Lav klorkoncentration

Undersøgelsen blev udført med blåt PEM₍₁₎ materiale og med en 1 mg/L kloropløsning (vandig opløsning af Ca(OCl)₂ indeholdende 35% aktivt klor), svarende til opløsning anvendt til desinfektion af testudstyr af Bellen et al. /1993/. Bakterieantallet blev fulgt over 20 dages ekstraktion ved 10° C i mørke, hvor flaskerne henstod uden omrystning.

Høj klorkoncentration

Undersøgelsen blev udført med sort PEM materiale og med en 22 mg/L kloropløsning (fortyndet natriumhypoklorit-opløsning indeholdende 1% aktivt chor), svarende til koncentration anvendt ved desinfektion af ledningsnet. Bakterieantallet blev fulgt over 55 døgns ekstraktion ved 10° C i mørke med omrystning (95 omdrejninger/min).

Kimtalsbestemmelser blev udført som ved en AOC-bestemmelse, og udstrygningerne blev inkuberet ved 25° C i 14 døgn.

Figur 11:
Principskitse af undersøgelsen af desinfektionsmetoder, jævnfør ovenstående tekst.

5.2 Resultater

Bakteriekoncentrationer for den naturlige population er angivet i Bilag H.

Figur 12:
Vækstkurver for en naturlig population i ekstrakter og blindprøver under ekstraktion af materiale. Ekstraktionen forløb ved 10° C ved et S/V-forhold på 1,0 cm^-1, hvor materialet dels ikke var desinficeret og dels desinficeret ved pasteurisering eller ved henstand i en kloropløsning.
A: blåt PEM₍₁₎ materiale, 1 mg/L kloropløsning, ekstraktionen forløb uden omrystning.
B: sort PEM materiale, 22 mg/L kloropløsning, ekstraktionen forløb med omrystning.

Kloropløsningen på 1 mg/L var ikke tilstrækkelig til at desinficere teststykkerne, idet der ved en udpladning kunne konstateres aktive bakterier i kloropløsningen efter et døgns henstand (data ikke vist). Under ekstraktionen af blå PEM₍₁₎ i upasteuriseret testvand stagnerede vækstkurverne for den naturlige population ikke i løbet af testperioden (Figur 12A), og det kunne således ikke antages, at maksimale bakteriekoncentrationer blev opnået. Der var en mindre forskel på bakteriekoncentrationerne i ekstrakter og blindprøver. Dag 20 var der statistisk signifikant flere bakterier i ekstrakter end i blindprøver testet ved en ensidet variansanalyse på 5 % signifikansniveau.

Sammenlignes bakteriekoncentrationerne for dag 20 (Tabel 9), var der en vis gruppering efter typen af behandling, hvor ‘ingen desinfektion’ af teststykkerne gav de højeste bakteriekoncentrationer og ‘pasteurisering’ de laveste. Denne gruppering var dog ikke statistisk signifikant på 5% signifikansniveau ved en ensidet variansanalyse. Der var således ingen væsentlig effekt af desinfektion på bakteriekoncentrationerne.

Tabel 9:
Bakteriekoncentrationer af en naturlig population i ekstrakter med blåt PEM₍₁₎ materiale og tilhørende blindprøver efter 20 døgns ekstraktion ved 10° C uden omrystning og ved et S/V-forhold på 1,0 cm^-1. Materialet var dels ikke desinficeret og dels desinficeret ved pasteurisering eller ved henstand i en 1 mg/L kloropløsning.

Kloropløsningen på 22 mg/L var tilsyneladende tilstrækkelig til at desinficere teststykkerne, idet der ved en udpladning ikke kunne konstanteres aktive bakterier i kloropløsingen efter et døgns henstand (data ikke vist). Under ekstraktionen af sort PEM i upasteuriseret testvand nåede vækstkurverne for den naturlige population et relativt højt bakterieantal, hvorefter kurverne faldt (Figur 12B), hvilket var et andet forløb end fra undersøgelsen med blåt PEM₍₁₎ materiale.

Tabel 10:
Maksimale bakteriekoncentrationer af en naturlig population i ekstrakter og i tilhørende blindprøver under ekstraktion af sort PEM materiale ved 10° C med omrystning og et S/V-forhold på 1,0 cm^-1. Materialet var dels ikke desinficeret og dels desinficeret ved pasteurisering eller ved henstand i en 22 mg/L kloropløsning.

Sammenlignes de maksimale bakteriekoncentrationer (Tabel 10), var der acceptabel overensstemmelse imellem replika, med undtagelse af ekstraker med 'ingen behandling' af testmaterialet. Medtages alle data vil der ikke være statistisk signifikant forskel ved en ensidet variansanalyse på 5% signifikansniveau imellem behandlingstyper. Hvis der ses bort fra værdien på 27*10⁵ CFU/mL for 'ingen desinfektion' var bakteriekoncentrationerne lavere for 'ingen desinfektion' end for desinfektion, mens der ikke var forskel på de to desinfektionsmetoder. Ekstrakterne havde i begge tilfælde højere bakteriekoncentrationer end blindprøverne.

5.3 Diskussion

Desinfektion havde ingen effekt på afgivelsen fra blåt PEM₍₁₎ materiale ved undersøgelsen med 1 mg Cl₂/L. For undersøgelsen med sort PEM materiale og 22 mg Cl₂/L var der for stor variation på replika for 'ingen desinfektion' til, at der entydigt kunne afgøres, hvorvidt der var en effekt af disinfektion. En eventuel effekt må under alle omstændigheder accepteres, da fremstilling af ekstrakter uden tilstedeværelse af aktive bakterier kræver desinfektion af testmaterialet.

For begge PEM materialer var der ikke forskel mellem de maksimale bakteriekoncentrationer som følge af desinfektionsmetoden. Den korte opvarmning og en eventuel oxidation af overfladerne havde således ingen eller samme effekt på afgivelsen, og både pasteurisering og kloring kunne således vælges som desinfektionsmetode. Der er dog en risiko forbundet ved at anvende kloring, da der kan blive overført klorrester med materialet, hvis teststykkerne ikke skylles grundigt nok efter henstand i kloropløsningen. Dette kan hæmme bakterievæksten i testflaskerne, og således resultere i for lave AOC-værdier.

Den store forskel på forløb af vækstkurver i ekstrakterne af henholdsvis blåt PEM₍₁₎ og sort PEM kunne dels skyldes de forskellige materialetyper, men omrystningen under ekstraktionen af det sorte PEM materiale, kan også have haft effekt. Omrystningen kan have fjernet de afgivende stoffer fra zonen omkring teststykkerne, hvorved stofferne hurtige er blevet tilgængelige for den naturlige population.

Foretages en generel sammenligning af vækstkurver for den naturlige bakteriepopulation og vækstkurver for P17 og NOX, var der større forskel på niveauet af vækstkurverne imellem ekstrakter og blindprøver ved anvendelse af renkulturer. Anvendelse af renkulturer øger således følsomheden af afprøvningen, når kimtallet opgøres ved udpladning på R₂A-agar.

Undersøgelserne med blåt og sort PEM materiale viste, at der ikke var forskel på afgivelsen fra materialerne som følge af, om disse var desinficeret ved pasteurisering eller ved henstand i kloropløsning. Der blev derfor fortsat med pasteurisering, som desinfektionsmetode, da denne metode indebærer mindre risiko for introducering af fejlkilder.

6 Sekventielle ekstraktioner

Det blev undersøgt, hvordan afgivelsen fra de polymere materialer forløb over tid. En kraftig initial afgivelse med en efterfølgende negligibel afgivelse vil kun give problemer i forbindelse med ibrugtagning af nye rør, hvor der kan tages de nødvendige forholdsregler. En konstant middelafgivelse over tid vil derimod betyde en konstant understøttelse af mikrobiologisk vækst, og kan således give anledning til problemer i ledningsnettet over en længere periode. For at kunne undersøge afgivelsen over tid blev et materiale ekstraheret sekventielt, ved at ekstrahere det enkelte sæt teststykker af flere omgange. Desuden blev det undersøgt, om omrystning under ekstraktion af materialet havde effekt på afgivelsen.

6.1 Forsøgsgang

Sort PEM materiale blev ekstraheret med og uden omrystning (95 omdrejninger/min) ved to sæt S/V-forhold: 0,5 og 1,0 cm^-1. Materialet blev ekstraheret i perioder á 15 døgn ved 10° C i mørke.

De forbehandlede teststykker (pasteuriseret i 30 minutter) blev fra dag 0 ekstraheret i pasteuriseret testvand. Efter endt ekstraktion blev teststykkerne overført til nyt pasteuriseret testvand, og derefter atter ekstraheret i 15 døgn. Ekstrakterne blev podet med P17, og derefter inkuberet ved 15° C med kimtalsbestemmelse på dag 0, 3, 5, 7, 10, 15 og 25. Der blev udført 4 på hinanden følgende ekstraktioner. I Figur 13 er angivet en principskitse af undersøgelsen med sekventielle ekstraktioner.

Figur 13:
Principskitse af undersøgelsen med sekventielle ekstraktioner, jævnfør ovenstående tekst.

6.2 Resultater

Bakteriekoncentrationer og AOC_P17-værdier er angivet i Bilag H.

Figur 14:
Gennemsnitlige vækstkurver for P17 og NN i ekstrakter af sort PEM materiale og i tilhørende blindprøver. De sekventielle ekstraktioner forløb over 15 døgn ved 10° C. Efter materialet var taget op og overført til frisk testvand, blev ekstrakterne podet med P17 og indkuberet ved 15° C.
A: Vækstkurver i ekstrakter fremstillet uden omrystning.
B: Vækstkurver i ekstrakter fremstillet med omrystning.
C: Vækstkurver i blindprøver fremstillet med omrystning.

Testvandet i det første sæt ekstrakter var kontamineret med en bakterie (herefter NN), som ikke blev inaktiveret ved pasteurisering i 30 minutter. I testvandet til de øvrige sæt ekstrakter (dag 15-60) lykkedes det inaktivere NN ved at hæve pasteuriseringstiden fra 30 til 45 minutter, men NN blev overført med teststykkerne fra det første sæt ekstrakter til de næste. NN var således tilstede sammen med materialet under ekstraktion, hvorved ekstraktion ikke foregik uden tilstedeværelse af aktive bakterier. Dette havde kun mindre betydning, da NN havde meget ringe vækst ved 10° C, og derfor kun var tilstede i små koncentrationer (< 50 CFU/mL) ved afslutningen af hver ekstraktionsperiode. Når ekstrakterne blev overført til 15° C efter podningen med P17, voksede NN til gengæld op på samme måde som P17. NN dannede 1-2 mm beige-grå kolonier på R₂A-agar, og kunne således let skelnes fra P17, men blev ikke nærmere identificeret.

I Figur 14 er gennemsnitlige vækstkurver for P17 og NN afbilledet for de udførte ekstraktioner. Kontamineringen med NN medførte, at der ikke kunne beregnes en direkte AOC_P17-værdi for afgivelsen fra materialet, men niveauet for vækstkurverne var relativt konstant fra 1. til 4. ekstrakt.

6.3 Diskussion

Tilstedeværelsen af NN komplicerede fortolkningen af resultaterne, da der var et konkurrenceforhold imellem P17 og NN. I ekstrakterne, hvor der var afgivet stoffer fra materialet, som P17 kunne udnytte, havde P17 en konkurrencemæssig fordel og opnåede højere koncentrationer end NN. I blindprøverne kunne NN bedre konkurrere med P17 om de substrater, begge bakteriestammer kunne omsætte, hvilket medførte, at koncentrationen af NN var højere i blindprøverne end i ekstrakterne. På denne baggrund kunne forskellen i bakteriekoncentrationer mellem ekstrakter og blindprøver ikke direkte benyttes til at fastlægge en AOC-værdi for afgivelsen. Da blindværdierne for P17 fra 1. til 4. sæt imidlertid lå på et stabilt niveau, kunne det afgøres, hvordan afgivelsen fra materialet forløb over tid, ved at sammenligne niveauet for vækstkurverne i 1. til 4. sæt ekstrakter.

Det maksimale antal P17, der blev opnået i ekstrakterne, var på samme niveau i de fire sæt ekstrakter, hvilket indikerede, at der ikke kun var tale om en initiel afgivelse, men en kontant afgivelse over de undersøgte 60 døgns ekstraktion. Sammenlignes ekstrakter fremstillet med og uden omrystning, var der en klar effekt som følge af omrystning, idet antallet af P17 i ekstrakterne fremstillet med omrystning var ca. 50% større end i ekstrakter fremstillet uden. Derimod var der ikke den store effekt af S/V-forhold, idet P17 koncentrationer lå på samme niveau i ekstrakter fremstillet med S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm^-1. Antallet af NN var derimod ikke påvirket af hverken omrystning eller anvendte S/V-forhold, hvilket - sammenholdt med at der blev opnået højere koncentrationer af NN i blindprøverne end i ekstrakterne - indikerede, at NN først og fremmest udnyttede testvandets substrat.

Især for ekstraktioner foretaget med omrystning svingede afgivelsen fra teststykkerne imellem triplikaterne. Dette kunne imidlertid være et udtryk for, at forløbet for afgivelsen varierede lidt imellem de enkelte sæt teststykker, men at den samlede afgivelse over tid ellers i øvrigt kunne være ens. I Tabel 11 er akkumulerede værdier for maksimale bakteriekoncentrationer beregnet efter det 4. ekstrakt (60 døgns ekstraktion) for hvert enkelt sæt teststykker, idet samtlige vækstkurver er medtaget.

I nogle af ekstraterne blev vækstmaksimum nået allerede på dag 3. Dette betød, at de ekstra indførte kimtalsbestemmelser for nogle af ekstrakterne medførte, at der blev registreret en højere maksimal bakteriekoncentration, end hvis den anden kimtalsbestemmelse først var blevet udført dag 5. En intensivering af kimtalsbestemmelserne kan således medføre en generel stigning i registrerede maksimale bakteriekoncentrationer.

Tabel 11:
Akkumulerede maksimale værdier for bakteriekoncentrationerne i ekstrakter af sort PEM materiale beregnet efter 60 døgns ekstraktion (4. ekstrakt). Ekstraktionerne forløb over 15 døgn ved 10° C og ved S/V-forhold på henholdsvis 0,5 og 1,0 cm^-1 med og uden omrystning. Efter materialet var taget op og overført til frisk testvand, blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C. De akkumulerede kurver kan ses i Bilag D.

De udførte undersøgelser med sort PEM materiale viste, at afgivelsen fra materialet er konstant over 60 døgn, og således ikke foregår som en kraftig initial afgivelse. Endvidere blev det klarlagt, at omrystning under ekstraktion øger afgivelsen fra materialet.

7 S/V-forhold

I undersøgelsen med sekventielle ekstraktioner af sort PEM var der ikke den store forskel i P17 koncentration mellem S/V-forhold på henholdsvis 0,5 og 1,0 cm^-1. For at afklare om afgivelsen fra de polymere materialer afhænger af S/V-forholdet, blev der udført en række undersøgelser med varierende S/V-forhold.

Indledningsvis blev det undersøgt, om et andet materiale ville give en lige så lille forskel i P17 koncentration mellem S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm^-1 som sort PEM. Ekstraktionstidens indflydelse på afgivelsens størrelse blev undersøgt ved to forskellige ekstraktionstider.

For at undersøge S/V-forholdets indflydelse for AOC_P17-afgivelsen blev 7 S/V-forhold undersøgt i intervallet 0,07 - 1,38 cm^-1 med hovedvægt på de mindste S/V-forhold. Udvalgte S/V-forhold blev endvidere undersøgt ved en kortere ekstaktionstid, for at undersøge hvor hurtigt en eventuel mætning kunne indtræde. For at få en bedre bestemmelse af det maksimale kimtal blev kimtallet bestemt flere gange under væksten af P17 end ved tidligere undersøgelser.

Figur 15:
Principskitse af undersøgelsen med S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm^-1, jævnfør nedenstående tekst.

7.1 Forsøgsgang

7.1.1 S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm^-1

Undersøgelsen blev udført med blåt PEM₍₁₎ materiale. Der blev opstillet 2 sæt prøver i triplikater: Prøver med S/V-forhold på henholdsvis 0,5 og 1,0 cm^-1 (teststykker desinficeret ved 30 minutters pasteurisering) og blindprøver kun med ballastmateriale. De to sæt prøver blev ekstraheret over henholdsvis 9 og 20 døgn ved 10° C uden omrystning.

Ekstrakterne blev podet med P17 og inkuberet ved 15° C, hvor væksten af P17 fulgt ved bestemmelse af kimtal dag 0, 5, 7, 10, 15 og 20. Figur 15 angiver en principskitse af forsøgsgangen.

7.1.2 S/V-forhold i intervallet 0,06-1,38 cm^-1

Undersøgelsen blev udført med blåt PEM₍₂₎ materiale. Der blev opstillet prøver i triplikater for S/V-forholdene 0,07; 0,14; 0,27; 0,41; 0,55; 0,69 og 1,38 cm^-1 samt blindprøver kun med ballastmateriale. Ekstraktionen forløb over 15 døgn ved 20° C med omrystning (95 omdrejninger/min). For S/V-forholdene 0,14 og 0,69 cm^-1 blev der (på et senere tidspunkt) opstillet et ekstra sæt prøver samt blindprøver, der blev ekstraheret i 5 døgn. Ekstrakterne blev podet med P17 og inkuberet ved 15° C, hvor kimtallet blev bestemt dag 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 og for 5 døgns ekstraktionerne endvidere dag 20. Figur 16 angiver en principskitse af forsøgsgangen.

Figur 16:
Principskitse af undersøgelsen med S/V-forhold i intervallet 0,07-1,38 cm^-1, jævnfør ovenstående tekst.

7.2 Resultater

Bakteriekoncentrationer og AOC_P17-værdier er angivet i Bilag H.

7.2.1 S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm-1

Vækstkurverne for P17 i 9 døgns ekstraktionerne adskilte sig markant fra vækstkurverne i 20 døgns ekstraktionerne (Figur 17). Ligeledes var der tydelig forskel på niveauet for vækstkurver i ekstrakterne og i blindprøverne. Derimod var der ikke den store forskel som følge af S/V-forhold. Med 9 døgns ekstraktion ved S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm^-1 var afgivelsen 24 og 29 mg acetat-C/L, mens den tilsvarende afgivelse med 20 døgns ekstraktion var 56 og 50 mg acetat-C/L (jævnfør Tabel 12). Ved et givent S/V-forhold var fluxen således konstant, idet der blev opnået gennemsnitlige flux af samme størrelsesorden for 9 døgns- og 20 døgns ekstraktionerne (Tabel 13).

Figur 17:
Vækstkurver for P17 i ekstrakter af blåt PEM₍₁₎ materiale og i tilhørende blindprøver. Ekstraktionen forløb ved 10° C uden omrystning ved S/V-forhold på henholdsvis 0,5 og 1,0 cm^-1.
A: 9 døgns ekstraktion; B: 20 døgns ekstraktion. Efter materialet var taget op blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C.
  

Tabel 12:
Gennemsnitlige AOC_P17-værdier i ekstrakter af blåt PEM₍₁₎ materiale og i tilhørende blindprøver. Ekstraktionen forløb ved 10° C uden omrystning ved S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm^-1 og ekstraktionsperioder på 9 og 20 døgn. Efter materialet var taget op, blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C.

Tabel 13:
Gennemsnitlige flux for blåt PEM₍₁₎ materiale. Ekstraktionen forløb ved 10° C uden omrystning ved S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm^-1 og ekstraktionsperioder på 9 og 20 døgn. Efter materialet var taget op, blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C.

7.2.2 S/V-forhold i intervallet 0,07-1,38 cm^-1

Vækstkurverne for P17 i 5 døgns ekstraktionerne adskilte sig markant fra vækstkurverne i blindprøverne (Figur 18), og 5 døgns ekstraktion var således tilstrækkeligt til at observere en afgivelse fra materialet. Der var endvidere forskel på afgivelsen som følge af S/V-forhold; for S/V-forholdet 0,14 cm^-1 blev der målt 23 mg acetat-C/L og for S/V-forholdet 0,69 cm^-1 31 mg acetat-C /L (Tabel 14).

Figur 18:
Sammenligning af gennemsnitlige vækstkurver for P17 i ekstrakter af blåt PEM₍₂₎ materiale og i tilhørende blindprøver fremstillet med 5 og 15 døgns ekstraktion. Ekstraktionen forløb ved 20° C med omrystning. Efter materialet var taget op, blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C.

Ved S/V-forhold på 0,14 cm^-1 var afgivelsen 23 m g acetat-C/L ved 5 døgns ekstraktion og 14 ug acetat-C/L ved 15 døgns ekstraktion. Ved S/V-forhold på 0,69 cm^-1 var afgivelsen 31 ug acetat-C/L ved 5 døgns ekstraktion og 57 ug acetat-C/L ved 15 døgns ekstraktion. Afgivelsen var således lavere med 15 døgns ekstraktion end med 5 døgn ved S/V-forhold på 0,14 cm^-1, men højere ved S/V-forhold på 0,69 cm^-1 (Figur 18 og Tabel 14).

Tabel 14:
Gennemsnitlige AOC_P17-værdier i ekstrakter af blåt PEM₍₂₎ materiale og tilhørende blindprøver. Ekstraktionen forløb ved 20° C med omrystning ved varierende S/V-forhold og med ekstraktionsperioder på 5 og 15 døgn. Efter materialet var taget op, blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C.

Vækstkurverne for P17 i 15 døgns ekstraktionerne adskilte sig ligeledes markant fra vækstkurverne i blindprøverne, og der var en tydelig effekt af varierende S/V-forhold (Figur 19). Der var en klar tendens til, at den målte AOC_P17-værdi i vandfasen var større med stigende S/V-forhold (Figur 20 og Tabel 14), dog med en indikation af, at der optrådte en form for mætning af vandfasen med stigende S/V-forhold.

Såfremt afgivelsen fra materialerne er konstant per overfladeareal uanset anvendte S/V-forhold, ville en afbildning af flux som funktion af S/V-forhold resultere i en vandret linie. Beregnes flux for de anvendte S/V-forhold opnås imidlertid en omvendt proportional sammenhæng imellem flux og S/V-forhold (Figur 21 og Tabel 15), hvilket igen indikerer at afgivelsen til vandfasen falder med stigende S/V-forhold.

Figur 19:
Gennemsnitlige vækstkurver for P17 i ekstrakter af blåt PEM₍₂₎ materiale fremstillet med forskellige S/V-forhold og i tilhørende blindprøver. Ekstraktionen forløb over 15 døgn ved 20° C med omrystning. Efter materialet var taget op, blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C.
    

Figur 20:
Afgivelse fra blåt PEM₍₂₎ materiale som funktion af anvendte S/V-forhold (de enkelte ekstrakters AOC_P17-værdi er fratrukket gennemsnittet af blindværdierne). Ekstraktionen forløb over 15 døgn ved 20° C med omrystning ved varierende S/V-forhold. Efter materialet var taget op, blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C. Bemærk logaritmisk skala og indlagte logaritmiske tendenskurve.
    

Figur 21:
Gennemsnitlige flux for blåt PEM₍₂₎ materiale som funktion af anvendte S/V-forhold (blindværdier fratrukket inden beregning). Ekstraktionen forløb over 15 døgn ved 20° C med omrystning ved varierende S/V-forhold. Efter materialet var taget op, blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C.
   

Tabel 15:
Gennemsnitlige flux for blåt PEM₍₂₎ materiale. Ekstraktionen forløb ved 20° C med omrystning ved varierende S/V-forhold og med ekstraktionsperioder på 5 og 15 døgn. Efter materialet var taget op, blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C.

7.3 Diskussion

Undersøgelserne indikerede klart, at afgivelsen per overfladeareal er omvendt proportional med det anvendte S/V-forhold. Desuden ser det ud til, at der eksisterer et øvre S/V-forhold, hvorover der ved højere S/V-forhold ikke afgives væsentligt mere til vandfasen ved en given ekstraktionstid.

Figur 22:
Flux for 15 døgns ekstraktioner af blåt PEM₍₂₎ materiale fremstillet ved forskellige S/V-forhold afbildet som funktion af henholdsvis overfladeareal og masse. Ekstraktionerne blev udført ved 20° C med omrystning, og den efterfølgende vækst af P17 foregik ved 15° C.

Ved 20 døgns ekstraktion uden omrystning af blåt PEM₍₁₎ materiale ved 10° C og et S/V-forhold på 0,5 cm^-1 var der ikke væsentlig forskel i afgivelsen mellem S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm^-1. Ved 15 døgns ekstraktion med omrystning af blåt PEM₍₂₎ materiale ved 20° C og et S/V-forhold på 0,55 cm^-1 var der forskel i afgivelsen mellem S/V-forhold på 0,55 og 1,38 cm^-1, men ikke væsentlig forskel mellem S/V-forhold på 0,69 og 1,38 cm^-1. Ved hvilket S/V-forhold, videre afgivelse til vandfasen hæmmes, vil således være styret af ekstraktionsforholdene.

Den uventede sammenhæng imellem S/V-forhold og afgivelse kunne måske forklares ved at afgivelsen i højere grad er afhængig af massen af materiale end af overfladearealet. I undersøgelsen med PEM₍₂₎ var der dog ikke bedre sammenhæng mellem flux og masse end mellem flux og overfladeareal (Figur 22). Snitfladerne udgjorde forskellige andele af det totale overfladeareal ved forskellige S/V-forhold (mellem 3 og 17%), men der var ingen indikation af, at snitfladerne havde signifikant indflydelse på de opnåede flux.

Det øgede antal kimtalsbestemmelser viste eksponentiel vækst de første 2-3 døgn. Undersøgelserne viste desuden, at det er vigtigt at inkludere dag 3 og dag 4 efter podning for at registrere det reelle maksimale bakterieantal. Det maksimale bakterieantal forekommer afhængigt af både substrattype og koncentration efter forskellige inkuberingstider, der ikke kan forudsiges,. Til eksempel blev det maksimale bakterieantal registreret i de enkelte ekstrakter mellem dag 3 og 7 i undersøgelsen med 7 forskellige S/V-forhold.

Mellem 9- og 20 døgns ekstrakterne var der udover forskellen i koncentrationen af P17 også forskel på vækstkurvernes forløb. I 20 døgns ekstrakterne blev det maksimale antal bakterier opnået efter kort inkubationstid, hvorefter vækstkurverne faldt kraftigt, mens P17 i 9 døgns ekstrakterne voksede støt gennem hele inkuberingsperioden (Figur 17). Erfaringer på IMT viser, at dette gælder generelt for P17 som renkultur; med højere substratkoncentrationer opnås det maksimale antal tidligere i inkuberingsforløbet og vækstkurven falder kraftigere.

Afgivelsen fra polymere materialer til vandfasen steg indtil et givent S/V-forhold, hvorefter der ikke blev afgivet væsentligt mere til vandfasen, selvom S/V-forholdet blev øget. Det aktuelle S/V-forhold er givetvis ikke universelt for hverken materialer eller testforhold. Et S/V-forhold på 0,5 cm^-1 (svarende til en indre rørdiameter på 4 cm) blev valgt ud fra de udførte forsøg, da dette S/V-forhold lå i det dynamiske område ved 20° C og gav et respons signifikant højere end blindværdierne. Umiddelbart havde massen af materialet eller andelen af snitfladearealet ikke større betydning for fluxen end S/V-forholdet.

8 Undersøgelse af udvalgte materialer

Vækstkurverne for P17 i ekstrakterne (serie 1) kunne ikke direkte omsættes til en AOC-værdi for afgivelsen fra de enkelte materialer på samme måde som i tidligere undersøgelser. Dels var der i nogle tilfælde store afvigelser mellem de enkelte triplikater, og dels svarede vækstkurverne ikke til de tidligere, idet maksimale bakterieantal generelt blev opnået senere i vækstforløbet. Desuden var P17 antallet i en del af ekstrakterne lavere end i blindprøverne. For at undersøge om en hæmningseffekt (f.eks. tilstedeværelsen af toksiske forbindelser) kunne forklare de opnåede vækstkurve, blev alle ekstrakterne dag 29 podet med 100 CFU/L P17 for at påvise tilstedeværelse af P17 (før kimtalsbestemmmelse dag 29) og tilsat 1 mL acetatopløsning til en slutkoncentration på ca. 20 mg acetat-C/L. Såfremt der ikke var nogen faktorer, som hæmmede væksten af P17, skulle dette resultere i en tilvækst i AOC på omkring 20 mg acetat-C/L. Bakterieantallet blev bestemt 3 og 5 døgn efter tilsætningen af acetat. Vækstkurver for P17 i ekstrakterne, maksimale AOC_P17-værdier samt tilvæksten som følge acetattilsætningen ses angivet som serie 1 i Bilag E. Der var ikke entydig sammenhæng imellem hvilke ekstrakter, der havde resulteret i lavere P17 koncentrationer end blindprøverne og hvilke ekstrakter, der gav et lavere antal P17 end forventet som følge af acetattilsætningen. Det var derfor ikke umiddelbart til at konkludere, om resultaterne skyldes tilstedeværelsen af toksiske forbindelser.

Da der var flere faktorer, der viste sig anderledes end forventet i undersøgelsen af de fem materialer, blev forsøget gentaget 3 måneder senere (serie 2) med de samme materialer fra samme bacth som i den første undersøgelse. Materialerne havde siden modtagelse fra producenterne været opbevaret indpakket i stanniol ved stuetemperatur. Ekstrakterne blev dag 20 tilsat 1 mL acetatopløsning til en slutkoncentration på ca. 25 mg acetat-C/L for at undersøge tilstedeværelse af hæmmende forbindelser. Vækstkurver for P17 i ekstrakterne, maksimale AOC_P17-værdier samt tilvæksten som følge acetattilsætningen ses angivet som serie 2 i Bilag E. Der var samme problemer med manglende overensstemmelse imellem triplikater og imellem ekstrakter af materialer og blindprøver som under serie 1, og der blev heller ikke set den forventede tilvækst ved tilsætningen af acetat. De to seriers blindværdier stemte overens, men der var ikke videre overensstemmelse imellem opnåede AOC_P17-værdier fra serie 1 og serie 2 (jævnfør Tabel 16).

Der blev ikke konstateret kontamineringer med uønskede bakterier ved kimtalsbestemmelserne på R2A-agar med en inkubationstid på 2-3 døgn ved 25° C (senere undersøgelser viste dog, at kontaminerende bakterier først voksede frem på R₂A-agar, når inkubationstiden blev forlænget til 9-14 døgn , jævnfør Bilag G).

ATP (adosine triphosphat) findes i alle levende celler og fungerer som cellernes energilager. ATP er således et indirekte mål for bakterieantallet (jævnfør analyseprincip og metode i Bilag F).

ATP-indholdet i prøver fra dag 0 for serie 1 og 2 blev analyseret for at afklare, om de afvigende resultater kunne tilskrives en kontaminering med uønskede bakterier. ATP-niveauer £ 5 pg ATP/mL er normalnivauet for en ikke-kontamineret drikkevandsprøve podet med P17. De målte ATP-værdier ses i Tabel 16 sammen med de i ekstakterne opnået AOC_P17-værdier.

Tabel 16:
AOC_P17-værdier i ekstrakter af polymert materiale (blindværdi ikke fratrukket) samt tilhørende ATP-værdier for dag 0. Ekstraktionerne blev udført ved 20° C over 15 døgn med omrystning, mens væksten af P17 foregik ved 15° C. Skraverede værdier angiver ekstrakter, der har været kontamineret med uønsket bakterier under ekstraktionen.

De forhøjede ATP-værdier for nogle af ekstrakterne viste, at de havde været kontamineret med uønskede bakterier under ekstraktionen, og det var konsekvent disse ekstrakter, hvor AOC_P17-værdi var lavere end forventet. Dette kan forklares ved, at de kontaminerende bakterier havde opbrugt det tilgængelige substrat, eventuelt allerede under ekstraktionen, så P17 ikke kunne vokse i ekstraktet. Da de kontaminerende bakterier voksede langsommere end P17 på agarpladerne gav de kontaminerende bakterier ingen synlige kolonier ved kort tids inkubering af agarpladerne. ATP-målingen kunne derimod påvise bakteriernes tilstedeværelse.

Ingen af blindprøverne var kontamineret, hvilket kunne tyde på at problemet med overlevelse af uønskede bakterier var forbundet med tilstedeværelsen af materialet. Da tidligere undersøgelser havde været udført med samme batch PEM materialer (hvor der ikke havde været kontamineringer), måtte problemet med overlevelse af uønskede bakterier kunne tilskrives en ændring i det leverede vand - enten selve testvandet eller det postevand, der anvendes til skylning af testmaterialet inden ekstraktionen. Da uønskede bakterier også havde overlevet under undersøgelsen med sekventielle ekstraktioner (jævnfør Kapitel 6), men blev inaktiveret ved at hæve pasteuriseringstiden, blev effekten af forskellige pasteuriseringsforhold og kloring på de uønskede bakterier undersøgt (Bilag G). De pågældende bakterier kunne inaktiveres ved pasteurisering (70° C, 30 min) i vand uden materiale, men kunne overleve, når de blev pasteuriseret i vand med materiale tilstede. Denne observation bekræftede den generelle opfattelse af, at bakterier er mere modstandsdygtige, når de er fasthæftede. Ud fra den udførte undersøgelse blev det besluttet at gentage undersøgelsen af de fem materialer, idet pasteuriseringen blev ændret til 70° C i 30 min. AOC_P17-værdier i ekstrakterne samt ATP-værdier for dag 0 ses i Tabel 16.

Figur 23:
Vækstkurver for P17 i ekstrakter af 5 forskellige polymere materialer og tilhørende blindprøver afbilledet dels som AOC og dels som ATP (kontaminerede prøver sorteret fra). Ekstraktionerne blev udført ved 20° C over 15 døgn med omrystning, mens væksten af P17 foregik ved 15° C.

På trods af ændringen af pasteuriseringen var der i serie 3 fortsat problemer med kontaminering med uønskede bakterier under ekstraktionen. Dog var det en langt mindre del af de uønskede bakterier, der havde kunnet klare den kraftigere pasteurisering, da ATP-værdierne var langt lavere i de kontaminerede ekstrakter i serie 3 end i de to forgående serier. Desuden blev ATP målt i de ikke-kontaminerede ekstrakter fra serie 3 for alle dage hvor der blev bestemt kimtal. Vækstkurver for P17 er afbilledet dels som AOC og dels som ATP i Figur 23 (ATP-data er angivet i Bilag E). Både målt som CFU og AOC var der markant højere AOC_P17 i alle ekstakterne end i blindprøverne. Den gode overensstemmelse imellem de sammenhørende kurver for AOC og ATP indikerer, at ATP-målinger måske vil kunne erstatte kimtalsbestemmelser.

Tabel 17:
AOC_P17-værdier opnået i ekstakter af fem polymere materialer (fratrukket respektive gennemsnitlige blindværdier). Gennemsnit er angivet som aritmetiske gennemsnit med standardafvigelser. Ekstraktionerne blev udført ved 20° C over 15 døgn med omrystning, mens væksten af P17 foregik ved 15° C. Værdier i parenteser indgår ikke i beregning af snit.

Ud fra AOC_P17-værdierne fra ikke-kontamineret ekstrakter fra de tre serier, blev bestemt et gennemsnit for afgivelsen fra de fem materialer på trods af, at der ikke var triplikate værdier for alle materialer fra én serie (Tabel 17). AOC_P17-værdier for de enkelte ekstrakter blev fratrukket den gennemsnitlige blindværdi for de respektive serier inden beregning. To AOC_P17-værdier for henholdsvis blå og sort PEM var afvigende høje (markeret med parentes i Tabel 17). Disse værdier indikerede en forurening med eksternt kulstof (Kap. 3.3.2), og indgik derfor ikke i beregningen af gennemsnit. Da de enkelte ekstrakter stammede fra forskellige serier (med forskellige blindværdier) kunne en gennemsnitlige AOC_P17-værdi ikke bestemmes som beskrevet i Kapitel 3, og i stedet blev det aritmetiske gennemsnit bestemt. Der var en tendens til at der blev opnået højere værdier i ekstrakter af PEM og PVC(org.) end i metalstabiliseret PVC, men på grund af variationen mellem ekstrakterne var disse forskelle ikke signifikante. Der blev målt afgivelser på mellem 27 og 41 mg acetat-C/L svarende til en flux på 3,5-5,5´ 10^-3 mg acetat-C/d/cm².

Værdierne for de to PEM materialer svarer til, hvad der blev set ved tidligere undersøgelser: Fra undersøgelsen af syv S/V-forhold blev der for blå PEM₍₂₎ under tilsvarende testforhold ved et S/V-forhold på 0,55 cm^-1 opnået en værdi for afgivelsen på 31 mg acetat-C/L; for sort PEM blev der ved undersøgelsen af sekventielle ekstraktioner (ekstraktion ved 10° C) opnået 34 mg acetat-C/L i det første ekstrakt på trods af kontaminering med en uønsket bakteriestamme.

9 Modellering af AOC-data

Ved AOC-metoden fastsættes AOC-værdien ud fra en vækstkurves maksimale værdi. På denne måde vil prøver med vidt forskellige vækstkurveforløb (som skitseret på Figur 24) få tillagt den samme AOC-værdi, blot der er opnået samme maksimale bakterieantal. Der er i projektet (og i forbindelse med andre forsøg udført på IMT) observeret en generel tendens til, at jo højere substratkoncentrationer er, desto tidligere i inkubationsforløbet opnås den maksimale bakteriekoncentration, og desto hurtigere falder vækstkurven igen. Forskelle i vækstkurveforløb kan desuden skyldes, at forskellige substrater ikke er lige biotilgængelige for bakterierne, og således vil blive omsat med forskellig hastighed. Der går således information tabt ved ikke at benytte det fulde vækstkurveforløb til fastlæggelse af AOC-værdien. Inddrages hele vækstkurveforløbet (inklusiv decay) vil der formentlig også kunne siges noget om substraternes tilgængelighed, og en mere korrekt AOC-værdi fastlægges. En bedre bestemmelse af AOC-værdien kunne således tænkes opnået, hvis denne fastsættes ud fra en modellering over alle punkter på vækstkurven.

Figur 24:
Skitsering af to forskellige mulige vækstkurveforløb ved udførelse af en AOC-bestemmelse.

9.1 Modelleringen

En typisk vækstkurve for et batchforsøg kan opdeles i tre faser, nemlig lag-, vækst- og henfaldsfasen. I lagfasen er den bakterielle vækst endnu ikke startet, fordi bakterierne endnu ikke har dannet de nødvendige enzymer. I vækstfasen vokser bakterierne eksponentielt indtil væksten begrænses af en faldende substratkoncentration. Når substratet er opbrugt, begynder bakterierne at dø eller gå over i en hvilefase, hvor de ikke umiddelbart kan vokse på traditionelle medier, dvs. antallet reduceres, hvilket kendetegner henfaldsfasen. Lagfasen for en renkultur varer sjældent mere end nogle få timer, hvilket betyder, at den kan negligeres i forhold til det samlede vækstforløb.

Ved den traditionelle AOC-bestemmelse fastlægges hele vækstforløbet ved løbende kimtalsbestemmelser, men det er kun den maksimale bakteriekoncentration i vækstforløbet, der anvendes til beregning af AOC-værdien. Det kan være svært at opnå en sikker bestemmelse af AOC-værdien, fordi kimtalsbestemmelser generelt er behæftet med væsentlig måleusikkerhed. En modellering over hele datasættet kan reducere usikkerheden i AOC-bestemmelsen, da den enkelte måling indgår med mindre vægt.

Ved modelleringen anvendes den basisviden, der er knyttet til bakteriel vækstkinetik. Således kan tilvæksten af bakterier modelleres som en dynamisk proces, hvor væksten beskrives med et simpelt Monod udtryk, kombineret med henfald. Henfaldet kan antages at være proportionalt med antallet af bakterier. Den samlede ligning for tilvæksten af bakterier bliver således:

Hvor X er bakteriekoncentrationen, C er substratkoncentrationen, t er tiden, m _max er observeret maksimal væksthastighed, K_s er halvmætningskonstant og k_henfald er henfaldskonstant.

Fjernelsen af substrat fra vandfasen kan så beskrives som:

Hvor Y er udbyttekonstanten, der i dette tilfælde er bestemt ved P17s vækst på acetat.

Modellen blev opstillet i programmet AquaSim version 2.0 /Reichart, 1995/. For prøver (vækstkurver) blev startkoncentrationen af substrat estimeret af modellen, mens startbiomassen for den respektive serie blev bestemt som et gennemsnit af de målte kimtal umiddelbart efter podningen. Væksthastighed (m _max), halvmætningskonstant (K_s) og henfaldskonstant (k_henfald) blev ved hjælp af modellen bestemt som globale parametre, dvs. fælles for alle vækstforløbene.

9.2 Modelleringsresultater

Datasættene fra undersøgelsen af forskellige S/V-forhold og udvalgte materialer var umiddelbart mest velegnede som grundlag for modelleringen, da begge undersøgelser omfattede et stort antal sammenhørende prøver. 20 vækstkurver fra S/V-undersøgelsen (Kapitel 7) og 29 ikke-kontaminerede vækstkurver fra undersøgelsen af fem polymere materialer (Kapitel 8) blev indlæst og anvendt til parameterestimation.

Generelt syntes modellen at give en god beskrivelse af de målte data. To eksempler på modellering af vækstkurver er vist i Figur 25.

Figur 25:
Eksempel på modellering af vækstkurver med data fra Kapitel 7.

Resultatet af parameterestimationen for S/V-undersøgelsen er angivet i Tabel 18 sammen med værdierne fra den almindelige AOC. Tilsvarende blev AOC-værdierne fra undersøgelsen af udvalgte materialer estimeret (Tabel 19).

Fra modellerne kan der, udover AOC-værdien, yderligere uddrages information vedrørende bakteriernes vækstkinetik. Således kan væksthastighed, halvmætningskonstant og henfaldskonstant bestemmes direkte udfra modellen (Tabel 20). Især væksthastighed og halvmætningskonstant kan have interesse i forhold til en vurdering af nedbrydeligheden af de fra plastmaterialerne afgivne stoffer.

Tabel 18:
AOC_P17-værdier bestemt ved parameterestimation i AOC-model sammenholdt med værdier fra den almindelige beregning. Data fra undersøgelse af forskellige S/V-forhold. - : Ekstrakter der ikke blevet taget med i beregninger (Bilag H); i.m.: ikke modelleret.

På trods af det næringsfattige miljø voksede bakterierne i forsøget med overraskende høj hastighed. Bakteriernes estimerede væksthastighed var sammenlignelige med værdier observeret i aktiv slam anlæg, derimod var halvmætningskonstant og henfaldskonstant væsentligt lavere /Henze et al. 1997/.

I Monod-modellen er halvmætningskonstanten og væksthastigheden stærkt korrelerede, hvorfor der stilles store krav til datamaterialet. Anvendelsen af væksthastighed og halvmætningskonstant som globale parametre forudsætter, at substratomsætningen er ens i de målte vækstforløb, hvilket i teorien kun er tilfældet, hvis der er tale om det samme stof. Generelt bør de globale parametre kun anvendes for nært beslægtede stoffer, hvilket imidlertid kan være vanskeligt at opnå i praksis. De globale variable kan derfor ikke opfattes som et udtryk for P17s generelle vækstkinetik, men er kun gældende for det specielle tilfælde. Mere generelle udtryk for de globale parametre kræver, at forsøgene udføres med den samme type substrat ved forskellige koncentrationer, som i tilfældet med undersøgelse af forskellige S/V-forhold eller ved fremstilling af AOC-standardkurver på kendte kulstofkilder.

Af modelleringen fremgik det tydeligt at kurvetilpasningen til datasættet fra S/V-forholdsundersøgelsen var væsentligt bedre end undersøgelsen med udvalgte materialer. Dette blev til dels afspejlet af at værdien for halvmætningskonstanten i undersøgelsen af udvalgte materialer var høj i forhold til de undersøgte AOC-koncentrationer (1. ordens vækst), hvilket antyder at Monod modellen var ikke var velegnet til beskrivelse af vækstforløbene.

Sammenlignes de to beregningsmetoder ses en afvigelse på ca. 7%, idet modelleringen giver systematisk lavere AOC-værdier (Figur 26). Afvigelsen afspejler til dels, at man ved at benytte ekstremværdier i den almindelige beregning af AOC begår en systematisk regnefejl. En målefejl, der giver et større tal vil blive vægtet højere i forhold til en målefejl, der giver et mindre tal. Således opstår den paradoksale situation, at jo flere målinger man foretager, jo større er sandsynligheden for en høj AOC-værdi.

Figur 26:
Sammenligning mellem beregningsmetoder for AOC-værdier.

Målefrekvensen bør generelt tilpasses den type af information, der skal uddrages af kurveforløbene. Ønskes f.eks. en god bestemmelse af bakteriernes vækstkinetik, er det vigtig at fokusere prøvetagningen omkring den indledende vækstfase. Desuden bør der så vidt muligt udføres forsøg med forskellige startkoncentrationer af substrat.

Samlet set vil en modellering mindske betydningen af usikkerheden på et enkelt punkt og den vil desuden kunne give oplysninger om væksthastigheden og dermed tilgængeligheden af substratet. Dette giver mulighed for at foretage en objektiv analyse af data fra AOC-bestemmelsen For at kunne anvende en modellering til fastlæggelse af AOC-værdier er det dog nødvendigt i langt større omfang at undersøge modelparametrenes afhængighed af substratkoncentration og substrattype.

10 Samlet diskussion

Igennem de indledende undersøgelser til udviklingen af en metode blev det valgt at fastlægge polymere materialers eftervækstpotentiale ved en to-trins-procedure:

1. Steril ekstraktion af materialet
2. AOC-bestemmelse på det færdige ekstrakt

Valget af en steril ekstraktion af materialerne giver mulighed for at teste materialerne under forhold, der ikke ville tillade vækst af testbakterien. Samtidig giver det mulighed for direkte sammenligning af AOC-værdier imellem ekstrakter, da AOC-bestemmelsen altid ved være udført på samme vis, uafhængig af ekstraktionsforhold.

Materialet blev ekstraheret ved nedsænkning i testvandet frem for opfyldning af rørlængder, da dette gav mulighed for at undersøge andre komponenter end rør, såsom fittings, der kan have stor betydning i f.eks. vandhaner. Der er dog to primære ulemper ved at ekstrahere materialerne på denne måde: Der kan kun undersøges komponenter, der er ens på inder- og yderside, og materialet skal udskæres, hvilket medfører at både naturlige overflader og snitflader er i kontakt med vandfasen. Snitfladerne har ikke umiddelbart betydning for afgivelsen, men det er en faktor, der kan give anledning til variation, da den procentdel snitflader udgør af det totale overfladeareal afhænger af det anvendte rørs dimensioner (Tabel 21). Det bør dog så vidt muligt tilstræbes, at snitfladerne udgøre så lille en procentdel af overfladearealet som muligt, da snitfladerne alt andet lige altid vil fremstå mere ru end de naturlige overflader. Snitflader kan undgås ved at ekstrahere rørmaterialer ved opfyldning af rørlængder, der samtidig vil give mulighed for at undersøge rør, som ikke er ens på inder- og ydreside. En sådan ekstraktionsform vil dog i praksis være problematisk at udføre sterilt. Et mål for eftervækstpotentialet for rør med forskellige inder- og yderside vil kunne fastlægges ved den valgte metode ved en undersøgelse af rør fremstillet af indersidematerialet.

Tabel 21:
Procentdel snitflader udgør af totale overfladeareal ved et S/V-forhold på 0,5 cm^-1 for de i projektet undersøgte fem polymere rørmaterialer.

Den væsentligste svaghed ved kombinationen af ekstraktion og AOC-bestemmelse er nødvendigheden af, at ekstraktionen forløber sterilt. I dette projekt har der været en del problemer med at inaktivere testvandets og/eller postevandets naturlige bakteriepopulation. Grunden til at problemerne først opstod undervejs i projektets arbejdet kan formentlig tilskrives ændringer i råvandet, da Lyngby vandværk pumper fra skiftende boringer. I dette projekt kunne problemet med overlevelse af uønskede bakterier formentligt være løst ved at skifte vandtype, hvilket dog ville have medført praktiske besværligheder. Undervejs i arbejdet blev der i nogle tilfælde oplevet relativt høje blindværdier (ekstraktionen af blå PEM₍₂₎ i S/V-undersøgelsen, Kapitel 7 og serie 3 i undersøgelsen af fem polymere materialer, Kapitel 8), hvilket formentlig også kan tilskrives variationer i driften (testvandet kan f.eks. være udtaget lige efter et returskyl). De relativt høje blindværdier har dog ikke haft indflydelse på afgivelsen fra materialerne, hvilket kan ses ved de sammenlignelige værdier fra ikke-kontaminerede ekstrakter mellem serie 1, 2 og 3 i undersøgelsen af fem polymere materialer (jævnfør Tabel 17 i Kapitel 8).

Figur 27:
ATP som funktion af CFU P17 baseret på data fra ikke-kontamineret ekstrakter af fem polymere materialer og tilhørende blindprøver fra serie 3. Ekstraktionerne blev udført ved 20° C over 15 døgn med omrystning, mens væksten af P17 foregik ved 15° C.

ATP-målinger vil eventuelt helt kunne erstatte kimtalsbestemmelser ved bestemmelse af afgivelse fra polymere materialer, hvorved stort set vilkårlige bakteriestammer (renkulturer) eller en naturlig population (blandingskulturer) kunne anvendes som standard. Ved undersøgelsen af ekstraktionsmetoder (Kapitel 4) og undersøgelsen af desinfektion (Kapitel 5) blev der anvendt en naturlig bakteriepopulation, som ved kimtalsbestemmelserne gav langt mindre forskel på ekstrakter og blindprøver end ved anvendelse af P17. Dette kan formentlig tilskrives, at en meget lille andel af bakterierne kunne vokse på R₂A-agar eller ved de anvendte inkubationsforhold. Ved måling af ATP vil der ved anvendelse af en naturlig population formodentlig være langt større forskel på ekstrakter og blindprøver, da alle bakterier vil blive registreret. Et problem ved at anvende ATP som parameter vil dog være, at cellerne kan mobilisere deres ATP-indhold som reaktion på ændringer i vækstforhold og vækststadie /Atlas et al., 1993/. Svært-nedbrydelige stoffer kunne således resultere i et andet ATP-indhold i cellen, end hvis denne udsættes for let-nedbrydelige stoffer.

Ud fra de udførte undersøgelser blev der ikke fundet en simpel lineær sammenhæng imellem afgivelsen udtrykt som AOC_P17-værdi og S/V-forhold (jævnfør Tabel 22). Der var en tendens til øget AOC_P17-værdi i vandfasen jo større mængde materiale, der blev ekstraheret, indtil et vist S/V-forhold, hvorover der ikke blev afgivet væsentlig mere til vandfasen. Ved hvilket S/V-forhold denne hændelse indtræder er formentlig en kombination af materiale, ekstraktionstemperatur og af, om der er omrystning under ekstraktionen. Fluxen viste en tendens til omvendt proportionalitet imellem afgivelsen og S/V-forhold, hvilket ligeledes indikerer, en begrænsning af afgivelsen fra materialet med stigende S/V-forhold. Mekanismen omkring afgivelsen er stadig uklar, da forlænget ekstraktionstid og omrystning gav øget afgivelse ved S/V-forhold, hvor der ikke var forskel i afgivelsen som følge af S/V-forhold. Da en observeret afgivelse ikke direkte kan skaleres med S/V-forhold, kompliceres tolkningen af testresultater.

Tabel 22:
Testforhold og opnåede afgivelser (fratrukket blindværdi) for de udførte undersøgelser med P17. *Ekstrakter var kontamineret med uønskede bakterier (benævnt NN).

I Tabel 22 er resultater fra de udførte undersøgelser med P17 opsummeret. I alle undersøgelserne blev der opnået en signifikant afgivelse fra alle de undersøgte materialer. Med S/V-forhold i intervallet 0,07-1,38 cm^-1 lå AOC_P17-afgivelserne for de undersøgte materialer i intervallet 8-57 mg acetat-C/L. Disse værdier skal vurderes ud fra, at der har været anvendt betydeligt længere opholdstider under ekstraktionen af materialerne, end der normalt vil forekomme i distributionssystemet, og at ekstraktionerne er foretaget i stillestående vand (i nogle tilfælde med lettere omrystning) i modsætning til et (sædvanligvis) kontinuert, om end varierende over døgnet, flow i distributionssystemet. Ligeledes er ekstraktionerne udført sterilt, hvorved der ikke er har været kontakt mellem bakterier og materialer (ingen biofilmdannelse på materialeoverfladerne). I et distributionssystem vil den primære del af biomassen findes som biofilm på rørindersiderne. Det kan ikke afvises, at bakterier i en sådan biofilm vil kunne ’trække’ substrat ud af materialerne, og at en sådan aktiv afgivelse vil have større betydning end den passive afgivelse i de udførte ekstraktionstest. Ligeledes vil bakterier i en biofilm blive udsat for en langt stejlere koncentrationsgradient end bakterierne i vandfasen.

Med disse forbehold i mente, kan der ud fra data i Tabel 22 (der ses bort fra 5 døgns ekstraktionerne) opstilles en simplificeret vurdering af, om bidraget fra polymere materialerne vil have betydning ude i distributionsnettet. For at forenkle beregningerne benyttes antagelsen, at afgivelsen foregår kontinuert over tid.

Distributionsnettet kan efter indre rørdiameter opdeles i hovedledninger 305-1200 mm, forsyningsledninger 50-292 mm /Københavns vand, 1998/ og i stikledninger samt husinstallationer, der går ned til 7 mm. S/V-forholdene er i hovedledningerne 0,03-0,13 cm^-1, i forsyningsledningerne 0,14-0,80 cm^-1 og i stikledninger/husinstallationer 0,80-5,7 cm^-1 (opsummeret i Tabel 23). Sædvanligvis vil opholdstiden i byinstallationer ikke overskride et par dage, mens der ved lange forsyningsledninger til landområder kan være opholdstider op til 2 uger.

Tabel 23:
Generelle S/V-forhold i distributionssystemet.

Derved vil bidraget fra polymere materialer i hovedledningerne kun bidrage med under 1 mg acetat-C/L/d til vandfasen. I forsyningsledningerne vil AOC-bidraget til vandfasen være i en størrelsesorden af 1-3 mg acetat-C/L/d, mens det tilsvarende bidrag i stikledninger/husinstallationer vil være i en størrelsesorden af 3 mg acetat-C/L/d. Disse værdier skal sammenholdes med generelle AOC-niveauer i dansk drikkevand.

I en undersøgelse, der bl.a. omfattede bestemmelse af AOC-niveauer i dansk drikkevand, blev der for 10 danske vandværker fundet værdierne angivet i Tabel 24. Det færdigbehandlede vands AOC-værdier var grupperet med værdier dels under 10 mg acetat-C/L, og dels i et interval imellem 20 og 40 mg acetat-C/L. Sammenholdt med de anslåede niveauerne fra ovenstående afsnit vil afgivelser fra rørmaterialerne have mindre betydning i forbindelse med vand fra den sidste kategori, og vil ved normal drift hellere ikke give direkte anledning til problemer i vand fra den første kategori. Ved lange forsyningsledninger med opholdstider på f.eks. 4 døgn, vil der dog være risiko for, at vandets AOC-indhold kan fordobles under vejen til forbrugeren:

Ligeledes vil vand, der får lov at henstå i husinstallationerne f.eks. hen over en weekend kunne opnå et betydeligt AOC_P17-bidrag:

6-8 mg acetat-C/L svarer til 2,5-3,3*10⁴ CFUP17/mL. Til sammenligning indeholder frisktproduceret vand fra Lyngby vandværk i størrelsesordnen 200 CFU/mL bestemt som kimtal på R₂A-agar.

Ved lange forsyningsledninger kan vandets naturlige indhold af AOC være forbrugt undervejs til forbrugeren, og et AOC-bidrag fra rørmaterialet i husinstallationen vil således få en langt større betydning for vandkvaliteten.

Tabel 24:
AOC-indhold i færdigbehandlet drikkevand fra 10 danske vandværker /Jørgensen et al., 2000/.

11 Konklusion

Ekstraktion af polymere materialer uden tilstedeværelse af aktive bakterier viste sig at være en egnet ekstraktionsmetode, som giver mulighed for at vælge ekstraktionsforholdene uden hensyntagen til bakteriers vækstforhold (høje temperaturer, variation i pH, høje klorkoncentrationer). Ekstraktionsmetoden muliggør desuden, at der også kan udføres f.eks. GC-MS eller toksikologiske undersøgelser af ekstraktet. For at kunne ekstrahere uden aktive bakterier blev materialet desinficeret inden ekstraktionen. I det eksperimentelle arbejde blev der afprøvet to desinfektionsmetoder; pasteurisering og kloring. Der blev ikke set nogen forskel i afgivelsen fra materialerne som følge af desinfektionsmetode, og data gav ikke indikation af, at materialerne blev påvirket af desinfektionen.

Ved den valgte metode kan det dog være vanskeligt at sikre sterile forhold og der er en risiko for kontaminering af ekstrakterne organisk kulstof. Uønskede bakterier kan overleve pasteuriseringen og ekstrakterne kan bliver kontamineret med uønskede bakterier i forbindelse med optagningen af teststykker og efterfølgende podning. Ikke alle de uønskede bakterier detekteres ved kimtalsbestemmelserne i forbindelse med AOC-bestemmelsen. Dette skyldes dels, at pladernes inkubationstid er for kort til, at disse bakterierne når at danne synlige kolonier, og dels at disse bakterier ikke kan danne kolonier på R₂A-agar. Undersøgelser viste, at måling af ATP i forbindelse med kimtalsbestemmelserne er en velegnet metode til at afgøre, om et ekstrakt er blevet kontamineret med uønskede bakterier under ekstraktionen. ATP-målinger vil eventuelt helt kunne erstatte kimtalsbestemmelser ved bestemmelse af afgivelsen fra et polymert materialer, men vil under alle omstændigheder være et godt supplement som kvalitetssikring.

Anvendelse af renkulturer til måling på ekstraktet er at foretrække frem for en naturlig bakteriepopulation ud fra et standardiseringssynspunkt. De udførte undersøgelser viste desuden, at der ved kimtalsbestemmelser på R₂A-agar var mindre forskel imellem prøver og blindprøver ved anvendelse af en naturlig bakteriepopulation end ved anvendelse af de anvendte renkulturer (P17 og NOX).

De indledende undersøgelser med P17 og NOX viste, at de stoffer, der afgives fra de undersøgte materialer, kun har indflydelse på antallet af P17. NOX giver således blot anledning til kolonier, der mindsker præcision af bestemmelsen af P17 ved optællingen, hvorfor bestemmelserne blev udført med P17 alene.

Ved de udførte korttidstest var der en tydelig afgivelse af biotilgængeligt organisk stof fra de undersøgte polymere materialer. Undersøgelser med blåt PEM materiale viste en signifikant afgivelse selv efter kun 5 døgns ekstraktion ved 20° C. Undersøgelserne viste, at der ikke var tale om en kort initial afgivelse, men en afgivelsen over længere tid. I en undersøgelse med sort PEM materiale blev der observeret en konstant afgivelse over 60 døgns ekstraktion. Der blev ikke fundet en entydig sammenhæng imellem afgivelsen og S/V-forhold. Der blev set en tendens til stigende AOC_P17-koncentration i vandfasen med stigende S/V-forhold indtil et vist S/V-forhold, hvor der ikke blev afgivet væsentligt mere til vandfasen. Omregnet til flux var afgivelsen omvendt proportionalt med anvendte S/V-forhold.

Afgivelserne fra de fem undersøgte polymere materialer var af samme størrelsesorden: 3,5-5,5´ 10^-3 mg acetat-C/d/cm², og vil kunne have betydning for den mikrobiologiske kvalitet af drikkevand, såfremt opholdstiden i forsyningsrør og husinstallationer overskrider mere end et par dage.

12 Ordliste

13 Referencer

Aminot, A.; Kerouel, R., 1998, Pasteurization as an alternative method for preservation of nitrate and nitrite in seawater samples, Marine Chemistry, vol.61:3-4:pp. 203-208

Atlas, R. M.; Bartha R., 1993, Microbial ecology - fundamentals and application, 3rd edition, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.

Bellen, E.G.; Abrishami, S.H.; Colucci, P.M.; Tremel; C.J., 1993, Methods for assessing the biological growth support potential of water contact materials, AWWA Research Foundation & American Water Works Association

Boe-Hansen, R., 1998a, Personlig kommentar

Boe-Hansen, R., 1998b, Upublicerede data

CEN, 1993, Note on preliminary results of interlaboratory trial, CEN TC164 WG3 AHG3

Corfitzen, C.B., 1999, Eftervækstpotentiale for polymere materialer anvendt i vandforsyningen - Udvikling af metode, Eksamensprojekt ved Institut for Miljøteknologi, Danmarks Tekniske Universitet

Coulson, H.S., 1972, Polymer types and additives, Plasticisers, stabilisers and fillers (P.D. Ritchie, editor) London ILIFFE books Ldt.

DS/EN 852-1, 1997, Plastrørsystemer til transport af drikkevand - Vurdering af migration - Del 1: Bestemmelse af plastrørs migrationsværdier, Dansk Standard

DFV vejledning, 1995 nr. 10, Planlægning af vandledningers fornyelse

DVF vejledning, 1998 nr. 17, Indledende rapport om vandkvalitet i ledningsnet

Escobar, I.C.; Randall, A.A., 2000, Sample storage impact on the assimiable organic carbon (AOC) bioassay, Water Research vol. 34:5:pp. 1680-1686

Gill, C.O.; Badoni, M., 1997, The hygienic and organoleptic qualities of ground beef prepared from manufacturing beef pasteurized by immersion in hot water, Meat Science, vol. 46:1:pp. 67-75

Gill, C.O.; Jones, T.; Badoni, M., 1998, The effect of ho water pasteurizing treatments on the microbiological conditions and appearances of pig and sheep carcasses, Food Research International, vol. 31:4:pp. 273-278

Hem, L. J.; Norgaard, E.; Efraimsen, H., 1997, Begroing i drikkevannsledninger, Norsk institutt for vannforskning (NIVA)

Henze, M.; Harremoës, P.; Jansen, J.l.C.; Arven, E., 1995, Wastewater treatment, Springer-Verlag Berlin Heidelberg

Jørgensen, C.; Albrechtsen, H-J.; Arvin, E.; Corfitzen, C.B., 2002, Mikrobiel karakteristik og eftervækst i drikkevand, Miljøstyrelsen - Programmet til sikring og forbedring af drikkevandskvaliteten

Kotz, S.; Johnson, N.L.; Read, C.B., 1982, Encyclopedia of statistical sciences, John Wiley & Sons, Inc, New York.

Københavns vand, 1998, Årsberetning 1998

Lorenzen, H., 1993, Ledningsanalyse i Odense, Vandteknik nr. 9:pp.456-464

Lyngby-Tårbæk Kommune, 2000 - Drikkevandsanalyse

Macia, L., 1974, The role of additives in plastics, Edward Arnold (Publishers) Ldt.

Niemelä, S., 1983, Statistical evaluation of results from quantitative microbiological examinations, Nordic committee on food analysis, Report no. 1, 2^nd edition

prEN, 1998, Methods for determining the potential of materials to influence the microbiological quality of drinking water, Draft prENV, WRc

Reasoner, D.J.; Geldreich, E.E., 1985, A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from portable water, Applied and Environmental Microbiology vol.49:1:pp. 1-7

Reichart, P., 1994, AQUASIM - a tool for simulation and data analysis of aquatic systems, Water Science and Technology vol. 30:2:pp.

Schegel, H.G., 1986, General microbiology, sixth edition, Cambridge University Press

Standard methods, 1998, Standard Methods for the examination of water and waste water. 20^th edition. Assimilable organic carbon. APHA. Washington DC

van der Kooij, D., 1990, Assimilable organic carbon (AOC) in drinking water, Drinking water microbiology pp. 57-87 (G.A. McFeters, editor), Brock/Springer series in contemporary bioscience, Springer-Verlag, New York, Berlin

van der Kooij, D.; Veenendaal, H.R., 1995, Determination of the concentration of easily assimilable organic carbon (AOC) in drinking water with growth measurements using pure bacterial cultures. The AOC manual, The Netherlands Water Works Association (VEWIN).

van der Kooij, D.; Visser, A.; Hijnen, W.A.M., 1982, Determining the concentration of easily assimilable carbon in drinking water, Journal of American Water Works Association, vol.74:10:pp. 540-545

Ward, A.; Stensel, H.R.; Ferguson, J.F.; Ma, G.; Hummel, S., 1999, Preventing growth of pathogens in pasterurized digester solids, Water Environment Research, vol.71:2:pp.176-182

ÖKI, 2000, Development of a method for the assessement of microbial growth on pipes for drinking water supply, Österreichisches Kunststoffinstitut.

Bilag A
Materiale oversigt

I det eksperimentelle arbejde blev der anvendt materialer tilsendt direkte fra danske rør-producenter (med undtagelse af PEX-røret). I Tabel 0-1 er materialerne angivet med de dimensioner, der blev anvendt i projektet - materialerne B - F er godkendt til brug i drikkevandsforsyning herhjemme. I nogle tilfælde var det nødvendigt at skærer rørstykkerne op på langs, for at de kunne gå i testflaskerne.

Tabel A-1:
Materialer anvendt i projektets eksperimentelle arbejde.

Bilag B
R₂A-agar

R₂A er et lavsubstrat medie, hvilket gør det velegnet til bestemmelse af kimtal fra oligotrofe miljøer /Reasoner et al., 1985/. R_aA kan indkøbes som et færdigt produkt, der blot skal opløses i destilleret vand efter anvisningen. Fra Difco vil 1 L færdig agar til eksempel indeholde:

Pladerne støbes i Ø=9 cm sterile petriskåle. Da P17 er følsom over for fugt, er det vigtigt, at plader tørres inden de anvendes til AOC bestemmelse.

Bilag C
AOC-metoden

AOC-metoden er et bio-assay, hvor en vandprøves AOC-værdi bestemmes ud fra det antal bakterier, der kan vokse op på de organiske kulstofforbindelser i prøven. Vandprøven tappes i en kulstoffri testflaske, og prøvens naturlige bakteriepopulation inaktiveres ved pasteurisering. Prøven podes efterfølgende med to bakteriestammer, Pseudonomas fluorescens, stamme P17 og Aquaspirillum, stamme NOX, der tilsammen kan omsætte langt størstedelen af de organiske kulstofforbindelser i drikkevand /van der Kooij et al., 1995/. Prøven inkuberes i mørke ved 15° C, og bakterieantallet følges over tid ved at bestemme kimtallet på R₂A, et lavsubstrat medie specielt egnet til bestemmelser på næringsfattige miljøer (sammensætningen af R₂A er angivet i Bilag B). Vækstkurvens maksimale bakterieantal omsættes til prøvens AOC-værdi udtrykt i acetat-C ækvivalenter/L ved brug af udbyttekonstanter for P17 og NOX på acetat. Udbyttekonstanterne for acetat-koncentrationer på 5-250 mg acetat-C/L er 4,1*10⁶ CFU/mg acetat-C for P17 og 1,2*10⁷ CFU/mg acetat-C for NOX /van der Kooij et al., 1995/.

Nedenfor er arbejdsgangen for AOC-metoden gennemgået i den udgave, der dannede grundlag for projektet.

C.1. Udførelse

Alt arbejde med åbne prøver og podekulturer forgår i sterilbænk.

AOC-bestemmelser udføres i triplikat med 200 mL vandprøve i hvert enkelt testflaske (250 mL 'red cap'-flaske [PYREX] med 'red cap'-låg med teflonindlæg [SCHOTT DURAN]). Prøvens naturlige bakteriepopulation inaktiveres ved pasteurisering i 30 minutter ved 60° C. For at varme på prøven i så kort tid som muligt, opvarmes prøven hurtigt i 90° C vandbad. Temperaturen følges i en referenceflaske, der behandles som prøveflaskerne. Når temperaturen i referenceflasken når 60° C, overføres prøven til 60° C varmeskab, hvor den henstår i 30 minutter. Efter afkøling i isbad til testtemperaturen podes prøven med P17 og NOX til en startkoncentration på 200-500 CFU/mL. Prøven inkuberes ved 15° C indpakket i stanniol for at hindre algevækst og photokemisk nedbrydning.

Under inkuberingen følges bakterieantallet ved overfladeudsæd på R₂A, hvor pipetteringer foretages med finnpipetter med engangsspidser af polypropylen. Inden prøveudtagning fra en flaske føres denne i kraftige horisontale cirkelbevægelser for at homogenisere prøven. Når fortynding af en prøve er nødvendig, fremstilles en ti-fold fortyndingsrække ved at overføre 100 m L prøve til eppendorf-rør med 900 m L autoklaveret postevand. Der omblandes ved vortex-mixning, og herudfra fremstilles den videre fortyndingsrække på samme vis, indtil de ønskede fortyndinger er opnået. Skal den ufortyndede prøve udplades, udtages der i stedet 300 mL prøve til tomt eppendorf-rør, hvorfra udpladning fortages og den videre fortyndingsrække fremstilles.

Fra tre fortyndinger udplades 50 m L i triplikater, ialt 9 plader. Kolonier optælles efter 2-3 dages inkubation ved 25° C, idet forskel i kolonimorfologi gør det muligt at skelne imellem P17 og NOX. P17 fremtræder som beigefarvede kolonier på 2-3 mm i diameter, mens NOX vil ses som mindre grå-hvide kolonier med en diameter på 1-2 mm. Plader med over 200 kolonier (af både P17 og NOX) optælles generelt ikke.

For hver enkelt bestemmelse beregnes kimtallet som et vægtet gennemsnit ud fra den totale udstrøgne prøvemængde og det totale antal talte kolonier i prøvemængden. Den observerede spredning (error of the mean, e.o.m) på kimtallet følger en Poisson fordeling og vil følgelig være . Kimtallet bestemmes således som:

C_i: antal kolonier fra enkel udstrygning i fortyndingsrækken
W_i: volumen udstrøget

De højst opnåede kimtal for P17 og NOX omregnes til AOC-værdier ved brug af udbyttekonstanter på acetat. Prøvens total AOC-værdi bestemmes som:

AOC_Total = AOC_P17 + AOC_NOX

C.1.1. Rensningsprocedure for udstyr

Flasker, låg og finnpipetter anvendes udelukkende til AOC-bestemmelse for at hindre, at anden tidligere anvendelse medfører afgivelse af organisk stof eller stof, der virker hæmmende på bakterievækst.

Til desinficering af arbejdsområde og drigalskispatler anvendes der ikke sprit, da dette vil kontaminere prøverne med organisk stof og resultere i forhøjet P17 koncentrationer. Arbejdsområde aftørres med en 0,05% CTMAK-opløsning (cetyltrimethylammoniumchlorid), og drigalskispatler glødes i gasflamme og afkøles inden brug.

C.1.2. Podekulturer

Separate podekulturer af P17 og NOX fremstilles ved opdyrkning af bakterierne ved 15° C i næringssaltsmedie med 1 mg/L acetat /van der Kooij et al., 1995/. Bakteriernes vækst følges ved overfladeudsæd på R₂A, indtil et maksimalt bakterieantal er opnået. Herefter opbevares kulturene i køleskab, hvor de har en holdbarhed på omkring et halvt år.

C.2. Ændringer i forhold til van der Kooij metode

Den ovenfor beskrevet arbejdsgang ved udførelse af AOC-metoden afviger på nogle punkter fra /van der Kooij et al., 1995/. I Tabel 0-1 er de afgørende punkter listet. I den oprindelige AOC-metode udføres bestemmelserne i 1 L Erlenmeyerkolber. Det er imidlertid ofte mere hensigtsmæssigt at benytte "red cap"-flasker til bestemmelserne. Transport og håndtering af prøver er lettere i "red cap"-flasker end i Erlenmeyerkolber, da "red cap"-lågene er skruet fast og dækker hele flaskemundingen. Ved brug af Erlenmeyerkolber risikeres det endvidere, at propperne hopper op under transport og pasteurisering. Der er således umiddelbart langt mindre risiko for at prøverne kontamineres fra omgivelserne ved at anvende "red cap"-flasker. I projektets arbejde var det endvidere hensigtsmæssigt pga. mængden af testmateriale og ønsket om fastholdt S/V-forhold at benytte mindre vandvolumener end 600 mL, hvorfor der blev valgt 250 mL flasker.

Tabel C-1:
Punkter hvor udførelsen af AOC-metoden gennemgået i afsnit 0 afviger fra /van der Kooij et al., 1995/.

Rensningen af testflaskerne er modificeret i forhold til van der Kooij et al.´s forskrift /1995/, da de færreste laboratorier har kapacitet til at gløde et større antal flasker ved 550° C. Den forskrevne metode anses for bedre end den alternative metode foreslået af van der Kooij et al. /1995/, da syrevasken er forlænget, og der anvendes MilliQ-vand (lavt indhold af organisk stof) til skylning.

Autoklavering af fortyndingsrør med fortyndningsvæske medfører ofte en ukontrolleret fordampning af fortyndingsvæsken, hvilket vil give usikkerheder ved fortyndingen. Der opnås derfor en større præcision ved at udmåle fortyndingsvæsken efter autoklaveringen. Derved kan det samtidigt forsvares at anvende mindre volumener ved fremstilling af fortyndingsrækker, så de kan fremstilles i eppendorf-rør og med finnpipetter fremfor stangpipetter, da dette håndteringsmæssigt er mere praktisk (automatpipetter med engangsspidser anvendes af Standard Methods /1998/).

C.3. Undersøgelse af forskellige flaske- og lågtyper

En mulig risiko ved at anvende "red cap"-flasker med tilhørende låg fremfor Erlenmeyerkolber kunne være, at der blev afgivet forbindelser fra lågenes teflon-indlæg til vandfasen, som vil kunne påvirke bestemmelsen. For at kontrollere dette blev der foretaget en sammenlignende undersøgelse med både Erlenmeyerkolber og "red cap"-flasker. Teflon-indlæggene i "red cap"-lågene kan kun holde til at undergå rensningsproceduren et begrænset antal gange, før de skal udskiftes. Det blev derfor endvidere undersøgt, om der var en effekt af, om indlæg (monteret i lågene) havde gennemgået rensningsproceduren én eller flere gange.

C.3.1. Forsøgsgang

Undersøgelsen blev udført med 250 mL Erlenmeyerkolber med tilhørende propper med glasslib og 250 mL "red cap"-flasker med låg, hvor lågenes indlæg henholdsvis havde undergået rensningsproceduren en enkelt gang ("nye" indlæg) eller mere end én gang ("gamle" indlæg). Efter pasteurisering af testvandet (200 mL) i flaskerne, blev flaskerne inkuberet ved 20° C under omrystning (95 min^-1).

Erlenmeyerkolberne blev inkuberet med et omvendt bægerglas over for at undgå kontamineringer med støv (ifølge van der Kooij et al. /1995/). To sæt "red cap"-flasker blev inkuberet med låget opad (ingen kontakt imellem indlæg og vandfase) og to sæt med låget nedad (kontakt imellem indlæg og vandfase) - et med "gamle" indlæg og et med "nye" indlæg. Undersøgelsen blev således udført med 3 Erlenmeyerkolber, 2´ 3 "red cap"-flasker med "nye" indlæg og 2´ 3 "red cap"-flasker med "gamle" indlæg.

Dag 7 blev alle "red-cap"-flasker og Erlenmeyerkolber podet med P17, og derefter indkuberet (uden kontakt mellem vandfase og indlæg) ved 15° C med kimtalsbestemmelse dag 0, 5, 7, 10, 14, 20, 25. Dag 25 blev alle flasker og kolber tilsat 1 mL acetat-opløsning (der resulterede i omkring 25 mg acetat-C/L i de enkelte prøver) for at undersøge om der var hæmmende faktorer i vandfasen. Efterfølgende blev kimtallet bestemt dag 28 og 30, idet P17 med den anvendte acetat-koncentration ville være udvokset inden for 5 døgn).

C.3.2. Resultater

Der var mindre end 20 CFU/mL P17 i vandfasen i to af flaskerne, hvor "nye" indlæg var i kontakt med vandfasen, hvorfor disse blev podet med P17 på ny dag 25, forud for kimtalsbestemmelse og tilsætning af acetat. Vækstkurver for P17 er afbilledet på Figur 0-1, og maksimale AOC_P17-koncentrationer er angivet i Tabel 0-1.

De meget høje værdier efter tilsætning af acetat til Erlenmeyerkolberne samt værdien for "Erlenmeyer 3" dag 25 skal nok ikke tolkes som et reelle respons. Propperne satte sig fast i slibene imellem de enkelte kimtalsbestemmelser, hvilket betød, at der blev rørt meget ved området omkring kolbehalsen og proppen (især ved de tre sidste gange). Desuden stod der vand i slibene; såfremt dette var blevet fjernet ved opvarmning af kolbehalsen over en gasflamme ville det (pga. den lille flaskestørrelse) have medført en for kraftig opvarmning af vandfasen.

I to af prøverne, hvor vandfasen var i kontakt med "nye" indlæg, forekom der ingen vækst af P17, heller ikke efter repodning og tilsætning af acetat. I de øvrige flasker var der en tilfredsstillende tilvækst af P17 efter tilsætning af acetat (jævnfør Tabel C-2).

Tabel C-2:
AOC_P17-værdier i vandprøver målt dels i "red cap"-flasker og Erlenmeyerkolber. Vandprøverne blev efter pasteurisering inkuberet ved 20° C under omrystning i 7 døgn. Efterfølgende blev AOC bestemt ved 15° C. Til kontrol for hæmning i vandfasen fik prøverne tilsat acetat dag 25 efter podning

Figur C-1:
Vækstkurver for P17 i vandprøver inkuberet i Erlenmeyerkolber med propper med glasslib og i "red cap"-flasker med låg med henholdsvis "nye" og "gamle" indlæg. "Red cap"-flaskerne blev inkuberet med og uden kontakt imellem indlæg og vandfase. Flaskerne blev inkuberet ved 20° C under omrystning i 7 døgn, hvorefter de blev podet med P17 og inkuberet ved 15° C. Dag 25 blev prøverne tilsat acetat.

Den udeblevne vækst i de to flasker kan enten tilskrives tilstedeværelsen af toksiske/hæmmende stoffer i vandfasen eller, at vandfasen har været kontamineret med bakterier, som ikke blev registreret på R₂A pladerne. I et sådant tilfælde har de pågældende bakterier haft 7 døgns forspring og således udkonkurreret P17. Ved tilsætning af acetat har disse bakterier i stærkt overtal kunne omsætte acetaten, før P17 kunne vokse op. Væksten i den tredje af flaskerne hvor "nye" indlæg var i kontakt med vandfasen var i overensstemmelse med væksten i de øvrige flasker. Sammenholdt med de senere udførte undersøgelser i Kapitel 8, er det mest sandsynligt at den udeblivende vækst af P17 i de to flasker skyldes en kontaminering med uønskede bakterier.

Ses der bort fra de to prøver uden vækst, var der på et 5% signifikantsniveau ikke forskel i P17 koncentrationer som følge af de forskellige inkuberinger under inkuberingsforløbet - hellere ikke hvis der opdeles imellem "nye" indlæg, "gamle" indlæg og Erlenmeyerkolber eller kontakt , ingen kontakt og Erlenmeyerkolber (heller ikke når der ses bort fra Erlenmeyerkolbe nr. 3 dag 25). Det kan således ikke siges, at der er effekt af valg af flasketype eller antallet af rensninger "red cap"-lågenes indlæg har undergået.

International ringest af AOC-bestemmelse

AOC-metoden som beskrevet i afsnit 0 blev anvendt af ÌMT ved en ringtest, der omfattede fem europæiske laboratorier. Indenfor ringtesten blev der anlyseret 30 AOC-prøver med tre forskellige koncentrationer. Fire laboratorier opnåede overensstemmende resultater - heriblandt KIWA og IMT /Jørgensen et al., 2000/. Den anførte udførelse til bestemmelse af AOC kan således betragtes som velegnet.

Bilag D
Akkumulerede kurver for sekventielle ekstraktioner

I Kapitel 6 blev sort PEM materiale blev ekstraheret sekventielt over 60 (75) døgn. Materialet blev ekstraheret i perioder á 15 døgn ved 10° C med og uden omrystning ved S/V-forhold på 0,5 og 1,0 cm^-1. Efter hver ekstraktionsperiode blev teststykkerne overført til friskt testvand. De opnåede ekstrakter blev podet med P17, og inkuberet ved 15° C.

For hver serie ekstrakter (ekstrakter fremstillet på samme teststykke) er de maksimale kimtal akkumuleret over tid. I Figur 0-1 er de akkumulerede kurver afbildet, idet kimtalsværdien er angivet ud for den dag, hvor ekstraktionen blev afsluttet. For P17 er den akkumulerede AOC-værdi angivet ud for de enkelte kurver.

Figur D-1:
Akkumulerede kurver for sekventielle ekstraktioner. Materialet blev ekstraheret i perioder af 15 døgn ved 10° C. Efterfølgende vækst af P17 forgik ved 15° C. Akkumulerede AOC_P17-værdier er angivet for hver enkel serie ekstraktioner.

Bilag E
Data fra materialeundersøgelse

I kapitel 8 blev afgivelsen fra fem forskellige polymere materialer undersøgt. Materialerne blev ekstraheret over 15 døgn ved 20° C under omrystning ved et S/V-forhold på 0,5 cm^-1. Efterfølgende blev ekstrakterne podet med P17 og inkuberet ved 15° C. Undersøgelsen blev udført i tre serier, hvor serie 1 og 2 efter væksten af P17 blev tilsat acetat, og inkuberet endnu 5 døgn ved 15° C (jævnfør Kapitel 8 for nærmere testforhold).

E.1. Vækst af P17

I Figur E-1 er vækstkurver for P17 afbilledet og i Tabel 0-1 er AOC_P17-værdier angivet sammen med tilvæksten i AOC_P17 som følge af acetattilsætningen.

Tabel E-1:
Maksimale AOC_P17-værdier i ekstrakter af polymert materiale (Blindværdi ikke fratrukket). Ekstraktionerne blev udført ved 20° C over 15 døgn under omrystning ved et S/V-forhold på 0,5 cm^-1, mens væksten af P17 foregik ved 15° C.