| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Substitution af biocider i bundmaling til skibe med enzymer

11 Udvaskning af enzym

For at bestemme enzymets udvaskningshastighed fra en malingfilm er der udført målinger af enzymaktivitet i udvaskningsvæske fra nogle neddypningsforsøg med 4 forskellige malingssystemer. Et antal pipetter blev påført maling ved at dyppe pipetten i maling. Efter 1 døgns tørring er de enkelte pipetter neddyppet i buffer.

Enzymaktiviteten i udvaskningsbufferen blev herefter målt for at undersøge, hvor meget af det aktive enzym der er udvasket. Efter et døgns udvaskning udtages der 2,5 ml ”udvaskningsbuffer” fra hvert reagensglas og enzymaktiviteten måles spektrofotometrisk . Samtidig bliver pipetterne dyppet i 4 ml ”ren” ny buffer. Man skifter bufferen med intervaller fra 1 dag til 1 uge for at have mulighed for at måle den enzymmængde, som bliver udvasket . I starten skiftes der buffer daglig, fordi udvaskningen er størst i begyndelsen. De spektrofotometriske målinger fortsættes indtil der ikke længere kan måles enzymaktivitet i udvaskningsbufferen.

Parallelt er også målt proteinkoncentration i udvaskningsbufferen. Proteinmålingen udføres på 500 µl af den samme udvaskningsvæske, som der bruges til enzymaktivitetsmålingen, med den forskel at der måles proteinindhold i stedet for enzymaktivitet.

11.1 Enzymaktivitet ved udvaskning – referencekurve

Der er udført måling af enzymaktivitet ved kendte enzymkoncentrationer for at kunne lave en referencekurve indenfor det ifølge analysemetodens optimale måleområde. I figur 12.1 er enzymaktiviteten afsat som funktion af absorbans. Der er udført en lineær regression indenfor måleområdet og en beregning af tilpasning. Denne referencekurve blev anvendt til den første serie udvaskningsforsøg.

Figur 12.1 Enzym aktivitet - Referencekurve

Da referencekurven dækkede et relativt lille måleområde for absorbans, blev referencemålingerne udvidet med en måling med høj enzymkoncentration. Desværre er referencekurven ikke lineær i hele området, hvilket betyder at måleresultaterne teoretisk set svarer til et polynom. Forenklet set kan man også betragte referencekurven som en lineær regression over hele område. Dette valg giver en lidt større usikkerhed. Dog kan det konstateres at tilpasningen for regressionen stadig er god, hvilket må betyde at den beregnede enzymaktivitet giver et rimeligt skøn af udludningens størrelsesorden. I figur 12.2 kan referencekurven ses. Denne referencekurve er anvendt til den anden serie forsøg.

Figur 12.2 Enzym aktivitet - Referencekurve

11.2 Proteinindhold ved udvaskning – referencekurve

Der er udført måling af proteinindhold på kendte proteinkoncentrationer for at kunne lave en referencekurve. I figur 12.3 er koncentrationen af protein afsat som funktion af absorbans. Der er lavet en lineær regression indenfor måleområdet og en beregning af tilpasning.

Figur 12.3 Protein referencekurve

11.3 Indledende måling af enzymaktivitet og protein i udvaskningsbuffer

Der er udført målinger på udvasket enzym i udvaskningsbuffer for fire malingssystemer ved hjælp af enzymaktivitet og protein målinger. Malingerne er tilsat 5 % enzymopløsning (protease, glucoamylase og xylanase). Ved udførelse af analysen var der nogen variation mellem den mængde maling der påføres den enkelte pipette. Udvaskningsbufferen er skiftet med passende mellemrum og der er målt enzymaktivitet og proteinindhold på bufferprøverne. Malingsfilmene har henstået 11 dage hvorefter udvaskningen i buffer er påbegyndt. Forsøget blev stoppet efter 3 døgn, da de målte absorbanser (E) på dette tidspunkt var meget små. Ved hjælp af referencekurverne kan enzymaktivitet respektive proteinindhold i udvaskningsbufferen beregnes på baggrund af absorbansen. Når absorbansen bliver for lav kan enzymaktiviteten ikke beregnes, da resultatet ligger udenfor referencekurven. Proteinindholdet kan beregnes selvom absorbansen er lav da referencekurven går igennem 0.

Resultatet viser at den opløsningsmiddelbaserede maling afgiver væsentlig mindre mængde enzym/protein end de vandfortyndbare produkter. Endvidere kan det konkluderes at udludningen af enzym ser ud til at stagnere på en lav afgivelse efter de første par døgn. De indledende forsøg er beskrevet i bilag C.

For at sikre resultaternes validitet er der udført yderligere kontrolmåling på den opløsningsmiddelbaserede maling, men i fire forskellige formuleringer. Endvidere var der behov for at måle udludning over et længere tidsrum for at se om udludningshastigheden bliver konstant og for at undgå for lav absorbans. Dette betyder at eksponeringstiden i buffer må ændres efterhånden som udludningshastigheden bliver lavere.

11.4 Måling af vandoptagelse

Der er på baggrund af de indledende analyser udvalgt ét malingssystem til de videre undersøgelser. Malingssystemet er det opløsningsmiddelbaserede F5, hvor vandoptagelsen er minimeret. Hertil kommer at det samlede tørstofindhold er varieret.

Endvidere er en del af titandioxyden skiftet ud med zinksulfid der formodes at have en algicid virkning. Dette pigment har været anvendt i mange år i forskellige sammenhænge blandt andet også i forbindelse med fødevareemballage (FDA godkendt).

F5.8 har en pigmentvolumen-koncentration (PVK) på 44%. F5.9 svarer til den tidligere brugte F5 med en PVK på 53%. F5.10 indeholder zinksulfid og har en PVK på 52 %. F5.11 indeholder ligeledes zinksulfid og har en PVK på 43%. De fire malinger F5.8-F5.11 er formuleret udfra en betragtning om at opnå forskellig vandoptagelse. Der er tilsat enzym i produkterne inden påføring og test af vandoptag.

De fire malinger har forskellig vandoptagelse i marint saltvand, hvor PVK ser ud til at bestemme vandoptaget. Se figur 12.4. Faktisk giver den høje PVK et lavere vandoptag. Dette må betyde at når binderandelen bliver større kan malingsfilmen optage mere vand.

Figur 12.4 Vandoptagelse i malingfilm

11.5 Måling af enzymaktivitet i udvaskningsbuffer

Der er tilsat 5 % enzymopløsning, hvor kun protease (3%) og glucoamylase (2%) er anvendt.

I tabel 12.1 kan de på pipetterne påførte mængder maling og de målte absorbanser (E) ses. Absorbansen er målt efter forskellige udludningstider, hvilket også ses i tabel 12.1, hvor absorbansen (E) angives med det antal døgn som eksponeringen er udført i. For at få den samlede eksponeringstid skal antallet af døgn lægges sammen. Målingerne er stoppet efter en samlet eksponeringstid på 59 døgn, da der begyndte at optræde blærer i malingsfilmen. Dette skyldes formentlig bufferens pH.

En reduceret PVK kan direkte ses som en reduceret absorbans. Med andre ord en mindre udvaskning af enzym (Alcalase). Samtidig bør det bemærkes at reduceret PVK betyder lavere viskositet (et tyndere produkt) og en mindre lagtykkelse, hvilket betyder lavere enzymmængde. Faktisk er der også forskel på om malingen indeholder zinksulfid eller ej. Dog er forskellen ikke ret stor når PVK er på det høje niveau.

Det skal bemærkes at den nye referencekurve kun er brugt til prøve F5.9 og F5.10, da de målte absorbanser her er høje. Til de to andre prøver er en lineær regression nede i det lave lineære område anvendt.

På grund af den store datamængde er de beregnede resultater vist i to tabeller, hvor tabel 12.2 indeholder den beregnede enzymaktivitet og den udvaskede mængde ”enzymopløsning” i mg og tabel 12.3 viser mængden Alcalase i malingsfilmen.

I tabel 12.2 kan det ses at absorbanserne for to af malingsfilmene er meget små. Når måleresultatet er udenfor referenceområdet kan den beregnede enzymaktivitet blive negativ. Dette kan betragtes som at udludningen er så lav at måleresultatet er et udtryk for metodens usikkerhed.

I tabel 12.2-12.3 kan det ses at udvaskningen er under usikkerheden for målingerne for en af prøverne. Der er en prøve der giver en meget lav udvaskning og to prøver der udviser en tydelig udvaskning af Alcalase.

Resultaterne fra tabel 12.3 kan ses i figur 12.5, hvor forskellen mellem de fire malinger er vist. Prøve F5.8 og F5.11 har begge lav PVK, hvilket ser ud til at begrænse udvaskningen af enzym hvor F5.9 og F5.10 med den høje PVK giver en væsentligt større udvaskning specielt de første døgn. Ved sammenligning af F5.9 efter 3 døgns eksponering med målingen af enzymaktivitet for F5 i den første serie målinger kan de konstateres at være af den samme størrelsesorden.

Figur 12.5 Enzymaktivitet i malingfilm

I de videre beregninger er F5.8 og F5.11 udelukket da usikkerheden er for stor. Tabel 12.4 viser ændringen i mængde enzym produkt i malingsfilmen.

For at kunne ekstrapolere udvaskningen af Alcalase produkt over længere tid er der lavet en regression. Figur 12.6 viser hvordan Alcalase produktet udvaskes med tiden, hvor en logaritmisk regression giver en god tilpasning.

Figur 12.6 Udvaskning af Alcalase produkt

Ved at anvende regressionerne kan mængden Alcalase produkt der udvaskes beregnes i mg/m²/24 timer. Resultatet kan ses i figur 12.7, hvor de ekstrapolerede værdier viser at udvaskningen langsomt reduceres med tiden. Efter 3 måneder er den af størrelsesorden 50 mg/m²/24 timer, og reduceres stadig.

Figure 12.7 Udvaskning af Alcalase produkt

11.6 Måling af protein i udvaskningsbuffer

Da enzymaktivitetsmålingen alene er udtryk for udvaskningen af Alcalase er der også her målt udvaskning af protein, der er et udtryk for den samlede enzymudvaskning. I tabel 12.5 er den påførte mængde på pipetterne, den samlede mængde enzymopløsning og den målte absorbans (E) angivet.

Ved hjælp af referencekurven beregnes proteinindholdet i udvaskningsbufferen på baggrund af absorbansen. Herefter beregnes mængde udvasket enzym/protein i mg. De beregnede resultater findes i tabel 12.6.

Det konstateres at den største udvaskning sker fra prøve F5.8, hvilket er en prøve med lav PVK. Prøverne med høj PVK afgiver en mindre mængde enzym (protein). Målingen efter 3 døgns eksponering for F5.9 er af nogenlunde samme størrelsesorden som for F5 i den første serie målinger af enzymudvaskning (protein).

I figur 12.8 kan det tydeligt ses at F5.8 med lav PVK udviser en hurtig udvaskning af protein i de første døgn og at udvaskningen herefter formentlig går ned på et mere konstant niveau. De andre malinger udviser en lavere udvaskning af protein i starten af udvaskningsforløbet.

Figur 12.8 Mængde protein udvasket fra malingfilm

Da Alcalase udvaskningen kunne udtrykkes som logaritmiske regressioner, er den samme metode testet her. Resultatet for regressionsanalysen kan ses i tabel 12.7 .

Ved at anvende ligningerne i tabel 12.7 kan protein udvaskningen evalueres. Resultatet kan ses i figur 12.9 hvor det kan ses at udvaskningen af protein efter 2 måneder er meget lav.

Figur 12.7. Udvaskning af protein

11.7 Samlet vurdering af udvaskning af enzym

For at få et bedre overblik over sammenhæng mellem de opnåede resultater for 2. serie er der lavet en tabel med nøgledata, tabel 12.8. Umiddelbart kan det konstateres at der har været stor forskel i tykkelse af malingslaget ved udvaskningsforsøgene. Denne forskel burde ikke have nogen større betydning for resultaterne i starten af udvaskningsforløbet, da arealet og transporten af enzym til overfladen må være de vigtigste parametre. Hertil kommer at når malingen påføres ved dypning vil det være nødvendig at påføre flere gange hvis en bestemt lagtykkelse skal sikres eller også skal malingen påføres ved samme viskositet.

Der ser ud til at være en sammenhæng mellem udvaskning af protein og vandoptagelse i malingsfilmen, hvor et større vandoptag fremmer udvaskningen. Ved måling af udvaskning af Alcalase er resultatet mere usikkert. Det lader til at de målte mængder Alcalase er for lave for to af malingerne, mens proteinmålingen tilsyneladende viser en større udvaskning. Dette kunne tyde på at eksponeringsintervallerne burde være længere for disse to formuleringer ved måling af enzymaktivitet. Faktisk er det en eksperimentel vanskelighed at enzymaktivitetsmålingen bør foregå indenfor et snævert koncentrationsinterval, hvilket betyder at eksponeringsintervallet skal tilpasses dette.

Der er kun foretaget proteinmålinger i 15. døgn, og i dette tidsrum er der ikke opnået en konstant hastighed med hensyn til udvaskning. Det kan dog konstateres at når den første hurtige udvaskning er overstået, bliver udvaskningsforløbet mere parallelt for alle fire prøver.

Enzymaktiviteten aftager stadig efter 31 døgn. Dette kan tolkes som at enzymets transporthastighed til overfladen har betydning for hastigheden hvormed enzymet udludes. Dette kan få betydning for enzymets langtidseffekt.

I den første serie målinger (initialt) ser der ud til at være en sammenhæng mellem udvaskning af Alcalase kontra udvaskning af samlet mængde enzym for de fire testede malinger (1 opløsningsmiddelbaseret og 3 vandfortyndbare), hvilket ikke kan konkluderes i nr. 2 måleserie med 4 varianter af den opløsningsmiddelbaserede maling. Samtidig må det konstateres at i den første serie var PVK høj for alle prøver.

Ved måling af enzymaktivitet fås ingen udvaskning af Alcalase i F5.8 og F5.11, men måler man på protein fås en hurtig udvaskning i starten af eksponeringen for F5.8 og F5.11. Dette kan skyldes problemstillingen omkring enzymaktivitetsbestemmelsen (Alcalase) er usikker i det lave koncentrationsområde. Man kan heller ikke udelukke at udvaskningshastigheden for de forskellige enzymer kan være forskellig eller at de forskellige enzymer har forskellig affinitet til pigment respektive binder.

Alcalase analysen antyder at efter 3 måneder er udvaskningen reduceret kraftigt. Om enzymet har den ønskede antibegroningseffekt må således afhænge af om transporten af enzym til overfladen er tilstrækkelig. De målte værdier for enzymaktivitet for F.8 og F.11 bør ikke tillægges alt for stor værdi, da enzymaktiviteten er meget lav og absorbanserne ligger under det optimale måleområde ifølge referencekurven, hvilket betyder at analyseusikkerheden bliver stor.

Tabel 12.8 Sammenligning af vandoptagelse og udvaskning af Alcalase.

Klik her for at se tabellen.

Det kan konkluderes at begge former for enzymanalyser fungerer rimeligt, men at der ikke nødvendigvis er umiddelbar sammenhæng mellem de to typer af udvaskningsresultater.

Endelig er erfaringen med analyse af enzymaktivitet og proteinudvaskning at det bør overvejes at videreudvikle målemetoderne, hvor et større veldefineret areal af maling eksponeres i en større mængde buffer. Resultaterne er dog tilstrækkelige til at vurdere størrelsesorden for udvaskningen af Alcalase og protein fra malingsfilm.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 April 2004, © Miljøstyrelsen.