biomasse påkrævet

Hvis biomassekoncentrationen i en reaktor skal kunne opretholdes ved vækst alene kan det, på baggrund af de observerede vækstrater, konkluderes, at der kræves hydrauliske opholdstider på mindst 20 timer. Dette er vel at mærke ved 30°C og høje substratkoncentrationer, der ikke er ønskelige i forhold til en effektiv MTBE-nedbrydning, jf. figur 2.2. Væksten ved 10°C må endvidere forventes at være ca. 4 – 10 gange mindre end ved 30°C, hvorved de påkrævede hydrauliske opholdstider tilsvarende vil blive 4 – 10 gange større. En afværgepumpning på 1 m³/time ville således skulle matches af en reaktor på minimum 80 m³, hvilket vurderes at være urealistisk i forhold til on-site anvendelse af teknologien. Det er således nødvendigt med en form for tilbageholdelse af biomassen i den kontinuerte bioreaktor, f.eks. ved membranfiltrering og recirkulation, som angivet af (Pitre og Steffan, 1997).