Occurrence and fate of antibiotic resistant bacteria in sewage
Sammendrag og konklusioner
I dette projekt har vi undersøgt forskellige aspekter vedrørende forekomst og overlevelse af antibiotika-resistente bakterier i spildevand, herunder:
 | hvilken effekt udledning af spildevand fra et hospital og en farmaceutisk virksomhed havde på prævalensen af antibiotika-resistente Acinetobacter i kloaksystemet (Del I) |
| effekten af tertiær spildevandsbehandling på det totale og procentvise antal resistente bakterier (Del II) |
| overlevelsen i naturlige akvatiske miljøer af multi-resistente bakterier fra byspildevand og indflydelsen af byspildevand på spredningen af antibiotika-resistente bakterier (Del III). |
Del I
I Del I af projektet blev Acinetobacter anvendt som bakteriel indikator til overvågning af antibiotikaresistens i kloakker. Kloakkerne modtog spildevand fra et hospital og en farmaceutisk virksomhed, som forarbejdede antibiotika-holdige produkter. Begge er således potentielle kilder til resistente bakterier og/eller antibiotika-holdigt spildevand:. Baggrunden for valget af Acinetobacter som indikator var bakterieslægtens normale forekomst i vandmiljøer og dens udtalte evne til at udvikle antibiotikaresistens.
Resistens overfor seks antibiotika blev bestemt ved tabletdiffusionsmetode af 385 Acinetobacter bakterier isoleret opstrøms og nedstrøms for udledning af spildevand fra hospitalet (n=180) og den farmaceutiske virksomhed (n=205). Bakterieisolater i spildevandet fra kloakken ved den farmaceutiske virksomhed blev endvidere karakteriseret ved plasmid analyse og fænotypiske tests til påvisning af ændringer i fordelingen af Acinetobacter populationer som følge af udledning af spildevand fra virksomheden.
Statistisk analyse af resultaterne fra antibiotikaresistens undersøgelserne viste, at udledning af spildevand fra den farmaceutiske virksomhed medførte en stigning i prævalensen af såvel enkelt som multi-resistente Acinetobacter i kloakspildevandet nedstrøms for virksomheden (logistisk regression P < 0,01). Denne stigning i antibiotikaresistens blev observeret gennem hele undersøgelsesperioden og persisterede 250 m nedstrøms for stedet for virksomhedens spildevandsudledning.
Dette var i modsætning til udledning af hospitalsspildevand, som kun medførte en stigning i prævalensen af oxytetracyklin-resistente Acinetobacter i kloakspildevandet. Den observerede stigning i tetracyklinresistens umiddelbart nedstrøms for spildevandsudledningen blev dog signifikant reduceret 500 m nedstrøms for udledningsstedet. Bakterier isoleret nedstrøms for den farmaceutiske virksomhed havde forskellige plasmidprofiler og fænotypiske egenskaber sammenlignet med Acinetobacter bakterier isoleret opstrøms.
Det kunne således konkluderes på baggrund af undersøgelsens resultater, at udledningen af spildevand fra den farmaceutiske virksomhed medførte en stigning i forekomsten af antibiotika-resistente bakterier på grund af tilførsel af antibiotika-holdigt spildevand og/eller tilførsel af antibiotika-resistente bakterier. Endvidere medførte spildevandsudledningen også ændringer i forekomsten og fordelingen af forskellige Acinetobacter fænotyper.
Del II
I projektets Del II undersøgte vi effekten af tertiær spildevandsbehandling på prævalensen af antibiotika-resistente bakterier i to store spildevandsrensningsanlæg gennem en 6 måneders periode. Det totale og relative antal resistente bakterier i ubehandlet spildevand, behandlet spildevand og anaerob-behandlet slam blev bestemt ved kimtællinger på agarmedier med og uden følgende antibiotika: ampicillin, tetracyklin, gentamicin, samt agarmedier med alle tre antibiotika inkluderet samtidigt. MacConkey agar blev anvendt til påvisning af koliforme bakterier og Baumann agar til påvisning af Acinetobacter. Anvendelse af de to agarmedier muliggjorde undersøgelse af effekten af spildevand-og slambehandling på forskellige bakteriepopulationer. Desforuden, blev følsomheden hos 442 Acinetobacter isolater overfor 14 antibiotika bestemt ved tabletdiffusionsmetode. Identiteten af de testede Acinetobacter isolater var forinden blevet fastlagt ved kolonihybridisering med en genus-specifik DNA probe.
Det totale antal resistente bakterier var mellem 10 og 1.000 gange lavere i behandlet end i ubehandlet spildevand afhængig af de anvendte antibiotika og påviste bakteriepopulationer. Prævalensen af resistente koliforme bakterier og Acinetobacter i behandlet spildevand og behandlet slam var ikke signifikant højere end i ubehandlet spildevand. Faktisk blev prævalensen af ampicillin-resistente acinetobacter (suspekte Acinetobacter, som ikke er identificeret på slægts niveau) signifikant reduceret ved spildevandsbehandling i et af de to undersøgte anlæg (lineær regression P<0,05). Slambehandling medførte også en reduktion i prævalensen af ampicillin-resistente acinetobacter, samt en reduktion i ampicillin- og gentamicin-resistente suspekte koliforme bakterier (lineær regression P<0,05).
Resultaterne fra kimtællinger på agarmedier med antibiotika blev underbygget af resistensbestemmelserne af Acinetobacter isolater ved tabletdiffusion. Logistisk regressionsanalyse viste, at frekvensen af antibiotikaresistens i bakterieisolater fra behandlet spildevand og behandlet slam ikke var signifikant højere sammenlignet med isolater fra ubehandlet spildevand. Ved sammenligning af resistensprofilerne hos isolater fra ubehandlet og behandlet spildevand overfor de 14 antimikrobielle stoffer, fandtes der kun for et enkelt antimikrobielt stof, nalidixcan syre, i et af rensningsanlæggene, en signifikant højere prævalens af resistente bakterier i behandlet spildevand sammenlignet med ubehandlet spildevand. Det kan således konkluderes, at tertiær spildevandsrensning ikke medfører en selektion for resistente bakterier. Med andre ord ser spildevandsrensning ud til at reducere bakterieantallet uafhængig af deres følsomhed overfor antibiotika.
Selvom resultaterne klart viser, at den overordnede prævalens af resistente bakterier ikke steg som følge af spildevandsrensning, så indeholdt det udledte behandlede spildevand lave bakterieantal (10-102 CFU/ml), som var resistente overfor ampicillin, gentamicin og tetracyklin. Sandsynligheden for at sådanne multi-resistente bakterier forekommer i naturen er meget lille. Dette blev understreget af, at der ikke blev set bakterievækst efter udsæd af ferskvands- og saltvandsprøver på agarmedier med de tre antibiotika. På baggrund af fundet af disse multi-resistente bakterier, besluttede vi, at undersøge deres overlevelsesevne i naturlige akvatiske miljøer (Del III).
Del III
I projektets Del III, blev tre multi-resistente bakteriestammer undersøgt for deres overlevelse og evne til at bibeholde antibiotikaresistens i saltvand i laboratorieforsøg og i membranfilterkamre nedsænket i en ferskvandsdam. De valgte bakteriestammer repræsenterede tre forskellige bakteriearter: Acinetobacter johnsonii, Escherichia coli og Citrobacter freundii. Multi-resistensen hos de tre teststammer blev udnyttet i forsøgene ved tilsætning af de tre antibiotika som selektiv markør til påvisning af teststammerne blandt den mindre resistente normale bakterieflora. Ved forsøgene blev der tilsat lave kimtal af teststammerne (103 - 104 CFU ml-1) til efterligning af de faktiske forhold når behandlet spildevand med multi-resistente bakterier udledes til akvatiske recipienter.
To ud af de tre multi-resistente teststammer, Escherichia coli og Citrobacter freundii, overlevede længere end 1 måned i saltvand i laboratorieforsøgene og i ferskvandsdammen. Derimod overlevede Acinetobacter johnsonii teststammen kun kort tid i begge forsøgsopstillinger. Resultaterne viste, at multi-resistente bakteriestammer som forekom i byspildevand kunne overleve relative lange perioder efter deres udledning i akvatiske recipienter. De multi-resistente bakterier overlevede bedre i sterilt (autoklaveret) vand, hvilket tyder på, at deres overlevelse blev påvirket af den tilstedeværende naturlige mikroflora. Sandsynligvis på grund af antagonisme eller predation. Ydermere, udviste teststammerne stadig multi-resistens efter 1 måneds ophold i ferskvandsdammen. Dette tydede på, at stress og næringsstof sult ikke påvirkede bakteriernes evne til at udvise antibiotikaresistens.
Muligheden for at overføre antibiotika resistensgener fra spildevand til bakterier i naturlige akvatiske miljøer blev undersøgt ved udspredning på agarmedier i laboratorieforsøg i projektets Del III. I alt 10 forskellige tetracyklin-resistente Acinetobacter bakterier isoleret i spildevand (n=10) blev udstreget på vækstmedium sammen med en tetracyklin-følsom Acinetobacter bakterie isoleret fra en å, som ikke var forurenet med spildevand. Kun to ud af de 10 donorbakterier var i stand til at overfører tetracyklin-resistens med den anvendte metode. I et af disse tilfælde var der en sammenhæng med overførsel af tetracyklin-resistens og overførsel af små plasmider fra donor til recipientbakterien, hvorimod overførsel af resistens i det andet tilfælde ikke var medieret af plasmid conjugation. Disse resultater indikerer, at antibiotika resistensgener i spildevand kan spredes til den naturlige akvatiske mikroflora. Det begrænsede antal anvendte teststammer, og det forhold at kun to donorbakterier var istand til at overføre resistens, tillader dog ikke en bestemmelse af omfanget af resistensoverførsel i naturlige akvatiske miljøer.
Effekten af udledning af byspildevand på spredning af antibiotika resistens blev yderligere undersøgt ved at sammenligne forekomsten af resistente bakterier i blåmuslinger fra områder hvortil der blev udledt spildevand og fra områder som ikke modtog spildevand. Blåmuslinger blev valgt som indikatorer på grund af deres høje bakterieoptag gennem daglig filtration af store vandmængder. Blåmuslinger eksponeret til behandlet spildevand indeholdt en højere procentdel ampicillin-resistente bakterier (12,9 til 95,5%), sammenlignet med blåmuslinger fra områder som ikke modtog behandlet spildevand (1,5 til 5,4%). Derimod var procentdelen af gentamicin og tetracyklin-resistente bakterier lav (<3%), uafhængig af muslingernes oprindelse. Multi-resistente bakterier blev kun fundet i blåmuslinger eksponeret til behandlet spildevand og her i lave koncentrationer (# 0.1%). Disse fund bekræfter, at behandlet spildevand kan være kilde til spredning af multi-resistente bakterier i akvatiske miljøer. Endvidere var der procentvis flere resistente bakterier i blåmuslinger indsamlet fra områder tæt på spildevandsudløbet sammenlignet med blåmuslinger indsamlet 100 m fra spildevandsudledningen. Dette indikerer en sammenhæng mellem forekomsten af resistente bakterier og afstanden til stedet for spildevandsudledning.
Konklusioner
Undersøgelsernes resultater viser, at forekomsten af enkelt og multi-resistente bakterier kan øges ved udledning af spildevand fra farmaceutiske virksomheder som producerer eller forarbejder antibiotika-holdige produkter. Disse undersøgelser syntes at være de første, som har påvist en sammenhæng med udledning af spildevand fra farmaceutiske virksomheder og forekomsten af resistente bakterier i spildevand. Den fundne stigning i prævalensen af resistente Acinetobacter kunne være forårsaget af resistente bakterier i virksomhedens spildevand og/eller udledning af antibiotika-holdigt spildevand som selekterede for resistente bakterier i kloakken. Disse fund viser, at spildevand fra farmaceutiske virksomheder sandsynligvis er vigtige kilder til forekomst og spredning af resistente bakterier i spildevand. Det skal dog bemærkes, at undersøgelserne kun blev udført ved en enkelt farmaceutisk virksomhed. Undersøgelser af yderligere virksomheder er derfor nødvendige til bestemmelse af omfanget af selektion og/eller introduktion af resistente bakterier gennem udledning af spildevand fra sådanne virksomheder.
Forekomst og overlevelse af resistente bakterier i spildevand bør vurderes varsomt på grund af muligheden for overførsel af disse bakterier mellem forskellige miljøer. Spildevand og kloakker er således egnede habitater for forekomst og spredning af resistente bakterier. Endvidere modtager og viderefører de spildevand fra en række kilder, hvorfra der udledes antibiotika og resistente bakterier (eksempelvis hospitaler, farmaceutiske virksomheder, landbrug og slagterier), til naturlige vandmiljøer. En egentlig risikovurdering var ikke opstillet som formål i vores undersøgelser. Men mulige sundhedsrisici for mennesker kan eventuelt være behæftet med spredning af resistente bakterier i spildevand, eksempelvis ved en eventuel forurening af drikkevand og badevand.
Vores undersøgelser viser, at spildevandsrensning medfører en reduktion i det totale antal resistente bakterier. Der fandtes ingen forskel i reduktionen af følsomme og resistente bakterier da den procentvise forekomst af resistente bakterier var ens i behandlet sammenlignet med ubehandlet spildevand. Spildevandsrensning ser således ud til nedsætte spredningen af resistente bakterier i spildevand.
Vores undersøgelser viste dog også at:
| Multi-resistente bakterier i ubehandlet spildevand kan overleve behandling og spredes til naturlige vandmiljøer gennem udledning af byspildevand. |
| Multi-resistente bakterier i behandlet spildevand kan overleve i relativt lange perioder og bibeholde deres resistens egenskaber efter udledning til recipienten. |
| Bakterier som var resistente overfor tre eller fire forskellige antibiotika blev isoleret i blåmuslinger fra områder som modtog behandlet spildevand. Derimod kunne sådanne multi-resistente bakterier ikke påvises i blåmuslinger og vandprøver fra områder som ikke modtog spildevand. |
| Resistente bakterier i spildevand kan overfører antibiotika resistens til følsomme bakterier i ikke-forurenede akvatiske miljøer. |
Resultaterne fra vores undersøgelser understreger behovet for at fastlægge i hvilket omfang spildevand spreder multi-resistente bakterier. Fremtidige studier bør undersøge forekomst og spredning af multi-resistente bakterier i byspildevand fremfor bakterier med resistens overfor et enkelt antibiotikum. Der er også behov for yderligere undersøgelser af multi-resistente bakteriers evne til resistensoverførsel til den normale akvatiske mikroflora under naturlige forhold. Endvidere bør spredningen af resistente bakterier og deres resistensgener efter udbringning af spildevandsslam på landbrugsjord undersøges. Endelig bør der foretages en vurdering af i hvilket omfang resistente bakterier i vandmiljøer bidrager til resistensproblemerne indenfor det veterinær og humane område.