Miljøprojekt, 910 – Substitution af biocider i bundmaling til skibe med enzymer – Bilag C Måling af enzymaktivitet i udvaskningsbuffer

Substitution af biocider i bundmaling til skibe med enzymer

Bilag C

Måling af enzymaktivitet i udvaskningsbuffer

Der er udført målinger på udvasket enzym i udvaskningsbuffer for fire malingssystemer. Udvaskningsbufferen er skiftet daglig og der er målt enzymaktivitet på prøverne. Tabel 1 viser variationen mellem de fremstillede malingsfilm. Dette gælder også tilsat mængde protease/Alcalase opløsning i malingsfilmen. Tørstoffet/enzymindholdet for denne opløsning er ikke kendt. Den tilsatte enzymopløsnings enzymaktivitet er beregnet og angivet i mAu. Malingsfilmene har henstået 11 dage hvorefter udvaskningen i buffer er påbegyndt. Forsøget blev stoppet efter 3 døgn, da de målte absorbanser (E) var meget små.

Tabel C1 Påførte mængder maling på pipetter og målt absorbans (enzymaktivitet).
Prøve	Mængde maling (g)	Alcalase opløsning (mg)	mAU tilsat malingsfilmen	E 1. døgn	E 2. døgn	E 3. døgn
118	0,2034	6,22	15,56	0,67	0,51
118	0,2917	8,93	22,32	0,69	0,46	0,14
118	0,2396	7,33	18,33	0,73	0,47	0,18
119	0,1666	4,91	12,29	0,65	0,37	0,20
119	0,1697	5,01	12,52	0,72	0,37	0,24
120	0,1771	5,42	13,55	0,73	0,62	0,16
120	0,1382	4,23	10,57	0,63	0,48	0,20
120	0,1302	3,98	9,96	0,66	0,48	0,17
F-5	0,5631	15,88	39,70	0,52	0,64	0,23
F-5	0,4824	13,60	34,01	0,53	0,61	0,17

Ved hjælp af referencekurven beregnes enzymaktiviteten i udvaskningsbufferen på baggrund af absorbansen. Herefter er mængden af udvasket enzym (Alcalase) i mg opløsning og reduktionen af Alcalase i malingsfilmen beregnet. Ligeledes kan resultatet udtrykkes i enzymaktivitet (mAu) der stadig er tilbage i malingsfilmen. De beregnede resultater findes i tabel C2 og tabel C3.

Tabel C2 Beregnede resultater for enzymaktivitet og udvasket mængde enzym.
Prøver	Enzymaktivitet (mAU/ml)			Udvasket mængde Alcalase opløsning (mg)
Nr.	Døgn 1	Døgn 2	Døgn 3	Døgn 1	Døgn 2	Døgn 3
118	0,57	0,40		0,91	0,63
118	0,59	0,34		0,95	0,54
118	0,64	0,35	0,03	1,03	0,56	0,05
Gns	0,60	0,36	0,03	0,97	0,58	0,02
119	0,55	0,24	0,05	0,89	0,39	0,08
119	0,62	0,24	0,10	0,94	0,39	0,12
Gns	0,59	0,24	0,07	1,02	0,83	0,01
120	0,64	0,52	0,01	0,85	0,58	0,08
120	0,53	0,36	0,05	0,89	0,58	0,03
120	0,56	0,36	0,02	0,92	0,66	0,04
Gns	0,57	0,41	0,03	0,65	0,86	0,14
F-5	0,41	0,54	0,09	0,94	0,39	0,12
F-5	0,42	0,51	0,02	0,67	0,81	0,03
Gns	0,41	0,52	0,05	0,66	0,84	0,08

Tabel C3 Beregnede resultater for reduktion af enzymaktivitet og mængde enzym i malingsfilmen.
Prøver	Reduktion i Enzymaktivitet (mAU)				Mængde ”Alcalase opløsning” tilsat og forbrugt fra malingsfilm (vægt-%)
Nr.	Døgn 0	Døgn 1	Døgn 2	Døgn 3	Døgn 0	Døgn 1	Døgn 2	Døgn 3
118	15,56	13,27	11,69		3,06	2,61	2,30
118	22,32	19,94	18,57		3,06	2,73	2,55
118	18,33	15,75	14,34	14,23	3,06	2,63	2,39	2,37
Gns	18,7	16,3	14,9	14,23	3,06	2,66	2,41	2,37
119	12,29	10,07	9,11	8,90	2,95	2,42	2,19	2,14
119	12,52	10,02	9,05	8,67	2,95	2,36	2,13	2,04
Gns	12,4	10,0	9,1	8,78	2,95	2,39	2,16	2,09
120	13,55	11,00	8,93	8,90	3,06	2,48	2,02	2,01
120	10,57	8,46	7,01	6,80	3,06	2,45	2,03	1,97
120	9,96	7,73	6,28	6,20	3,06	2,37	1,93	1,91
Gns	11,4	9,1	7,4	6,20	3,06	2,44	1,99	1,96
F-5	39,70	38,06	35,90	35,56	2,82	2,70	2,55	2,53
F-5	34,01	32,35	30,32	30,24	2,82	2,68	2,51	2,51
Gns	36,9	35,2	33,1	30,24	2,82	2,69	2,53	2,52

Ved udførelsen af analysen var der er en del variation mellem den mængde maling der påføres den enkelte pipette om end det i alle tilfælde foregår ved neddypning. Oprindeligt var der et ønske om at udføre "trippel-analyser". En enkelt prøve har ved påføringen ikke kunnet godkendes og endvidere er enzymanalysen mislykket i et par tilfælde. Dette har betydet at der kun er lavet dobbeltbestemmelse for to af malingerne. Når absorbansen bliver for lav kan enzymaktiviteten ikke beregnes, da resultatet ligger udenfor referencekurven. Dette viser sig blandt andet ved negative tal. Dette er markeret med grå felter i tabellerne. Der afgives mest enzym de første to dage. Usikkerheden ved målingen efter tredje døgn bliver stor, da udvaskningen på dette tidspunkt er meget lav.

Figur C1 viser at lagtykkelsen for den opløsningsmiddelbaserede maling F-5 er væsentlig højere end for de vandfortyndbare (118-120). Det vil sige større lagtykkelse betyder større mængde tilsat enzym og dermed enzymaktivitet.

Figur C1 Enzymaktivitet i malingsfilm

Figur C1 Enzymaktivitet i malingsfilm

Resultaterne viser endvidere at den opløsningsmiddelbaserede maling (F5) procentuelt afgiver mindre mængde Alcalase det første døgn end de vandfortyndbare produkter (118-120). Se figur C2. Endvidere kan det konkluderes at udludningen af enzym ser ud til at stagnere på en lav afgivelse efter de første par døgn..

Figur C2 Mængde "Alcalase-opløsning" tilsat i malingsfilm og reduktion

Figur C2 Mængde 'Alcalase-opløsning' tilsat i malingsfilm og reduktion

1.1 Måling af protein i udvaskningsbuffer

Der er udført målinger af udvasket enzym i udvaskningsbuffer for fire malinger ved hjælp af proteinmåling. Malingerne er tilsat 5 % enzymopløsning (protease, glucoamylase og xylanase). Udvaskningsbufferen er skiftet daglig og der er målt proteinindhold i prøverne. Det bør bemærkes at tørstoffet i enzymopløsningerne ikke er kendt. Tabel C4 viser variationen mellem de fremstillede malingsfilm og variationen i den samlede mængde enzymopløsning/protein. Prøverne var 11 dage inden udvaskningen i buffer blev påbegyndt. Forsøget blev afbrudt efter 3 døgn, da de målte absorbanser (E) var små.

Tabel C4. Påførte mængder maling på pipetter og målt absorbans (protein).
Prøve.	Mængde maling (g)	Enzym-opløsning. (mg)	Mængde protein (mg)	E 1. døgn	E 2. døgn	E 3. døgn
118	0,2034	15,58	1,25	0,64	0,13
118	0,2917	22,34	1,80	0,73	0,14	0,03
118	0,2396	18,35	1,47	0,69	0,14	0,04
119	0,1666	12,26	0,99	0,55	0,08	0,02
119	0,1697	12,49	1,00	0,56	0,07	0,02
120	0,1771	13,57	1,09	0,67	0,14	0,04
120	0,1382	10,59	0,85	0,53	0,07	0,02
120	0,1302	9,97	0,80	0,47	0,08	0,01
F-5	0,5631	39,64	3,18	0,21	0,08	0,07
F-5	0,4887	34,40	2,76	0,12	0,12	0,01
F-5	0,4824	33,96	2,73	0,16	0,08	0,08

Ved hjælp af referencekurven beregnes proteinindholdet i bufferen på baggrund af absorbansen. Herefter beregnes mængde udvasket enzym/protein i alt i mg. De beregnede resultater findes i tabel C5.

Tabel C5 Beregnede resultater for udvasket mængde protein og proteinindhold i malingsfilmen.
Prøver	Udvasket mængde protein (mg)			Mængde protein i malingsfilm (vægt-%)
Prøver.	Døgn1	Døgn 2	Døgn 3	Døgn 0	Døgn1	Døgn 2	Døgn 3
118	0,82	0,99		0,62	0,21	0,13
118	0,94	1,12	1,16	0,62	0,29	0,23	0,22
118	0,89	1,07	1,12	0,62	0,24	0,17	0,15
Gns	0,88	1,06	1,14	0,62	0,25	0,18	0,18
119	0,71	0,81	0,84	0,59	0,17	0,10	0,09
119	0,72	0,81	0,84	0,59	0,17	0,11	0,10
Gns	0,71	0,81	0,84	0,59	0,17	0,11	0,09
120	0,86	1,04	1,09	0,62	0,13	0,03	0,00
120	0,68	0,77	0,80	0,62	0,12	0,06	0,04
120	0,61	0,71	0,72	0,62	0,15	0,07	0,06
Gns	0,72	0,84	0,87	0,62	0,13	0,05	0,03
F-5	0,27	0,37	0,46	0,57	0,52	0,50	0,48
F-5	0,15	0,31	0,32	0,57	0,53	0,50	0,50
F-5	0,21	0,31	0,41	0,57	0,52	0,50	0,48
Gns	0,21	0,33	0,40	0,57	0,52	0,50	0,49

Ved udførelsen af analysen har der været de samme problemer som ved måling af enzymaktivitet. Proteinindholdet kan beregnes selvom absorbansen er lav da referencekurven går igennem 0. En enkelt måling er fejlagtig, denne er markeret med gråt felt i tabellerne. Der afgives mest protein/enzym de første to dage. Usikkerheden ved målingen er også her meget stor efter tredje døgn, da udvaskningen på dette tidspunkt bliver lavere.

Resultatet viser at den opløsningsmiddelbaserede maling afgiver væsentlig mindre mængde enzym/protein end de vandfortyndbare produkter; se figur C3. Endvidere kan det konkluderes at udludningen af enzym ser ud til at stagnere på en lav afgivelse efter de første par døgn.

Når resultatet udtrykkes i vægt-% af malingsfilm (figur C4) ses at proteinindholdet i de vandfortyndbare reduceres kraftigt. Den opløsningsmiddelbaserede afgiver en væsentlig mindre mængde protein.

Figur C3 M�ngde protein udvasket fra malingsfilm

Figur C3 M�ngde protein udvasket fra malingsfilm

Figur C4 Mængde protein i malingsfilm

Figur C4 Mængde protein i malingsfilm

1.2 Evaluering af indledende forsøg

Resultaterne fra udvaskningsforsøgene viser en tydelig udludning ved måling af protein og nedgang i enzymaktivitet. Ved måling af protein fås summen af de tre udludede enzymer. Ved måling af enzymaktivitet fås kun udludning af Alcalase. Det kan også konstateres at udvaskningen af protein er væsentlig større end udvaskningen af Alcalase for de vandfortyndbare produkter. Dette kan tyde på at enzymerne udvaskes med forskellig hastighed. Dog kan det også skyldes måleusikkerheder. For at sikre resultaternes validitet er der udført en kontrolmåling på den opløsningsmiddelbaserede maling, men i fire forskellige formuleringer. Endvidere var der behov for at måle udludning over et længere tidsrum for at se om udludningshastigheden bliver konstant. Dette betyder at eksponeringstiden i buffer må ændres efterhånden som udludningshastigheden bliver lavere.