Miljøprojekt, 981 – Eksponering for ultrafine partikler fra trafikken i København – 1 Isolering af lymfocytter og analyse af DNA-skader (2.2.4)

Eksponering for ultrafine partikler fra trafikken i København

1 Isolering af lymfocytter og analyse af DNA-skader (2.2.4)

Lymfocytter blev isoleret ved gradient centrifugering i Vacutainer CPT rør, og vasket en gang i RPMI ved 4C, og centrifugeret. Celle pellet blev resuspenderet i frysemedium (10% dimethylsulfoxid, 40% RPMI, 50% føtal bovin serum) og opbevaret ved -80°C indtil analyse. Cellerne blev på analysedagen optøet og indstøbt i 0,75 % agarose og lyseret i en salt/detergent opløsning (2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris og 1% Triton X-100, pH = 10.0) natten over. De agarose-indstøbte cellekerner blev herefter vasket tre gange i 5 minutter i en enzym buffer (40 mM HEPES, 0.1 M KCl, 0.5 EDTA, og 0.2 mg/ml bovin serum albumin, pH=8.0), inden formamidepyrimidin DNA glycosylase (FPG) enzym behandlingen i 45 minutter ved 37°C. Herefter blev kernerne alkalisk behandlet i 40 minutter (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH>13), og udsat for elektroforese (300 mA og 25 V) i 20 minutter, inden de blev vasket i 0.4 mM Tris. Cellekernerne blev farvet med TOTO1 fluorescens farvestof og undersøgt i fluorescensmikroskop. Graden af DNA- skade blev vurderet ved en arbitrær score inddelt i fem klasser (0-4) efter stigende skade i 100 cellekerner per prøve (skadesniveau 0-400 per prøve). For samme prøve undersøgtes for både niveau af streng brud (prøve uden enzym) og for FPG skader (differencen mellem skade i prøver behandlet med og uden enzym).