| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Afgivelse af organisk stof fra polymere materialer - mikrobiel vækst

Bilag C
AOC-metoden

AOC-metoden er et bio-assay, hvor en vandprøves AOC-værdi bestemmes ud fra det antal bakterier, der kan vokse op på de organiske kulstofforbindelser i prøven. Vandprøven tappes i en kulstoffri testflaske, og prøvens naturlige bakteriepopulation inaktiveres ved pasteurisering. Prøven podes efterfølgende med to bakteriestammer, Pseudonomas fluorescens, stamme P17 og Aquaspirillum, stamme NOX, der tilsammen kan omsætte langt størstedelen af de organiske kulstofforbindelser i drikkevand /van der Kooij et al., 1995/. Prøven inkuberes i mørke ved 15° C, og bakterieantallet følges over tid ved at bestemme kimtallet på R₂A, et lavsubstrat medie specielt egnet til bestemmelser på næringsfattige miljøer (sammensætningen af R₂A er angivet i Bilag B). Vækstkurvens maksimale bakterieantal omsættes til prøvens AOC-værdi udtrykt i acetat-C ækvivalenter/L ved brug af udbyttekonstanter for P17 og NOX på acetat. Udbyttekonstanterne for acetat-koncentrationer på 5-250 mg acetat-C/L er 4,1*10⁶ CFU/mg acetat-C for P17 og 1,2*10⁷ CFU/mg acetat-C for NOX /van der Kooij et al., 1995/.

Nedenfor er arbejdsgangen for AOC-metoden gennemgået i den udgave, der dannede grundlag for projektet.

C.1. Udførelse

Alt arbejde med åbne prøver og podekulturer forgår i sterilbænk.

AOC-bestemmelser udføres i triplikat med 200 mL vandprøve i hvert enkelt testflaske (250 mL 'red cap'-flaske [PYREX] med 'red cap'-låg med teflonindlæg [SCHOTT DURAN]). Prøvens naturlige bakteriepopulation inaktiveres ved pasteurisering i 30 minutter ved 60° C. For at varme på prøven i så kort tid som muligt, opvarmes prøven hurtigt i 90° C vandbad. Temperaturen følges i en referenceflaske, der behandles som prøveflaskerne. Når temperaturen i referenceflasken når 60° C, overføres prøven til 60° C varmeskab, hvor den henstår i 30 minutter. Efter afkøling i isbad til testtemperaturen podes prøven med P17 og NOX til en startkoncentration på 200-500 CFU/mL. Prøven inkuberes ved 15° C indpakket i stanniol for at hindre algevækst og photokemisk nedbrydning.

Under inkuberingen følges bakterieantallet ved overfladeudsæd på R₂A, hvor pipetteringer foretages med finnpipetter med engangsspidser af polypropylen. Inden prøveudtagning fra en flaske føres denne i kraftige horisontale cirkelbevægelser for at homogenisere prøven. Når fortynding af en prøve er nødvendig, fremstilles en ti-fold fortyndingsrække ved at overføre 100 m L prøve til eppendorf-rør med 900 m L autoklaveret postevand. Der omblandes ved vortex-mixning, og herudfra fremstilles den videre fortyndingsrække på samme vis, indtil de ønskede fortyndinger er opnået. Skal den ufortyndede prøve udplades, udtages der i stedet 300 mL prøve til tomt eppendorf-rør, hvorfra udpladning fortages og den videre fortyndingsrække fremstilles.

Fra tre fortyndinger udplades 50 m L i triplikater, ialt 9 plader. Kolonier optælles efter 2-3 dages inkubation ved 25° C, idet forskel i kolonimorfologi gør det muligt at skelne imellem P17 og NOX. P17 fremtræder som beigefarvede kolonier på 2-3 mm i diameter, mens NOX vil ses som mindre grå-hvide kolonier med en diameter på 1-2 mm. Plader med over 200 kolonier (af både P17 og NOX) optælles generelt ikke.

For hver enkelt bestemmelse beregnes kimtallet som et vægtet gennemsnit ud fra den totale udstrøgne prøvemængde og det totale antal talte kolonier i prøvemængden. Den observerede spredning (error of the mean, e.o.m) på kimtallet følger en Poisson fordeling og vil følgelig være . Kimtallet bestemmes således som:

C_i: antal kolonier fra enkel udstrygning i fortyndingsrækken
W_i: volumen udstrøget

De højst opnåede kimtal for P17 og NOX omregnes til AOC-værdier ved brug af udbyttekonstanter på acetat. Prøvens total AOC-værdi bestemmes som:

AOC_Total = AOC_P17 + AOC_NOX

C.1.1. Rensningsprocedure for udstyr

Flasker, låg og finnpipetter anvendes udelukkende til AOC-bestemmelse for at hindre, at anden tidligere anvendelse medfører afgivelse af organisk stof eller stof, der virker hæmmende på bakterievækst.

Til desinficering af arbejdsområde og drigalskispatler anvendes der ikke sprit, da dette vil kontaminere prøverne med organisk stof og resultere i forhøjet P17 koncentrationer. Arbejdsområde aftørres med en 0,05% CTMAK-opløsning (cetyltrimethylammoniumchlorid), og drigalskispatler glødes i gasflamme og afkøles inden brug.

C.1.2. Podekulturer

Separate podekulturer af P17 og NOX fremstilles ved opdyrkning af bakterierne ved 15° C i næringssaltsmedie med 1 mg/L acetat /van der Kooij et al., 1995/. Bakteriernes vækst følges ved overfladeudsæd på R₂A, indtil et maksimalt bakterieantal er opnået. Herefter opbevares kulturene i køleskab, hvor de har en holdbarhed på omkring et halvt år.

C.2. Ændringer i forhold til van der Kooij metode

Den ovenfor beskrevet arbejdsgang ved udførelse af AOC-metoden afviger på nogle punkter fra /van der Kooij et al., 1995/. I Tabel 0-1 er de afgørende punkter listet. I den oprindelige AOC-metode udføres bestemmelserne i 1 L Erlenmeyerkolber. Det er imidlertid ofte mere hensigtsmæssigt at benytte "red cap"-flasker til bestemmelserne. Transport og håndtering af prøver er lettere i "red cap"-flasker end i Erlenmeyerkolber, da "red cap"-lågene er skruet fast og dækker hele flaskemundingen. Ved brug af Erlenmeyerkolber risikeres det endvidere, at propperne hopper op under transport og pasteurisering. Der er således umiddelbart langt mindre risiko for at prøverne kontamineres fra omgivelserne ved at anvende "red cap"-flasker. I projektets arbejde var det endvidere hensigtsmæssigt pga. mængden af testmateriale og ønsket om fastholdt S/V-forhold at benytte mindre vandvolumener end 600 mL, hvorfor der blev valgt 250 mL flasker.

Tabel C-1:
Punkter hvor udførelsen af AOC-metoden gennemgået i afsnit 0 afviger fra /van der Kooij et al., 1995/.

Rensningen af testflaskerne er modificeret i forhold til van der Kooij et al.´s forskrift /1995/, da de færreste laboratorier har kapacitet til at gløde et større antal flasker ved 550° C. Den forskrevne metode anses for bedre end den alternative metode foreslået af van der Kooij et al. /1995/, da syrevasken er forlænget, og der anvendes MilliQ-vand (lavt indhold af organisk stof) til skylning.

Autoklavering af fortyndingsrør med fortyndningsvæske medfører ofte en ukontrolleret fordampning af fortyndingsvæsken, hvilket vil give usikkerheder ved fortyndingen. Der opnås derfor en større præcision ved at udmåle fortyndingsvæsken efter autoklaveringen. Derved kan det samtidigt forsvares at anvende mindre volumener ved fremstilling af fortyndingsrækker, så de kan fremstilles i eppendorf-rør og med finnpipetter fremfor stangpipetter, da dette håndteringsmæssigt er mere praktisk (automatpipetter med engangsspidser anvendes af Standard Methods /1998/).

C.3. Undersøgelse af forskellige flaske- og lågtyper

En mulig risiko ved at anvende "red cap"-flasker med tilhørende låg fremfor Erlenmeyerkolber kunne være, at der blev afgivet forbindelser fra lågenes teflon-indlæg til vandfasen, som vil kunne påvirke bestemmelsen. For at kontrollere dette blev der foretaget en sammenlignende undersøgelse med både Erlenmeyerkolber og "red cap"-flasker. Teflon-indlæggene i "red cap"-lågene kan kun holde til at undergå rensningsproceduren et begrænset antal gange, før de skal udskiftes. Det blev derfor endvidere undersøgt, om der var en effekt af, om indlæg (monteret i lågene) havde gennemgået rensningsproceduren én eller flere gange.

C.3.1. Forsøgsgang

Undersøgelsen blev udført med 250 mL Erlenmeyerkolber med tilhørende propper med glasslib og 250 mL "red cap"-flasker med låg, hvor lågenes indlæg henholdsvis havde undergået rensningsproceduren en enkelt gang ("nye" indlæg) eller mere end én gang ("gamle" indlæg). Efter pasteurisering af testvandet (200 mL) i flaskerne, blev flaskerne inkuberet ved 20° C under omrystning (95 min^-1).

Erlenmeyerkolberne blev inkuberet med et omvendt bægerglas over for at undgå kontamineringer med støv (ifølge van der Kooij et al. /1995/). To sæt "red cap"-flasker blev inkuberet med låget opad (ingen kontakt imellem indlæg og vandfase) og to sæt med låget nedad (kontakt imellem indlæg og vandfase) - et med "gamle" indlæg og et med "nye" indlæg. Undersøgelsen blev således udført med 3 Erlenmeyerkolber, 2´ 3 "red cap"-flasker med "nye" indlæg og 2´ 3 "red cap"-flasker med "gamle" indlæg.

Dag 7 blev alle "red-cap"-flasker og Erlenmeyerkolber podet med P17, og derefter indkuberet (uden kontakt mellem vandfase og indlæg) ved 15° C med kimtalsbestemmelse dag 0, 5, 7, 10, 14, 20, 25. Dag 25 blev alle flasker og kolber tilsat 1 mL acetat-opløsning (der resulterede i omkring 25 mg acetat-C/L i de enkelte prøver) for at undersøge om der var hæmmende faktorer i vandfasen. Efterfølgende blev kimtallet bestemt dag 28 og 30, idet P17 med den anvendte acetat-koncentration ville være udvokset inden for 5 døgn).

C.3.2. Resultater

Der var mindre end 20 CFU/mL P17 i vandfasen i to af flaskerne, hvor "nye" indlæg var i kontakt med vandfasen, hvorfor disse blev podet med P17 på ny dag 25, forud for kimtalsbestemmelse og tilsætning af acetat. Vækstkurver for P17 er afbilledet på Figur 0-1, og maksimale AOC_P17-koncentrationer er angivet i Tabel 0-1.

De meget høje værdier efter tilsætning af acetat til Erlenmeyerkolberne samt værdien for "Erlenmeyer 3" dag 25 skal nok ikke tolkes som et reelle respons. Propperne satte sig fast i slibene imellem de enkelte kimtalsbestemmelser, hvilket betød, at der blev rørt meget ved området omkring kolbehalsen og proppen (især ved de tre sidste gange). Desuden stod der vand i slibene; såfremt dette var blevet fjernet ved opvarmning af kolbehalsen over en gasflamme ville det (pga. den lille flaskestørrelse) have medført en for kraftig opvarmning af vandfasen.

I to af prøverne, hvor vandfasen var i kontakt med "nye" indlæg, forekom der ingen vækst af P17, heller ikke efter repodning og tilsætning af acetat. I de øvrige flasker var der en tilfredsstillende tilvækst af P17 efter tilsætning af acetat (jævnfør Tabel C-2).

Tabel C-2:
AOC_P17-værdier i vandprøver målt dels i "red cap"-flasker og Erlenmeyerkolber. Vandprøverne blev efter pasteurisering inkuberet ved 20° C under omrystning i 7 døgn. Efterfølgende blev AOC bestemt ved 15° C. Til kontrol for hæmning i vandfasen fik prøverne tilsat acetat dag 25 efter podning

Figur C-1:
Vækstkurver for P17 i vandprøver inkuberet i Erlenmeyerkolber med propper med glasslib og i "red cap"-flasker med låg med henholdsvis "nye" og "gamle" indlæg. "Red cap"-flaskerne blev inkuberet med og uden kontakt imellem indlæg og vandfase. Flaskerne blev inkuberet ved 20° C under omrystning i 7 døgn, hvorefter de blev podet med P17 og inkuberet ved 15° C. Dag 25 blev prøverne tilsat acetat.

Den udeblevne vækst i de to flasker kan enten tilskrives tilstedeværelsen af toksiske/hæmmende stoffer i vandfasen eller, at vandfasen har været kontamineret med bakterier, som ikke blev registreret på R₂A pladerne. I et sådant tilfælde har de pågældende bakterier haft 7 døgns forspring og således udkonkurreret P17. Ved tilsætning af acetat har disse bakterier i stærkt overtal kunne omsætte acetaten, før P17 kunne vokse op. Væksten i den tredje af flaskerne hvor "nye" indlæg var i kontakt med vandfasen var i overensstemmelse med væksten i de øvrige flasker. Sammenholdt med de senere udførte undersøgelser i Kapitel 8, er det mest sandsynligt at den udeblivende vækst af P17 i de to flasker skyldes en kontaminering med uønskede bakterier.

Ses der bort fra de to prøver uden vækst, var der på et 5% signifikantsniveau ikke forskel i P17 koncentrationer som følge af de forskellige inkuberinger under inkuberingsforløbet - hellere ikke hvis der opdeles imellem "nye" indlæg, "gamle" indlæg og Erlenmeyerkolber eller kontakt , ingen kontakt og Erlenmeyerkolber (heller ikke når der ses bort fra Erlenmeyerkolbe nr. 3 dag 25). Det kan således ikke siges, at der er effekt af valg af flasketype eller antallet af rensninger "red cap"-lågenes indlæg har undergået.

International ringest af AOC-bestemmelse

AOC-metoden som beskrevet i afsnit 0 blev anvendt af ÌMT ved en ringtest, der omfattede fem europæiske laboratorier. Indenfor ringtesten blev der anlyseret 30 AOC-prøver med tre forskellige koncentrationer. Fire laboratorier opnåede overensstemmende resultater - heriblandt KIWA og IMT /Jørgensen et al., 2000/. Den anførte udførelse til bestemmelse af AOC kan således betragtes som velegnet.