Bekæmpelsesmiddelforskning fra Miljøstyrelsen, 88 – Hormonforstyrrende effekter af kombinationer af pesticider

Hormonforstyrrende effekter af kombinationer af pesticider

Sammenfatning og konklusioner

Befolkningen er som oftest eksponeret for blandinger af kemikalier, hvoraf flere er mistænkt for at have hormonforstyrrende egenskaber. Mange af disse kemikalier har i sig selv en svag virkning i forhold til effekten af vores kønshormoner og det er vanskeligt at forklare mulige sundhedsrisici alene på basis af effekten af enkeltstofferne. Men det er sandsynligt, at disse hormonforstyrrende kemikalier spiller sammen på en måde, der forøger deres hormonale effekter og det er derfor vigtigt at få belyst de mekanismer for interaktioner, der måtte være mellem stofferne. Derfor er dette studie, der specielt sigter på at belyse kombinationseffekter af hormonforstyrrende pesticider, igangsat.

Det overordnede formål er også at bidrage med et input til diskussionen om principper for risikovurdering af kemikalier, hvor der traditionelt ikke tages højde for, at vi er eksponeret for blandinger af kemikalier.

Hovedparten af det arbejde, der er lavet omkring kombinationseffekter af hormonforstyrrende stoffer er baseret på in vitro undersøgelser af meget varierende kvalitet og meget få in vivo undersøgelser på blandinger af hormonforstyrrende stoffer er blevet udført hidtil. Undersøgelser af kombinationseffekter af antiandrogene kemikalier har ikke tidligere været udført. Det er vist, at kombinationseffekten kan variere i det samme eksperimentelle system afhængig af det valgte endpoint. Stoffer som eksempelvis virker synergistisk på det molekylære niveau (e.g. receptor binding) kan udvise additivitet, når der måles på mere komplekse funktionelle niveauer så som cellevækst. Af denne grund har vi anset det for vigtigt at udføre analyse af kombinationseffekter af hormonforstyrrende stoffer ved forskellige niveauer af molekylær kompleksitet inklusive in vivo studier.

Mekanismen for samspilseffekter mellem pesticider med hhv. østrogen og antiandrogen aktivitet blev undersøgt dels i in vitro studier og dels in vivo i kort-tids dyreforsøg. Som modelstoffer for de østrogene pesticider blev o,p-DDT og methoxychlor valgt, og testsystemerne bestod dels af et brystcancercelle-proliferationsassay og en uterusvægttest i hunrotter, der har fået fjernet æggestokkene. I in vitro forsøgene sås god overensstemmelse mellem de målte effekter og de prædikterede værdier for additiv virkning beregnet ud fra isobolmetoden. I in vivo forsøgene blev undersøgt effekt på uterusvægt, effekt på serumniveauer af follikelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH) og prolaktin, effekt på mRNA niveauer for østrogen receptorα og β (ER) og laktoferin i uterusvæv og på udvalgte neurotransmittere og acetylcholinesteraseaktivitet i hjernevæv. Kort fortalt sås med begge pesticider en stigning i uterusvægt og prolaktinniveau, mens LH-, FSH-niveau og ERα, ERβ og laktoferin mRNA niveauer faldt. Der sås ikke effekt på neurotransmitterniveauer og aktivitet af acetylcholinesterase. På baggrund af de opnåede resultater for organvægte, hormonniveauer og ER mRNA niveau kunne der ikke påvises afvigelse fra additivitet, d.v.s. der er ikke holdepunkter for at antage, at der er nogen synergistiske eller antagonistiske samspilseffekter mellem stofferne. Dette underbygges af, at in vitro forsøgene med de samme stoffer viser additivitet.

Den østrogene aktivitet i serum fra rotteforsøgene blev undersøgt med en nyudviklet biomarkørmetode, hvor de naturligt dannede østrogener fjernes fra prøven og den resterende prøve testes in vitro for østrogen aktivitet. Derved fås et mål for den samlede østrogene aktivitet i serumprøven hidrørende fra xeno-østrogener – i dette tilfælde de anvendte pesticider og deres nedbrydningsprodukter. I de pesticideksponerede dyr sås en tydeligt dosis-relateret stigning i det østrogene respons, som indikerer at denne metode er velegnet til belysning af eksponering af forsøgsdyr for østrogene kemikalier.

Som modelstoffer for pesticider med antiandrogen effekt blev vinclozolin og procymidon valgt og mekanismen for deres interaktion blev undersøgt, dels i et androgenreceptor reportergen assay, dels in vivo i en udbygget Hershberger test, der er udført med kastrerede hanrotter. I in vitro forsøgene blev observeret god overensstemmelse mellem de målte effekter og de prædikterede værdier for additiv virkning beregnet ud fra isobolmetoden. I in vivo forsøgene blev undersøgt effekt på vægt af reproduktionsorganer, effekt på serum FSH og LH niveauer, effekt på genekspression af TRPM-2 og 'prostate binding protein' (PBP) C3 mRNA i prostata og på udvalgte neurotransmitterniveauer og acetylcholinesteraseaktivitet i hjernevæv. Kort fortalt sås med stofferne et fald i vægte af alle reproduktionsorganer, en stigning i LH- og FSH-niveau og hhv. et fald og en stigning i mRNA niveauer af PBP C3 og TRPM-2. Følsomheden af de tre nævnte parametre for antiandrogener var i disse forsøg: reproduktionsorganvægte > serum LH niveau > genekspression i prostata.

Hverken noradrenalin-, dopaminkoncentration, acetyl- eller butylcholinesterase-aktivitet i hjernevævet var påvirkede, hvilket indikerer, at de noradrenerge, dopaminerge, og cholinerge dele af centralnervesystemet ikke påvirkes markant af pesticiderne. Dog gav vinclozolin og procymidon enkeltvis og i kombination en signifikant forøgelse af totalhjernens serotoninkoncentration.

Generelt vurderes at det anvendte eksperimentelle design giver en biologisk variation mellem dyrene på organvægtniveau, der er af en størrelsesorden, som tillader en relativ præcis og detaljeret undersøgelse af samspilseffekterne. De opnåede data giver således et klart billede af samspillet mellem vinclozolin og procymidon. På baggrund af de opnåede resultater for organvægte, hormonniveauer og mRNA niveauer kan der ikke påvises fravær af additivitet, d.v.s. der er ikke holdepunkter for at antage at der er nogle synergistiske eller antagonistiske samspilseffekter mellem stofferne. Dette underbygges af, at in vitro forsøgene med de samme stoffer viser additivitet.

Som eksempler på almindeligt anvendte pesticider i Danmark blev valgt: karbamatinsekticidet methiocarb, der har vist svage østrogene og antiandrogene effekter in vitro, herbicidet tribenuron-methyl og pyrethroid insekticidet deltamethrin, der begge er svage østrogener in vitro, fungicidet prochloraz der har antiøstrogene og antiandrogene effekter in vitro og herbicidet simazin, der er en aromatase-inducer. De fem pesticider blev enkeltvis og i kombination testet for østrogent respons in vitro. Methiocarb og deltamethrin inducerede et østrogent respons målt ved øget MCF-7 celleproliferation, mens tribenuron-methyl, prochloraz og simazin ikke havde nogen effekt. Kombinationen af en 1:1:1:1:1 æquimolær blanding af de 5 pesticider gav ikke noget målbart østrogent respons og beregning af en isobolkoefficient på 7 for blandingen indikerer en antagonistisk effekt mellem stofferne i blandingen, sandsynligvis forårsaget af prochloraz som også reagerer antiøstrogent, når det testes sammen med 17β-estradiol. Desuden blev stofferne enkeltvis og i kombination testet for antiandrogene effekter in vitro og in vivo i Hershberger test. Hverken tribenuron-methyl eller simazin havde nogen antiandrogen effekt in vitro, mens både prochloraz, methiocarb og deltamethrin blokerede androgen receptoren. Kombinationen af en 1:1:1:1:1 æquimolær blanding af de 5 pesticider gav et antiandrogent respons, der lå på linie med det beregnede respons under antagelse af additivitet, så resultaterne indikerer, at stofferne i kombination virker additivt i dette assay. In vivo Hershberger forsøget blev kompliceret af, at det ikke var muligt at undersøge pesticiderne ved samme dosisniveau p.g.a. andre toksiske effekter af nogle af stofferne. Dosis af deltamethrin og methiocarb måtte derfor sænkes til 2,5 mg/kg/dag, mens prochloraz, simazin og tribenuron-methyl blev doseret med hver 25 mg/kg/dag. Kombinationsgruppen fik en dosis svarende til i alt 80 mg/kg (25+25+2.5+25+2.5 mg/kg). Mht. effekt på vægte af reproduktionsorganer sås ingen effekter af enkeltstofferne, hvorimod kombinationsgruppen viste signifikant reduceret vægt af musc. levator ani/bulbocavernosus. Der var også tendens til fald i prostatavægte og sædblærevægte, men der var ingen statistisk signifikans. Generelt sås ingen effekt på de valgte hormonniveauer. Derimod var der markant effekt af alle pesticider doseret enkeltvis og i kombination på ekspressionen af ornithin decarboxylase (ODC) mRNA og PBP C3 mRNA, med undtagelse af deltamethrin og tribenuronmethyl, der ikke gav effekt på PBP C3 mRNA.

Konklusionen er, at de 5 pesticider udviser tydelig additivitet in vitro og at der ses en akkumulerende effekt på reproduktionsorganvægte in vivo. Det var overraskende, at enkeltstofferne inducerede så markante effekter på ekspression af PBP C3 og ODC mRNA. Enten er genekspressionen i disse forsøg en meget følsom parameter for antiandrogen effekt eller også reguleres generne af andre signalveje, der ikke er relaterede til androgen receptoren. Betydningen af disse ændringer er således uklar på nuværende tidspunkt, men kan tyde på en begyndende antiandrogen effekt, som ikke giver sig udslag i funktionelle ændringer.

Undersøgelse af pesticidinducerede effekter i afkommet efter eksponering af mødrene under drægtigheden anses for at være den mest følsomme in vivo test for undersøgelse af hormonforstyrrende effekter. Kombinationen (20 mg/kg/dag: 15 mg/kg prochloraz og 1,25 mg/kg af de 4 andre pesticider) og prochloraz i sig selv (30 mg/kg/dag) havde en reversibel effekt på mødrenes vægt under drægtigheden, men der sås ingen markante føtotoksiske effekter ved de valgte doser. Den oprindeligt valgte dosis af kombinationen (40 mg/kg/dag: 30 mg/kg prochloraz og 2,5 mg/kg af de 4 andre pesticider) viste sig at være for høj, da der var synlige toksiske effekter på mødrene efter nogle få doser, og dosis blev derfor halveret. Denne toksicitet må skyldes enten deltamethrin, methiocarb, simazin eller tribenuron-methyl i blandingen, eller at et eller flere af stofferne gensidigt øger hinandens toksicitet.

Både prochloraz og kombinationen forårsagede et markant reduceret testosteronniveau og et forhøjet progesteronniveau i hanfostre ved gestationsdag 21. Det reducerede testosteronniveau afspejler en antiandrogen effekt i lighed med den, der er observeret for flere phthalater. Effekten var forsvundet post natal dag 16. Men det er givetvis denne effekt, der giver sig udslag i, at begge behandlinger giver et øget antal brystvorter og dermed en feminisering af hannerne. Det øgede progesteronniveau i hanfostre hænger sandsynligvis sammen med den øgede længde af drægtigheden, som var signifikant forøget efter prochloraz behandling.

Det er sandsynligt at det er prochloraz i kombinationen (15 mg/kg), der forårsagede de antiandrogene effekter på testosteronniveau og brystvorteantal, da stoffet indgivet alene i en dosis på 30 mg/kg gav de samme effekter

Kombinationen gav ingen effekter på hverken adfærd eller sædkvalitet hos hannerne, hvorimod prochloraz i sig selv resulterede i en ændret adfærd hos hannerne i undersøgelser for aktivitetsniveau og sødestofpræference, og de fundne adfærdsændringer tyder på en feminisering af hannerne.

Den overordnede konklusion på dette projekt er, at det ser ud som om at hormonforstyrrende stoffer, der virker via samme virkningsmekanisme, har additive effekter. Det er den klare konklusion på basis af in vitro forsøgene, og understøttes af de observationer, der er gjort i dyreforsøgene.

Undersøgelsen af deltamethrin, methiocarb, prochloraz, simazin og tribenuron-methyl for antiandrogene effekter viste, at der er klare antiandrogene effekter både in vitro og in vivo af prochloraz, hvorimod der ikke kunne påvises funktionelle hormonforstyrrende effekter i dyreforsøgene af de 4 andre pesticider, der dog også blev testet ved lavere doser. Til gengæld sås der på genekspressionsniveau en række ændringer efter dosering med selv små doser af de 4 pesticider, men betydningen af disse ændringer er uklar.

Dette projekt illustrerer den store force in vitro forsøg har til vurdering af kombinationseffekter pga. den store kapacitet af assayene, der gør, at der kan laves detaljerede dosis-respons kurver for mange blandingsratioer af stofferne. Projektet illustrerer også, at undersøgelse af kombinationseffekter i dyreforsøg kan lade sig gøre, men er ressourcekrævende og kan være en vanskelig opgave p.g.a. stoffernes ofte meget forskellige toksicitet, som gør, at man langt fra altid kan dosere dyrene med de blandingsforhold af stofferne, der fra et teoretisk synspunkt er optimale.