| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Hudoptagelse af pesticider - betydning af lag-time og reservoir-effekt

1 Indledning

• 1.1 Baggrund
• 1.2 Metode
• 1.3 In vitro model
• 1.4 Eksperimentelt design
• 1.5 Variabilitet og statistik
• 1.6 Kemiske analyser
• 1.7 Delstudier
  • 1.7.1 Opløselighedskarakteristikas betydning for absorptionen
  • 1.7.2 Betydning af afvaskning og let hudbeskadigelse for penetration
• 1.8 Relevans
• 1.9 Internationale samarbejdspartnere

Mange års forebyggende indsats for at nedbringe luftvejseksponeringen for bekæmpelsesmidler i gartneri og landbrug betyder, at hudeksponering nu er dominerende (Archibald et al. 1994, Benford et al. 1999), selvom utilsigtet oral eksponering i enkelttilfælde også kan være betydende. Afhængig af pesticid vil aktivstoffet kunne genfindes på planter og jord i kortere eller længere tid efter udbringning. Eksponeringen sker hyppigst under re-entry aktiviteter, hvor planter håndteres kort tid efter, at de er blevet behandlet med pesticider. Selve absorptionen gennem huden er en flertrins passiv diffusions-proces. Nyere undersøgelser med få modelstoffer indikerer, at absorptionshastigheden blandt andet bestemmes af pesticidernes opløselighed, tilstedeværelsen af hjælpestoffer samt hudens beskyttelsesevne (Brand and Mueller 2002, Nielsen 2004, Nielsen et al. 2004). Miljøstyrelsens nuværende forvaltning af godkendelsesprocedurer for pesticider tager ikke højde for ændringer i hjælpestoffer til allerede godkendte salgsprodukter, midlertidig deponering i overhuden eller, at huden hos de eksponerede ikke altid er intakt. Der er derfor ikke alene et grundvidenskabeligt sigte med dette projekt i forhold til afdækning af faktorer af betydning for pesticiders passage af huden, men også klare regulerings- og forebyggelsesmæssige aspekter i forhold til Miljøstyrelsens rådgivning og regelsætning.

Projektet har følgende formål:

1. Gennem anvendelse af en række modelstoffer at fastlægge et interval i forhold til lipofilicitet, hvor den mest effektive absorption kan forventes.
2. At beskrive den betydning den midlertidige ophobning i huden (reservoir-effekten) har i forhold til en forsinket absorption efter eksponeringsophør.
3. At vurdere hvorvidt man ved afvaskning efter endt eksponering kan fjerne en del af det på huden deponerede pesticid eller, om det fortsat skal henregnes som absorberet.
4. At vurdere den betydning en lettere beskadiget hud har for såvel absorption som midlertidig ophobning i huden.

1.1 Baggrund

Viden om pesticiders hudabsorption er fortsat begrænset, og offentligt tilgængelige undersøgelser har hidtil primært fokuseret på udvalgte aktivstoffernes penetrationsevne (Dick et al. 1997, Nielsen and Nielsen 2000, Cnubben et al. 2002, Nielsen et al. 2004). Virkeligheden er imidlertid, at de produkter, som man eksponeres for, er blandingsprodukter, der ud over aktivstoffer indeholder en række bærestoffer, fortykningsmidler, dispergeringsmidler og blødgørere; stoffer der under ét betegnes detergenter eller hjælpestoffer. Som en konsekvens af disse forhold foreskriver de seneste EU-guidelines for evaluering af hudpenetration og dermal toksicitet (EC Directive 91/414) da også testning af såvel aktivstoffer som salgsprodukt.

Et tidligere gennemført forskningsprojekt ved Miljømedicin i Odense har dokumenteret betydningen af disse hjælpestoffer for hudpenetrationen af aktivstoffer (Nielsen 2004). Således øges den samlede absorption for to undersøgte pesticider, når de administreres i deres salgsformuleringer. Mest betydende er dog den markante nedsættelse af lag-time, hvilket er tiden fra eksponeringsstart til at man kan måle pesticidet på undersiden af huden. Betydningen af lag-time kan illustreres ved nedenstående figur (Figur 1), der viser penetrationen af et modelstof i to forskellige formuleringer (forskellige hjælpestoffer) med samme totale penetration men klart forskellige lag-time og flux.

Manglende kendskab til lag-time vanskeliggør en relevant rådgivning i forhold til biologisk monitorering med blodprøver, hvor man risikerer at underestimere eller helt overse en igangværende eller nylig eksponering. En lag-time på fx 4 timer er således ikke et udtryk for, at stoffet sidder på hudoverfladen i 4 timer, før diffusionen gennem huden begynder, men et udtryk for at absorptionsprocessen gennem huden tager tid og er stofafhængig. Den passive absorption er således en flertrins-proces, hvor man initialt vil se en absorption fra den ofte hydrofile donorfase over huden, efterfulgt af en diffusion gennem huden med mulig midlertidig deponering (en reservoir-effekt) og afsluttende med en diffusion ud af huden til en receptor.

Figur 1. Teoretiske penetrationskurver for to stoffer med identisk totalpenetration efter 6 timer, men forskellig lag-time og flux.

Den passive diffusion fra den oftest hydrofile donor og ind i huden begunstiges af en vis grad af lipofilicitet. Dette er vist i et netop afsluttet EU-projekt ved Miljømedicin i Odense (Nielsen et al. 2004). Her observeredes for det meget hydrofile pesticid dimethoat kun en meget begrænset penetration, medens hovedparten af den administrerede dimethoat genfindes i donorvæsken ved forsøgsafslutning. Når et stof er trængt ind i huden, skal det videre til den generelle cirkulation, hvilket indebærer diffusion fra et lipofilt miljø i huden til en overvejende hydrofil modtager. I den eksperimentelle model svarer det til diffusionen fra huden og ned i receptorvæsken. Denne diffusion faciliteres af en ikke for høj lipofilicitet, idet en sådan vil betinge, at stoffet vil have en klar præference for at blive i huden. Det er sandsynligvis denne effekt, der ses ved forsøg med pesticidet prochloraz, hvor man trods høj lipofilicitet ikke genfinder betydende mængder pesticid i receptorvæsken (Nielsen 2004). Analog med denne konklusion beskriver også Brand og Mueller (2002), at de i en undersøgelse af tre pesticider observerer, at det mest lipofile pesticid har den dårligste penetration, men den største akkumulering i stratum corneum. De gennemførte undersøgelser indikerer således, at både en for høj og en for lav lipofilicitet begrænser hudpenetrationen af pesticider. Det første delmål i dette projekt bliver gennem anvendelse af en række pesticider/modelstoffer at fastlægge et interval i forhold til lipofilicitet, hvor den mest effektive absorption kan forventes. Dette vil samtidig indikere, hvilke pesticider der grundet deres lipofilicitet absorberes i mindre grad.

Eksperimenter med lettere beskadiget hud har vist, at beskadigelsen primært har effekt på passagen fra donor og ind i huden (Nielsen 2004). Dette ses tydeligt ved markant ændrede penetrationsforhold for det meget hydrofile pesticid dimethoat (Nielsen 2004). Man må her forholde sig til, at en beskadiget hud potentielt giver anledning til en øget ophobning af stof i huden (reservoir effekt). Reservoir effekten er tidligere blevet diskuteret (Cnubben et al. 2002) og anvendt som en del af forklaringen på det forskellige penetrationsmønster for hydrofile og lipofile stoffer. Betydningen af denne deponering, og hvorvidt den vil lede til en øget men forsinket penetration, er hidtil kun meget sparsomt belyst. En undersøgelse af betydningen af opløselighed for reservoir-effekten indebærer en analyse af den mængde stof, der persisterer i huden ved eksponerings- og forsøgsophør, og som efterfølgende fortsat vil kunne absorberes. En enkelt helt ny undersøgelse i rotter har vist, at man ved testning af 19 forskellige pesticider observerede en fortsat absorption efter, at pesticiderne var vasket af huden for 17 af de 19 stoffer (Zendzian 2003). Den fortsatte penetration af disse stoffer gav imidlertid i kun halvdelen af tilfældene anledning til en forøget systemisk koncentration (Zendzian 2003), hvilket sandsynligvis er betinget af rotters hurtige metabolisme. Da betydelige forskelle eksisterer mellem penetration gennem rottehud og human hud, er der et påtrængende behov for at få denne problemstilling belyst i en eksperimentel human model. Det andet delmål i dette projekt er derfor at beskrive den betydning, som den midlertidige ophobning i huden (reservoir-effekten) har i forhold til en forsinket absorption efter eksponeringsophør. Fokus vil her være kortere eksponeringstider og inddragelse af også lettere beskadiget hud, idet man herved kommer nærmere virkelighedens eksponeringsforhold.

Arbejdsmiljømæssigt har fundene væsentlig betydning, idet hudbarrieren hos mange arbejdstagere og måske gartneriarbejdere mere specifikt ofte er kompromitteret grundet fysisk sår, rifter og/eller vådt arbejde. Det betyder, at regulering på basis af undersøgelser med intakt hud skal overvejes kritisk, idet man risikerer at underestimere den reelle absorption. Det vil her være væsentligt at vide, om det er ved de mest lipofile stoffer eller de mest hydrofile stoffer, at man begår den største fejl ved ikke at tage højde for, at den almindelige arbejdstagers hud sjældent er fuldstændig intakt.

Forebyggelsesmæssigt vil det i den forbindelse være væsentligt at vide, hvorvidt man ved afvaskning af hænderne har mulighed for at fjerne noget af den pesticidmængde der ligger i overfladen af stratum corneum – altså hvorvidt den mængde, der måles i huden ved forsøgsafslutning, faktisk bør henregnes som absorberet, eller hvorvidt en del kan vaskes ud. Guidelines for eksperimentelle undersøgelser af hudpenetration foreskriver, at den mængde, der forefindes i huden ved forsøgsafslutning, henregnes som absorberet. Spørgsmålet er, om det er en holdbar situation, og hvorvidt der er forskelle mellem de hydrofile og de lipofile pesticider i forhold til denne problematik. Det tredje delmål bliver derfor en undersøgelse af, hvorvidt man ved afvaskning efter endt eksponering kan fjerne en del af det på huden deponerede pesticid, eller om det fortsat skal henregnes som absorberet.

1.2 Metode

Projektet gennemføres under anvendelse af en in vitro diffusionscellemodel ved anvendelse af human hud. Den oprindelige model er beskrevet i OECD´s guidelines for undersøgelse af hudpenetration og er særdeles relevant for denne type undersøgelser, idet hudens barrierefunktion overvejende er bestemt af det epidermale lag af døde celler, stratum corneum (Grandjean 1990). Den eksperimentelle model tillader kvantitering og sammenligning af både transport igennem og temporær deposition i huden. Modellen har været anvendt på Miljømedicins laboratorium i en årrække, og laboratoriet har i 2002-2003 deltaget i en EU-finansieret valideringsrunde for modeller til studier af hudpenetration. Modellen har her såvel som i andre sammenhænge vist en god overensstemmelse med in vivo hudpenetrationsforsøg på mennesker (Ramsey et al. 1994, van de Sandt et al. 2004). Modellen er den bedste eksperimentelle mulighed for at tilvejebringe systematisk viden.

Der findes flere teoretiske modeller til beskrivelse af et molekyles transport gennem stratum corneum. En af de første brugbare modeller blev udviklet og visualiseret som ’brick and mortar’ modellen (Elias 1983). Senere er svenskeren Bo Forslind fremkommet med en lidt mere udbygget model (’the domain mosaic model’), der inddrog den seneste viden om stratum corneums opbygning (Forslind et al. 1997). Disse modeller vil danne udgangspunkt for en diskussion af en model for hudoptagelse af pesticider baseret på de i projektet opnåede resultater.

Figur 2. Diffusionscelle af glas til penetrationsforsøg.

1.3 In vitro model

Diffusionscellerne er af håndblæst glas og består af et donorkammer og et receptorkammer (figur 2). Huden, der stammer fra abdominalplastikker eller brystreduktioner foretaget på Odense Universitets-hospitals plastikkirurgiske afdeling, præpareres, monteres på et stålgitter og placeres mellem de to kamre med stratum corneum vendende mod donorkammeret. Udtørring af huden ved fordampning undgås og konstant luftfugtighed sikres ved at dække donorcellen med parafilm. Receptorvæsken (0,9% NaCl, 5% BSA, 0,1% hexamycin i vand), der fylder receptor-kammeret, omrøres konstant (magnetomrøring) for at undgå en koncentrationsgradient mellem top og bund i receptorkammeret. Diffusionscellerne placeres i vandbad (35^oC) for at sikre en temperatur på omkring 32^oC på hudoverfladen, svarende til normal hudtemperatur. Efter opsætning af huden henstår cellerne 16-18 timer med tomt donorkammer men med receptorvæske, hvorved der sikres en ekvilibrering i forhold til vandindhold i huden. Hudens integritet sikres ved kapacitansmåling før forsøg påbegyndes.

1.4 Eksperimentelt design

Et fast volumen af teststof appliceres på huden i donorkammeret. Der udtages med fastsatte intervaller prøver fra receptorkammeret af de applicerede stoffer. Det udtagne volumen erstattes med frisk receptorvæske, således at receptorvolumen holdes konstant. Koncentrationen af teststof måles i de udtagne prøver. Ved gentagne udtagninger over tid vil fluxen af teststof kunne bestemmes. Under forsøgene er der udtaget prøver efter typisk 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, og 48 timer afhængig af stoffernes forventede lag-time. I disse prøver bestemmes koncentrationen af de relevante teststoffer. Disse koncentrationer danner basis for penetrationskurver ud fra hvilke, den totale penetration over 48 timer samt den maksimale penetrationshastighed (fluxen) bestemmes. Kurveforløbene i nærværende forsøg kan beskrives ved en initiel periode (lag-fase), hvor der endnu ikke kan observeres nogen penetration. Lag-fasens udstrækning er ikke et udtryk for, at der ikke trænger pesticid ind i huden, men et udtryk for hvor lang tid der går, før pesticidet trænger gennem huden. Efter lagfasen observeres en penetration resulterende i stadig stigende koncentration af pesticid i receptorvæsken og dermed i de udtagne prøver. En kurve over penetrationen over tid har et tilnærmelsesvis sigmoidt forløb. Hældningen på den kurve er udtryk for penetrationshastigheden og betegnes fluxen. Da lag-fasens udstrækning varierer både mellem donorer og mellem pesticider, vil det kun sjældent være muligt at udtage prøver præcis ved den første gennemtrængning af hudmembranen. Lag-fasens udstrækning estimeres ved at ekstrapolere den lineære del af penetrationskurverne baglæns. Den rapporterede flux er den maksimale flux observeret gennem forsøgsperioden.

Alle tre mål har relevans i vurderingen af penetrationskarakteristika for et givet stof. Den totale mængde penetreret over en bestemt periodes eksponering, fx 48 timer, anvendes ofte som basis for risikovurdering eller anbefalinger i relation til anvendelse af handsker i arbejdsmiljøsituationer. Tallet bør dog, som det fremgår af figur 1 ikke stå alene, men suppleres med de to kinetiske mål, flux samt lag-time. Figuren viser således, at samme totale penetration kan fremkomme på basis af to helt forskellige penetrationskurver. I arbejdsmiljøsammenhænge vil der således ikke være tvivl om, hvilket stof man ville foretrække ved en eksponeringstid under 4-5 timer, medens anbefalingen muligvis ville ændres ved eksponeringstider omkring 6 timer eller længere.

Til beregning af massebalance bestemmes ved forsøgsafslutning mængden af teststof, der resterer i donorkammeret samt i huden. Resterende donorvæske fjernes fra huden ved opsugning med pipette og overføres til glas med skruelåg. Huden aftørres herefter med 6 cotton swabs pr. celle (4-5 stk. vædet med 50% AcCN, 1-2 stk. tørt), der overføres til et tælleglas; tilsættes 3 ml AcCN, hvorefter swabs henstår til ekstraktion i mindst 72 timer. Donorkammeret vaskes så med 1 ml 50% AcCN (skylles ned langs glas- væggen med pipette); væsken opsamles med pipette og overføres til glas med skruelåg. Glascellen skilles ad; huden forbliver på metalgitteret på receptordelen; epidermis skrabes forsigtigt af med en skalpel i det område, hvor teststoffet har ligget på huden (ca. 2,12 cm²); v.h.a. en pincet overføres epidermis til store tælleglas; huden tages herefter af metalgitteret og den hårde kant klippes af med en saks, den resterende bløde del kommes ligeledes over i store tælleglas. Til både epidermis og dermis sættes 3 ml 100 % AcCN; glassene whirli-mixes i få sekunder og henstår i mindst 72 timer til ekstraktion. Ekstrakter samt opsamlede væsker analyseres herefter for indhold af teststoffer.

1.5 Variabilitet og statistik

Anvendelsen af hud fra forskellige donorer betinger en naturlig heterogenicitet med deraf følgende interindividuel variation, der kan estimeres til omkring 60%. Med en power på 90%, et signifikansniveau på 5% og en standard deviation på 60% kan den krævede gruppestørrelse anslås til 13-15. Den intraindividuelle variation er imidlertid mindre end den interindividuelle og ved at sikre repræsentation af samme donor i både eksperimentel og kontrolgruppe, kan vi opnå valide resultater med gruppestørrelser på 6-8 diffusionsceller per stof (Nielsen and Nielsen 2000, Nielsen 2004, Nielsen et al. 2004) samtidig med at alle eksperimenter gentages to gange. For at illustrere den intereksperimentelle forskel, primært betinget af forskellige donorer, er resultaterne fra det første delstudie præsenteret som individuelle forsøg såvel som samlet. Tidligere forsøg har vist, at huden opretholder normal barrierefunktion i over 72 timer, hvilket muliggør både kortere og længere eksponeringsperioder.

1.6 Kemiske analyser

Udgangspunktet for analyser er enten HPLC (Nielsen and Nielsen 2000, Nielsen 2004, Nielsen et al. 2004) eller betatælling. Måling af mængden af pesticid i en prøve sker ved spektrofotometrisk måling i forhold til en standardkurve efter en primær separation ved hjælp af et HPLC apparatur. Separationen på HPLC sker, ved at stofferne presses gennem en kolonne, hvor stofferne tilbageholdes i forskellig grad afhængig af deres polaritet. I den anvendte opsætning betyder det, at jo mere polært et stof er, jo længere tid tager det om at passere. En del af de anvendte teststoffer forefindes som mærkede stoffer. At et stof er radioaktivt mærket betyder, at man har udskiftet et specificeret atom i molekylet, enten et ¹²C-atom eller et ²H-atom, med henholdsvis et ¹³C- eller ³H-atom. Det vil sige, at en fraktion af det samlede antal molekyler teststof udsender beta-stråling. De radioaktive teststoffer kan derfor kvantificeres ved hjælp af betatælling.

Tabel 1. Kemiske karakteristika for de 9 udvalgte modelstoffer.

* - Disse teststoffer forefindes som radioaktive stoffer og kvantiteres ved betatælling.

1.7 Delstudier

1.7.1 Opløselighedskarakteristikas betydning for absorptionen

I dette delstudie anvendes en række modelstoffer for fastlæggelse af et interval i forhold til lipofilicitet, hvor den mest effektive absorption kan forventes. Tidligere studier har ofte alene målt mængden af stof, der kan genfindes i receptorfasen. I dette delstudie inkluderes måling af den del af dosis, der er deponeret i huden ved eksponeringsophør (reservoir-effekt). Forsøgene gennemføres med 48 timers eksponering og opsamling af prøver fra receptorvæsken på relevante tidspunkter i dette forløb. Ved afslutning bestemmes den mængde, der resterer i donorkammeret, den i huden deponerede mængde, samt den penetrerede mængde, således at der kan opstilles massebalancer ved forsøgene. Der vil i forsøgene blive anvendt infinite dose for at sikre penetrationskurver med mulighed for bestemmelse af maksimal flux. Der anvendes 5 pesticider (pirimicarb, methiocarb, paclobutrazol, dimethoat, prochloraz) som fortsat er i aktuel anvendelse i Danmark (prochloraz er senere fjernet fra listen af bekæmpelsesmidler godkendt til brug i Danamrk), og som kendes fra tidligere undersøgelser (Nielsen 2004). Disse pesticider dækker opløseligheder i vand fra 0.03 g/L til 24 g/L (tabel 1). De fem tidligere anvendte pesticider suppleres med 4 nye modelstoffer for at dække et bredt opløselighedsspektrum og udvælges på basis af resultater opnået med de 5 første stoffer. De 4 nye modelstoffer inkluderet i dette delstudie er 3 pesticider (glyphosat, benzosyre samt malathion) samt caffein. Antallet og arten af stoffer er udvalgt for at sikre data fra en tilstrækkelig bred vifte af opløseligheder og molvægte til at kunne anvendes ved diskussion af model for dermal pesticidoptagelse.

1.7.2 Betydning af afvaskning og let hudbeskadigelse for penetration

I dette delstudie anvendes dels intakt hud dels lettere beskadiget hud for at beskrive den betydning, som den midlertidige ophobning i huden (reservoir-effekten) har i forhold til en forsinket absorption efter eksponeringsophør. Endvidere undersøges, hvorvidt afvaskning efter endt eksponering kan fjerne en del af det på/i huden deponerede pesticid, eller om det kan henregnes som absorberet. Eksperimenter med beskadiget hud inkluderes, idet tidligere undersøgelser har indikeret, at beskadigelsen af stratum corneum kan ændre på deponeringsmønstret (Nielsen 2004).

Forsøgene gennemføres med 6 timers eksponering, hvorefter modelstofferne fjernes fra donorkammeret ved afsugning. For de grupper, hvor der også vaskes er proceduren at modelstoffet fjernes ved afsugning fra donorkammer efterfulgt af afvaskning med bomuldsklud vædet i sæbeopløsning afsluttende med 2 gange vask og afsugning af skyllevæske (samme som modelstoffet er opløst i). Herefter følger 42 timers fortsat måling af penetration fra huden og over til receptorkammeret. Lettere beskadiget hud, der anvendes i halvdelen af grupperne, opnås ved 3 timers forbehandling med en 0,3 % opløsning af SLS (natrium layryl sulfat), hvilket er en metode, der tidligere er anvendt og valideret på laboratoriet (Nielsen 2005). Metoden med SLS foretrækkes frem for eksempelvis tape-stripping, idet man ved en kemisk beskadigelse med SLS kan opnå en kvantiterbar og repeterbar gradueret beskadigelse af huden.

Delstudiet er planlagt til at inkludere 6 modelstoffer udvalgt blandt stoffer anvendt i delstudie 1 med forventet lag-time både over og under eksponeringstiden. Følgende stoffer indgår i delprojekt 2: glyphosat, caffein, dimethoate, benzosyre, malathion, og methiocarb. Der vil blive anvendt rene stoffer såvel som salgsformuleringer af dimethoate og methiocarb. Pesticiderne vil blive appliceret i koncentrationer svarende til de erhvervsmæssigt anvendte.

1.8 Relevans

Projektet tager udgangspunkt i de aktivstoffer, der anvendes i Danmark. De koncentrationer af aktivstoffer, der anvendes i de enkelte delstudier, vil være umiddelbart sammenlignelige med de anbefalede koncentrationer af aktivstof ved anvendelse i gartneri/landbrug. Oplysninger om disse koncentrationer er indhentet dels fra producent og dels fra brugerne af færdigprodukterne. Ved siden af pesticiderne er anvendt en række modelstoffer, der er udvalgt på baggrund af deres opløseligheds-karakteristika. Miljøstyrelsens nuværende forvaltning af godkendelsesprocedurer for pesticider tager ikke specifikt højde for ændringer i hjælpestoffer til allerede godkendte salgsprodukter, midlertidig deponering i overhuden eller at huden hos de eksponerede ikke altid er intakt. De udvalgte pesticider er alle på nær prochloraz i aktuel anvendelse i Danmark. Der er derfor ikke alene et grundvidenskabeligt sigte med dette projekt i forhold til afdækning af faktorer af betydning for pesticiders passage af huden, men også klare regulerings- og forebyggelsesmæssige aspekter i forhold til Miljøstyrelsens nuværende rådgivning og regelsætning.

1.9 Internationale samarbejdspartnere

Projektgruppen har via et netop gennemført EU-projekt knyttet tætte forbindelser til 6 Europæiske laboratorier, der primært foretager hudpenetrationsundersøgelser. Disse laboratorier har ikke pesticider som fokusområde, men arbejder med parallelle problemstillinger. Der planlægges derfor 1-2 korte besøg hos disse laboratorier med henblik på laboratorietekniske erfaringsudvekslinger, specielt i forhold til anvendelse af beskadiget hud.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Maj 2007, © Miljøstyrelsen.