Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler og toksiske metabolitter

Sammendrag

Baggrund og afgrænsning

Mange af de mikroorganismer, der anvendes i mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, producerer en række forskellige toksiske, sekundære metabolitter in vitro. Man har dog ringe viden om, under hvilke forhold og i hvilke mængder sådanne metabolitter eventuelt produceres under naturlige forhold in vivo. Tilstedeværelse af metabolitter som restkoncentrationer i/på planteprodukter må dog i høj grad antages at afhænge af anvendelsesmåden for plantebeskyttelsesmidlet samt af den producerende organismes økologi. Denne rapport tager derfor udgangspunkt i viden om den producerende organismes sprednings-, overlevelses- og etableringsevne i rodzone, fyllosfære og på efterhøstprodukter, idet det antages, at der kun produceres metabolitter, når organismen er aktiv. I Danmark må der på nuværende tidspunkt markedsføres 18 mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Ingen af disse midler er endnu godkendte, men er omfattet af overgangsordningen. Rapporten vil primært omhandle mikrobiologiske bekæmpelsesorganismer (MBO'er), der anvendes til bekæmpelse af sygdomme fremkaldt af plantepatogene mikroorganismer. Trichoderma harzianum, der indgår i flere af de markedsførte produkter, anvendes som eksempel i rapporten.

Formål

Formålet med projektet er at belyse, under hvilke miljøbetingelser der er risiko for at mikroorganismers metabolitproduktion kan udgøre en sundhedsmæssig risiko i spiselige afgrøder i forbindelse med udbringning af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Dette er tilstræbt ved at klarlægge den aktive organismes spredningsmuligheder, etablerings- og overlevelseevne i afgrøden i relation til anvendelsesmåden af midlet og økologiske parametre i henholdsvis jord/rodzone, fyllosfære og på afgrøder efter høst. Desuden vil forekomsten af naturlige populationer af toksinproducerende mikroorganismer blive belyst dels for at eksemplificere, hvorledes økologiske parametre påvirker disse organismers produktionen af sekundære metabolitter, og dels for at kunne vurdere den sundhedsmæssige risiko ved at indtage toksiner fra mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler set i relation til risikoen ved at indtage toksiner fra den naturligt forekommende mikrobiota.

Naturligt forekommende mikrobiota

Mikroorganismer forekommer naturligt på alle ferske planteprodukter til konsum så som frugt, grønsager og cerealier. Sammensætningen af den naturlige mikrobiota er bla. afhængig af dyrkningsforholdene, produkttype og lagerforhold. Blandt svampene er især arter indenfor for slægterne Cladosporium, Alternaria, Epicoccum, Aspergillus, Penicillium og Fusarium rigt repræsenteret. Blandt gærsvampene er det især Cryptococcus spp., Sporobolomyces spp. og Aureobasidium pullulans, der isoleres og indenfor bakterierne dominerer slægter som Pseudomonas, Xanthomonas, Chromobacterium og Klebsiella.

Økologiske habitater

De økologiske nicher som MBO'er applikeres direkte til, eller som organismen kan spredes til efter den primære applikation, nemlig jord/rodzone, fyllosfære og lagrede høstprodukter, giver meget forskel- ligartede muligheder for mikrobiel vækst. Jorden/rhizosfæren er karakteriseret af en meget divers og kvantitativt stor, naturligt forekommende saprofytisk mikroflora, hvor der konkurreres intensivt om nicher med tilgængelig næring, så som planterester og rodeksudater. Fyllosfæren er et meget dynamisk habitat, der generelt er karakteriseret af drastiske fluktuationer i temperatur og fugtighed, der kræver stor tilpasningsevne af mikroorganismerne. Tilgængelige næringskilder for saprofytisk vækst er dog stærkt begrænsede og ændres successivt i løbet af vækstsæsonen. Efterhøstmiljøet er mere stabilt og defineret med hensyn til klimaparametre og substrat. Frugt og grønsager lagres generelt bedst ved høj luftfugtighed og en lav temperatur, hvilket er afgørende for opretholdelse af kvaliteten generelt og for at hæmme udviklingen af efterhøst patogener. Cerealier lagres bedst med lavt vandindhold (ca. 13%), der ofte opnåes ved nedtørring. Under sådanne forhold vil vandaktiviteten i kernerne være så lav, at vækst af mikroorganismer er stærkt begrænset.

Biologisk bekæmpelse

Mikrobiologisk bekæmpelse af plantepatogener defineres i forbindelse med nærværende rapport som: "Kontrolleret applikation af gavnlige mikroorganismer (antagonister), der kan hæmme patogener og sygdomsudvikling". Mange af de mikroorganismer, der søges anvendt til biologisk bekæmpelse er naturligt forekommende organismer, isoleret fra f.eks jord, rhizosfære, fyllosfære og frugter. Mekanismer involveret i biologisk bekæmpelse deles ofte op i fire hovedgrupper: Antibiosis, konkurrence, mykoparasitisme og induceret resistens. Antagonistens virkemåde vil dog som oftest være et samspil mellem flere mekanismer, og grænserne mellem mekanismerne er ikke klart adskilte. Et generelt erkendt problem ved biologisk bekæmpelse er uensartede resultater og svigtende bekæmpelseseffekt under naturlige vækstbetingelser. Gennem produktion og formulering af MBO'en kan bekæmpelseseffektivitet, stabilitet samt produktets shelf-life dog forbedres væsentligt.

Applikationsmetode

Den metode, der benyttes til applikation af antagonisten, er afhængig af det pågældende patogens livscyklus og patogenese og hvilket trin i plantens udvikling, der søges beskyttet.

Frø og jordbårne patogener

Jordboende, patogene mikroorganismer bekæmpes ved iblanding, udvanding eller udsprøjtning til voksemediet, samt ved frøbejdsning. Det har generelt vist sig at være vanskeligt at etablere en tilstrækkeligt høj og aktiv population af en introduceret MBO i et komplekst økosystem som jorden, idet en stor naturlig population af bakterier og svampe i forvejen er etableret i de næringsrige mikrohabitater. Den introducerede population reduceres i reglen forholdsvis hurtigt, men en introduceret population af bakterier eller svampe kan overleve fra få uger og op til flere år i jorden, oftest i form sporer der er i en tilstand af inaktivitet (fungistasis). Iblanding af MBO'er til væksthus-afgrøder har formodentlig et større perspektiv, både økonomisk og bekæmpelsesmæssigt, dels fordi der anvendes relativt små mængder voksemedium (og dermed mindre mængde præparat), dels fordi mange af de anvendte voksemedier har en lavere mikrobiel bufferkapacitet, hvorved antagonisten får bedre mulighed for at etablere sig.

Ved frøbejdsning beskyttes frøet først og fremmest mod udsædsbårne patogener. Hvis antagonisten er rhizosfærekompetent, defineret som evnen til at kolonisere rodnettet efter applikation til frøet, så kan rødderne også beskyttes mod jordbårne patogener.

Fyllosfære patogener

Plantepatogene mikroorganismer i fyllosfæren bekæmpes ved udsprøjtning og evt påsmøring af sårflader. Overlevelse af MBO'er i fyllosfæren er generelt begrænset fra få dage til få uger, og det er derfor ofte nødvendigt med mange behandlinger. Det skyldes, at MBO'er i anvendelse i dag ofte ikke er tilpasset fyllosfæremiljøets klimatiske fluktuationer og ikke kan udnytte eller konkurrerer dårligt med den etablerede mikrobiota om de sparsomme, tilstedeværende næringskilder. Succes vil ofte være betinget af, at der er tilgængelig næring f.eks. i form af senescent væv, henfaldne kronblade, pollen og honningdug, eller at patogenet har skabt indgangsveje til næring, som antagonisten kan udnytte i konkurrence med patogenet, eller at MBO'er introduceres til en nyligt opståede, næringsrige nicher (sårflader), der endnu ikke er koloniserede af den naturlige mikroflora.

Efterhøst patogener

Efterhøstpatogener bekæmpes ved påsprøjtning eller dypning. Miljøbetingelserne ved lagring er generelt meget stabile og kontrollerede, eksempelvis lagres de fleste frugter og grønsager ved temperaturer tæt på 0°C. Netop lave lagertemperaturer er med til at vanskeliggøre biologisk bekæmpelse af lagersygdomme, idet mange anvendte antagonister ikke er aktive eller har ringe aktivitet ved sådanne temperaturer.

Den naturligt forekommende mikrobiotas toksinproduktion

Indenfor svampeslægterne Aspergillus, Penicillium Fusarium og Alternaria, der ofte forekommer på høstprodukter, findes der både patogene og saprofytiske arter, der er stærk involveret i ødelæggelse og nedbrydning af afgrøder i marken og under transport og lagring. Mange af disse arter er også i stand til at producere toksiske, sekundære metabolitter (mykotoksiner), der hyppigt detekteres i visse planteprodukter til konsum, så som cerealier. Mykotoksiner kan produceres på planter i vækst og derved kontaminere høstprodukter, eller produktionen kan ske under transport og lagring af de høstede produkter. Såvel vækst af svampene som produktion af mykotoksiner er stærkt afhængig af miljøfaktorer som substrat, vandaktivitet, temperatur, mikrobiel interaktion etc. De betingelser, der understøtter toksinproduktionen, er dog oftest mere specifikke og begrænsede end betingelserne for vækst.

Risikoen for produktion af mykotoksiner på høstprodukter øges, hvis produkterne lagres under ugunstige forhold, det vil blandt andet sige forhold der accelererer produkternes naturlige nedbrydning og senescens (specielt frugt og grønsager) eller med et vandindhold, der er for højt (primært cerealier). Under sådanne betingelser vil mykotoksinproducerende patogener og svækkelsesparasitter have gode muligheder for vækst og potentiel mykotoksinproduktion.

MBO'ers produktion af sekundær metabolitter

Mange biologiske bekæmpelsesorganismer (MBO) kan producere sekundære metabolitter in vitro. Antibiosis via sådanne metabolitter regnes da også for at være en mekanisme, der ofte er involveret i biologisk bekæmpelse af plantepatogener. Det er dog vigtigt at pointere, at in vitro metabolitproduktion i mange tilfælde ikke er korreleret med den biologisk bekæmpelseeffekt in vivo. Desuden er informationer omkring MBO'ers produktion af sekundære metabolitter in vivo meget begrænset. De i litteraturen fundne rapporter omhandler primært produktion af sekundære metabolitter i jord, rhizosfære og på frø sået i jord, efter applikation af MBO'erne Pseudomonas fluorescens, P. aureofaciens og Trichoderma virens (tidligere Gliocladium virens). Den foreliggende viden indikerer endvidere, at tilførsel af tilgængelige næringskilder (eksudater, organisk materiale) er essentielt for metabolitproduktionen som sådan og for dens omfang. På baggrund af det begrænsede kendskab til MBO'ers in situ metabolitproduktion, og da der kan være variation mellem isolater inden for samme art m.h.t. metabolitprodution, kan der ikke drages generelle konklusioner. Den potentielle risiko må derfor for nærværende vurderes på baggrund af den specifikke organismes naturlige forekomst og økologi samt kendskab til organismens potentielle in vitro metabolitproduktion.

Trichoderma harzianum

Isolater af T. harzianum indgår i flere af de i DK markedsførte produkter og i produkter, der er miljøgodkendt i USA. Arten T. harzianum adskiller sig væsentlig fra andre arter af Trichoderma blandt andet med hensyn til in vitro metabolitproduktion og generelle vækstkrav. T. harzianum er en typisk jordbåren, saprofytisk svamp, der forekommer naturligt i alle typer af jorde i et niveau svarende til 10² til 10⁴ cfu per g jord. Afhængig af isolatet kan aktivitet forekomme i temperaturintervallet 5° til 36°C og ved en minimumsvandaktivitet (a_w) på 0.91. Rhizosfærekompetance synes ikke at være en normal egenskab for isolater af T. harzianum. Der findes dog eksempler på isolater med rhizosfærekompetance, der dog som oftest er fremkommet ved mutagenbehandling eller protoplastfusion. T. harzianum kan forekomme naturligt på blade, frugt, grønsager og frø, dog primært som kontamineringer, idet arten generelt er dårligt tilpasset til fyllosfæremiljøet. Således er overlevelsen af konidier applikeret til ovenjordiske plantedele generelt dårlig, idet < 1% er levedygtige efter 2-3 uger. Desuden kan konidier af T. harzianum ikke spire på levende, intakt plantevæv, med mindre der tilsættes eksogen næring. Metabolitter, der produceres af T. harzianum in vitro, er ikke påvist in situ, hverken i jord/rhizosfære eller på høstprodukter.

Generelle forhold vedrørende risikovurderinger

I forbindelse med en risikovurdering af en MBO vil mange informationer kunne hentes fra litteraturen. Sådanne informationer vil dog som oftest være af generel karakter, hvorfor der i konkrete sager kan opstå behov for at fremskaffe dokumentation af mere specifik karakter. Der findes brugbare metoder til at opnå detaljerede data vedrørende MBO'ers økologi og metabolitproduktion i de forskellige habitater. Det må dog i hvert enkelt tilfælde vurderes nøje, om et eventuelt krav om yderligere dokumentation, baseret på eksperimentelle undersøgelser, er nødvendigt, da de fleste af de tilgængelige metoder til sådanne undersøgelser kun kan gennemføres med betydelige omkostninger til følge. I kapitel 7 er der anført en række problemstillinger, der i enkelt tilfælde kan være relevante at få yderligere belyst.

Selv om produktet er kontamineret med MBO'er, er de i dag anvendte organismer ikke kendt for at forårsage efterhøstproblemer i form af vækst og sporulering på planteprodukter. Risikoen for metabolitproduktion efter høst skønnes derfor i almindelighed at være minimal.