| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Overlevelse af enterokokker og protozoen Cryptosporidium parvum i urin fra mennesker

2 Materialer og metoder

2.1 Forsøgsdesign

2.1.1 Beskrivelse af lokaliteter og tanke for udtagelse af urin

Lokalitet 1 var en relativ nyetableret økologisk bebyggelse. Alle husstande har installeret urinseparerende toiletter. Der blev til undersøgelserne udtaget urin fra en tank der havde været aflukket i ca. 2 måneder, samt fra en tank der var ved at blive fyldt. Begge tanke var tilsluttet familieboliger.

Lokalitet 2 var et alment boligbyggeri, som er repræsentativt for tæt, lavt almennyttigt boligbyggeri i Danmark. Der var i alt 390 lejligheder og 800 beboere. Urinseparerende toiletter var installeret i 9 lejligheder med i alt 16 voksne og 10 børn. Toiletterne var af typen WM ekologen, hvor vandforbruget er ca. 1-3 dl ved urinskyl. Urinen blev opsamlet fra husstandene og tilledt fem tanke på hver 15 m³. Til undersøgelserne blev der udtaget urin fra en tank der havde været aflukket i ca. 1 måned, samt fra en tank der var under opfyldning.

Lokalitet 3 og 4 var kolonihaver, hvor der blev udtaget urin fra to husstande med urinseparerende toilet, begge ved ældre ægtepar med børn og børnebørn. I begge husstande var tankene i brug ved udtagelsen af prøverne. De undersøgte kolonihaver repræsenterer lavteknologiske toiletsystemer med kort afstand mellem toilet og opsamlingsbeholder. Der var i alt 100 haver med separationstoiletter og urinen blev typisk opsamlet i 25-liters beholdere. Dog havde to udvalgte haver urinopsamlingsbeholdere på 220 liter.

Tabel 1. Projekt 1 - Bakteriologi. Generelle oplysninger om de udtagne urinprøver (urin udtaget 7. og 8. oktober 2002)

^a S = sediment i urinlagringstank; Ø = øvrig urin

2.1.2 Udtagelse af prøver på lokaliteterne

Ved udtagelsen af prøverne blev der benyttet en steril plastiksonde med en indre diameter på 1 cm. Sonden blev fastgjort med plastictape på et plast isolationsrør, således at spidsen af sonden kunne føres helt ned til bunden af de enkelte tanke. Mellem brug af sonde og rør blev disse rengjort grundigt og sonden blev efterfølgende autoklaveret. Til udtagelse af prøver blev en 140-ml engangsplastsprøjte monteret på den ene ende af plastsonden og herigennem blev prøverne fra bunden af tankene ("sediment") udtaget. I alt 1,5 liter sediment blev udtaget og opbevaret i en steril glasflaske på køl indtil forsøget blev igangsat. De såkaldte sedimentprøver var således en blandning af sediment og vand. Dernæst blev der udtaget 15 liter af urinen øverst i tanken ved hjælp af en 10-liters plastikspand. Urinen fra den øvre del af tanken blev opbevaret i 5-liters plastdunke på køl indtil forsøget blev igangsat. Ved udtagelsen af urin måltes pH og temperatur umiddelbart efter udtagelse samt ved hjemkomst til laboratoriet. Ligeledes blev urinens udseende bedømt umiddelbart efter udtagelse.

Der blev udtaget prøver til analyse af såvel sediment og urin, idet den højeste koncentration af fækale indikatorer (både bakterielle og parasitære) forventes at være i sedimentprøver fra bunden af tankene. De to prøvetyper blev udtaget idet en egentlig opblanding af sediment med øvrig urin i selve tanken ikke var mulig.

2.1.3 Opsætning af forsøg

Den udtagne urin blev opbevaret i 2-L sterile glasflasker og lagret i køleskabe eller varmeskabe ved 4, 10 og 20ºC. Flaskerne var under lagringen omviklet med sorte plasticposer for at forhindre lysgennemtrængning.

2.1.3.1 Valg af temperaturer
Temperaturerne 4 og 10ºC repræsenterer temperaturer i nedgravede urinlagringstanke. En temperatur på 4ºC repræsenterer desuden et 'worst case' senario, idet de fleste mikroorganismer generelt overlever længst ved sådanne lave temperaturer. I rapporten fra 2001 (Dalsgaard og Tarnow, 2001) blev der målt ned til 5,5ºC i nedgravede urinlagringstanke og i Sverige har man målt mellem 0 og 10ºC i nedgravede tanke (Jönsson et al., 1997). Valg af den laveste lagringstemperatur til 4ºC gjorde det endvidere muligt umiddelbart at kunne sammenligne med resultaterne fra en række svenske undersøgelser, både m.h.t. bakteriologiske og parasitologiske fund. Dalsgaard og Tarnow (2001) fandt en sandsynlig eftervækst af enterokokker i urinlagringstanke omkring maj til juni måned når temperaturen i disse nåede op på ca. 10ºC og da Enterococcus spp. vokser bedst ved 10-45ºC, var det derfor hensigtsmæssigt at have en inkubations-temperatur på 10ºC.

Med hensyn til protozoen Cryptosporidium, overlever denne længst ved en temperatur på 4ºC, men 10 og 20ºC blev også undersøgt for at kunne relatere parasitternes overlevelse til de faktiske temperaturforhold i nedgravede og ikke-nedgravede urinlagringstanke.

2.1.3.2 Valg af volumen
I de svenske og andre undersøgelser er der i undersøgelser af Cryptosporidium ægs overlevelse i vand og urin anvendt små volumner, ex. 1, 2, 4 og 5 ml (Fayer et al., 1998; Olson et al., 1999; Höglund og Stenström, 1999; Freire-Santos et al., 2000). Ved at anvendte større urinvolumener i dette projekt (2 liter) opnåes en bedre model for en urinlagringstank. Der vil bl.a. være en større bundflade til etablering af sediment og biofilm, som menes at være af betydning for både bakteriers og parasitters overlevelse i urinlagringstanke (Sundin et al., 1999; Schönning et al., 2002). Desuden vil der lettere kunne opretholdes et stabilt niveau af pH og ammoniak svarende til forholdene i en urinlagringstank.

Inden forsøget blev sat op blev der foretaget bakteriologiske målinger på urinen for at vurdere om ekstra tilsætning af fækalier var nødvendig. Der fandtes mellem 101 og 104 cfu/ml af enterokokker og mellem 102 og 106 af kim ved 37ºC. Dette blev vurderet som tilstrækkeligt udgangsmateriale for de videre undersøgelser og der blev derfor ikke tilsat ekstra fækalier til urinen.

I parasitologiske undersøgelser af urinen inden igangsætning af forsøget fandtes ingen æg af C. parvum eller æg af rundormeparasitter.

2.1.3.3 Projekt 1 – Bakteriologi
Der blev opsat to flasker (replikater) for hver kombination af lokalitet, tank og temperatur. I hver flaske blev 200 ml fra sedimentet i en given urinlagringstank blandet med 1.800 ml urin fra den samme tank. Der blev tilsat en steril magnet til hver glasflaske, så omrøring var mulig forud for prøveudtagning.

Der blev foretaget fysisk-kemiske og bakteriologiske målinger ved lagringens start (T-0) og derefter med ca. 1 måneds interval op til T-6, dvs. efter seks måneders lagring (Tabel 2). Til undersøgelse af mulig eftervækst af enterokokker blev det besluttet at udtage en ekstra prøve efter otte måneders lagring (T-8) fra flasker hvor der havde været positivt fund af enterokokker ved T-6.

2.1.3.4 Projekt 2 – Parasitologi
I denne del af forsøget blev der brugt urin fra en åben tank ved lokalitet 1 og en åben tank ved Lokalitet 2. Der blev opsat en flaske for hver kombination af lokalitet, tank og temperatur. I hver flaske blev 200 ml fra sedimentet i en given urinlagringstank blandet med 1.800 ml urin fra den samme tank. Til disse flasker blev der tilsat 2 semipermeable kapsler til hver prøveudtagningstidspunkt, ialt 18 kapsler per flaske. Der blev desuden opsat kontrolflasker indeholdende 1 liter fosfatbuffer (PBS) hvortil kapsler indeholdende parasitæg også blev tilsat.

Semipermeable kapsler blev benyttet til de parasitologiske undersøgelser, da det dels var ønskeligt at undgå spredning af de smitsomme parasitæg til hele urinvolumen og kapslerne gjorde det endvidere muligt at opretholde en relativ høj koncentration af æg. Sidstnævnte var nødvendig da der var et begrænset antal parasitæg til rådighed. Kapslerne er beskrevet i detaljer under afsnittet om parasitologiske metoder.

Der blev foretaget fysisk-kemiske og parasitologiske målinger ved lagringens start (T-0) og derefter med ca. 1 måneds interval op til T-2 for alle temperaturer. Forsøget blev afsluttet ved T-2 eftersom C. parvum æggene alle var døde og ikke infektive på dette tidspunkt (Tabel 3). For urin lagret ved 20ºC blev der også udtaget prøver efter 14 dages lagring (T-14 dage) idet æg normalt vil dø relativt hurtigt ved denne temperatur.

2.1.4 Tidsplan for udtagelse af prøver

Der blev undtaget prøver med 1 måneds tidsintervaller med start tidspunkt angivet som T-0.

Tabel 2 Prøveudtagningstidspunkter projekt 1, Bakteriologisk del

X = der blev udtaget prøver til bakteriologisk undersøgelse, samt prøver til pH-måling og ammoniumbestemmelse.

Tabel 3 Prøveudtagningstidspunkter projekt 2, parasitologisk del (Cryptosporidium parvum overlevelse i urin)

X = der blev udtaget 2 kapsler fra hver 2-liters beholder og der blev ligeledes udtaget prøver til bakteriologisk undersøgelse, pH-måling og til ammoniumbestemmelse.

Y = der blev udtaget 1 kapsel fra hver 2-liters beholder og der blev ligeledes udtaget prøver til bakteriologisk undersøgelse, pH-måling og til ammoniumbestemmelse.

PBS = fosfat buffer

2.1.5 Måleprogram

I tabel 4 nedenfor er angivet måleprogrammet for de bakteriologiske og parasitologiske undersøgelser sammen med de anvendte metoder. Metoderne er beskrevet i detalje nedenfor.

Tabel 4 Måleprogram for projekt 1 (bakteriologisk del) og projekt 2 (parasitologisk del).

2.2 Metoder

2.2.1 Fysisk-kemiske metoder

2.2.1.1 Temperatur
Temperatur i inkubatorer og kølerum blev målt 2 gange per uge.

2.2.1.2 pH
Der blev udtaget 25 ml urin ved hver prøveudtagning til måling af pH. pH-meter (Radiometer) med Calomel elektrode blev benyttet til pH-målinger.

2.2.1.3 Ammonium koncentration
Der blev ved hver prøveudtagning udtaget 1 ml prøver fra alle 2-liters flasker med urin. Prøverne blev fortyndet med sterilt vand, og urin fra Lokalitet 1 og 2 blev således fortyndet 100 x, og urin fra Lokalitet 3 og 4 blev fortyndet 150 x. pH blev efterfølgende justeret til mellem 3,5 og 4,5.

Volumener af ca. 10 ml blev derefter sterilfiltreret igennem et 0,2 m membranfilter og prøverne blev efterfølgende opbevaret ved –20ºC indtil den videre analyse blev foretaget ved Kemisk Institut, KVL. Der blev udført dobbeltbestemmelser på prøverne og et gennemsnit af de to målinger blev beregnet.

Analyse for ammonium ved flow-injektionsanalyse og gas diffusion foregik ved at en prøve, tilpas fortyndet med vand, blev ledt ind i en mikrokanal hvor natriumhydroxid blev tilblandet. Dette forårsager at alt ammonium omdannes til gassen ammoniak som derefter kan passere gennem en membran. Koncentrationen af den frigivne ammoniak bestemmes ved hjælp af en indikator og måling af dennes farveintensitet ved en bestemt bølgelængde.

2.2.2 Bakteriologiske metoder

2.2.2.1 Enterokokker
Antal enterokokker blev bestemt ved tælling af typiske røde-rødbrune kolonier på Slanetz & Bartley agar ved 44oC i 48 timer 4 timer (DS 2401). Denne metode blev tidligere fundet velegnet til bestemmelse af enterokokker i urin (Dalsgaard og Tarnow, 2001). Detektionsgrænsen for undersøgelsen var 1 cfu/ml. Glasflaskerne blev placeret på en magnetomrører i 60 sekunder før prøveudtagning for at opnå homogen opblandning af urin og sediment. Urinprøverne (1 ml) blev udtaget sterilt fra glasflaskerne og fortyndet ved 10-folds fortyndinger. Figur 2 viser forløbet fra udtagelse af prøver fra urinflasker til karakterisering og typning af isolater fra Slanetz & Bartley agar.

Figur 2 metodebeskrivelse for udtagelse af prøver fra lagret urin, isolation og typning af enterokokisolater fra Slanetz & Bartley agar.

2.2.3 Parasitologiske metoder

Detaljerne af de parasitologiske metoder er beskrevet i Bilag B, ligesom principperne i undersøgelserne er vist i figur 3.

Fig.3 Metodebeskrivelse for undersøgelse af C. parvum ægs viabilitet (levedygtighed) og infektivitet (smitsomhed)

2.2.4 Statistisk analyse af resultater

For at fastslå om der var tale om egentlig eftervækst af enterokokker eller om der blot var tale om en stigning der kunne tilskrives variation i kimtal, blev der udført en statistisk analyse af resultater fra flaskerne hvor der fandtes en tilsyneladende forlænget overlevelse og eventuel vækst af enterokokker. Der blev udført en faktoriel variansanalyse (ANOVA) på eventuelt vækst af enterokokker fra T-4 til T-6 (SAS version 8.02) med temperatur og tank som faktorer.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Januar 2004, © Miljøstyrelsen.