| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Kombinationseffekter af pesticider

4 Materialer og metoder

• 4.1 Terrestriske planter
  • 4.1.1 Dyrkningsteknik
  • 4.1.2 Akvatiske planter
  • 4.1.3 Alger
  • 4.1.4 Akvatiske bakterier
  • 4.1.5 Dafnier
  • 4.1.6 MCF7 celleproliferationsassay
  • 4.1.7 AR reportergenassay

I dette kapitel beskrives den anvendte forsøgsteknik for hvert af de 7 testsystemer herunder hvilke to- og trekomponent pesticidblandinger, der er undersøgt.

4.1 Terrestriske planter

Modsat akvatiske planter, alger, bakterier og akvatiske dyr er der ikke i samme udstrækning tradition for at anvende standardiserede metoder i studier med terrestriske planter. Der er udviklet standardiserede metoder såsom OECD Guideline 208, som p.t. er under revision, samt ISO 11269. Disse testmetoder er udviklet til studier, hvor formålet er at bestemme eventuelle effekter på spiring, rodvækst og tidlig vækst af kemiske stoffer herunder pesticider inkorporeret i jordmatricen. I studier, hvor man ønsker at undersøge effekter på terrestriske planter ved eksponering af de overjordiske plantedele, kan man ikke henholde sig til officielle guidelines. I dette projekt er der derfor anvendt en dyrkningsteknik, som er udviklet ved DJF i Flakkebjerg og har været anvendt der i en årrække.

4.1.1 Dyrkningsteknik

Frø af lugtløs kamille (Tripleurospermum inodorum) og alm. fuglegræs (Stellaria media) blev sået i 2 liter potter i et dyrkningsmedium bestående af jord, sand og sphagnum (2:1:1 w/w) tilsat alle nødvendige næringsstoffer. Planterne voksede enten udendørs eller i væksthus afhængig af tidspunktet på året. I væksthuset blev der suppleret med kunstigt lys, såfremt dette var nødvendigt. Planternes udviklingstrin på behandlingstidspunktet varierede fra 4 til 8 blade. Forsøgene blev afsluttet 4-5 uger efter behandling, hvor der blev målt frisk- og tørvægt af de overjordiske plantedele.

4.1.1.1 Eksponering

I forsøgene med tokomponent blandinger blev planter af lugtløs kamille og fuglegræs behandlet med 6 eller 7 doseringer af henholdsvis 2 pesticider og 3 tokomponent blandinger af de 2 pesticider. Hver behandling havde 3 replikater med undtagelse af kontrollen, hvor der var 6 replikater. Forholdet mellem pesticiderne i tokomponent blandingerne blev fastlagt med udgangspunkt i de forventede ED₅₀ doseringer af de 2 pesticider, således at de to pesticider, under antagelse af ADM, ville bidrage med henholdsvis 25 og 75, 50 og 50 samt 75 og 25% af den samlede effekt af blandingerne. I tabel 4 er vist en oversigt over de blandinger, som er undersøgt, med angivelse af, om der er tale om blandinger af pesticider med samme virkningsmekanisme, samme virkemåde men forskellige virkningsmekanismer eller forskellige virkemåder. Forsøgene er gentaget, såfremt valg af doseringer eller blandingsforhold ikke var ensartet fordelt langs henholdsvis doseringskurven og isobolen.

Tabel 4. Tokomponent blandinger undersøgt på terrestriske planter.

Trekomponent blandingerne er kun undersøgt på lugtløs kamille. I disse forsøg blev planterne behandlet med 7 doseringer af henholdsvis 3 pesticider, 9 tokomponent blandinger (3 blandinger med hver af de 3 mulige tokomponent blandinger) samt 4 trekomponentblandinger. Forsøgene med trekomponent blandinger tjener således også som en ekstra gentagelse af forsøgene med tokomponent blandinger. I alt 4 trekomponent blandinger blev undersøgt og sammensætningen af disse var baseret på resultaterne fra forsøgene med tokomponent blandinger. Forholdet mellem pesticiderne i tokomponent blandinger blev fastlagt, som beskrevet ovenfor, mens forholdet i de 4 trekomponent blandingerne blev fastlagt ud fra et forventet effektbidrag (under antagelse af ADM) af de enkelte pesticider på henholdsvis 33, 33 og 33%, 60, 20 og 20%, 20, 60 og 20% samt 20, 20 og 60%. I tabel 5 er vist en oversigt over de undersøgte trekomponent blandinger

Tabel 5. Trekomponent blandinger undersøgt på terrestriske planter

I de fleste forsøg var forskellen imellem doseringerne en faktor 2, men i enkelte forsøg varierede doseringsfaktoren fra 2 mellem de lave doseringer til 3 mellem de højeste doseringer. Dette asymmetriske forsøgsdesign blev valgt for sikre en god beskrivelse af den øvre del af doseringskurven. Behandlingerne blev udført i en pottesprøjte udstyret med en bom med 2 almindelige hydrauliske dyser (Hardi ISO F^-110-015). Pesticiderne blev udbragt i en væskemængde på ca. 150 l vand/ha.

4.1.1.2 Dataanalyse

Doseringskurverne for de forskellige pesticider og pesticidblandinger blev beskrevet med en log-logistisk dosis respons model (Kudsk & Mathiassen, 2004), og isobolerne blev beregnet, som beskrevet i kapitel 2, ved brug af to-trins modellen (Sørensen et al., 2005a). For enkelte blandingers vedkommende var der tale om så kraftig en antagonisme, at de ikke kunne beskrives med Hewlett og Plackets isobolmodel (Hewlett, 1969), og derfor var det ikke muligt at estimere en isobol.

4.1.2 Akvatiske planter

Flydebladsplanter af slægten Lemna er de hyppigst anvendte vandplanter til test af væksthæmmende effekter af miljøfremmede stoffer, og de eneste for hvilke der er udviklet standardiserede testmetoder i bl.a. OECD og USEPA. De små, geografisk vidt udbredte planter, udmærker sig ved deres størrelse, der gør det let og pladsmæssigt overskueligt at dyrke dem under standardiserede laboratoriebetingelser. De har desuden en hurtig vækst, så væksthæmmende effekter hurtigt kan detekteres, og de er i kontakt med både vandfase, luftfasen samt overfladen, hvor mange stoffer har en tendens til at akkumulere. Lemna har derfor ofte vist sig at være en følsom plante overfor et bredt spekter af stoffer. Desuden formerer den sig vegetativt, så man kan arbejde med kloner og derfor kan se bort fra genetisk variation indenfor det enkelte forsøg. De to mest anvendte arter er Lemna minor og Lemna gibba, hvoraf vi anvendte den første i vores forsøg.

4.1.2.1 Dyrkningsteknik

Lemna minor blev i 1999 indsamlet fra en lokal dam og planterne steriliseret j.f.( Landolt & Kandeler, 1987). En udvalgt klon opbevares i autoklaverede kolber i klimaskabe ved 24C og en lysintensitet på 45 – 70 µmol m-2 s^-1 (PAR) døgnet rundt. Klonens følsomhed overfor standard test-stoffer som Cr og 3,5-dichlorophenol (CAS-Nr.: 591-35-5) var tilsvarende andre standard kloner (ISO-ringtests). Vækstmediet er beskrevet af (Maeng & Khudairi, 1973) og havde en start pH på 5.

4.1.2.2 Eksponering

Forsøgene er udført i 6-brønds TC Test Plates (CM Lab Aps), hvor der blev tilsat 10 ml vækstmedie med eller uden pesticid og én Lemna plante. Planterne blev fotograferet sammen med et standard areal og derefter placeret i klimaskab under de beskrevne vækstforhold. Efter 4 dage blev planterne fotograferet igen, og start- og slutareal blev bestemt ved digital billedbehandling. Den arealspecifikke vækstrate udregnedes som: (ln(A1)-ln(A0))t^-1, hvor A0 er bladarealet ved forsøgets start, A1 er bladarealet ved forsøgets afslutning og t er forsøgsperioden opgivet i dage.

Hver doseringskurve består af 12 ubehandlede replikater samt 8 pesticidkoncentrationer med hver tre replikater. Hver binær blanding bestod af 5 blandingsforhold: 83:17, 67:33, 50:50, 33:67 og 17:83 samt de to pesticider alene, dvs. i alt 7 doseringskurver. I forsøgene med Lemna minor indgår de samme tokomponent blandinger, som i forsøgene på terrestriske planter (Table 4).

Forsøgene med trekomponent blandinger blev udført på tilsvarende måde men med 6 pesticidkoncentrationer for hver pesticid og pesticidblanding. I hvert forsøg indgik foruden de 3 pesticider, 9 tokomponent blandinger (3 med hver tokomponent blanding) samt 4 trekomponent blandinger. I tabel 6 er vist, hvilke trekomponent blandinger, der blev undersøgt. Sammensætningen af både to- og trekomponentblandingerne blev fastlagt som beskrevet for terrestriske planter i afsnit 3.2.1.2. Samtlige forsøg blev udført to gange.

Tabel 6. Trekomponent blandinger undersøgt på Lemna minor

4.1.2.3 Dataanalyse

Vækstraten blev afbilledet som funktion af pesticidkoncentrationen, og der blev fittet en log-logistisk dosis respons model (Cedergreen & Streibig 2003) for hver doseringskurve. Isobolerne beregnedes som beskrevet i kapitel 2 ved brug af et-trins modellen (Sørensen et al. 2005a)på nær en enkelt isobol, der kun kunne analyseres ved hjælp af to-trins modellen (Sørensen et al., 2005b) da der var stor variation imellem de enkelte forsøg. EC₁₀-isobolerne er alle beskrevet med to-trins modellen, på nær de kurver, der udviste for kraftig antagonisme til at de kan beskrives med Hewlett og Plackets isobolmodel ( Hewlett, 1969). Da Vølunds isobol model ikke er inkorporeret i to-trins modellen, blev disse isoboler derfor ikke indtegnede.

4.1.3 Alger

Undersøgelser af miljøfremmede stoffers effekt på alger bliver enten målt på naturlige algesamfund, hvor bl.a. ændringer i artssammensætning og populationsdynamik kan undersøges, eller på enkelte arter i renkultur, hvilket giver en større grad af reproducerbarhed og mulighed for at undersøge de fysiologiske mekanismer bag en given respons. En af de algearter, der ofte bruges, er grønalgen Pseudokirchneriella subcapitata, bedre kendt som Selenastrum capricornutum. Denne ferskvandsalge er geografisk meget udbredt og en god repræsentant for den store gruppe af grønalger. Desuden er den nem at holde suspenderet i kulturmediet modsat alger, der udskiller stoffer, der får dem til at klistre til overflader og hinanden.

En fri suspension sikrer en maksimal tilgængeligheden af lys, næring og kulstof, hvilket er en forudsætning for eksponentiel vækst, som er den fase, hvor algerne er mest følsomme overfor eksterne påvirkninger. Algernes vækst beregnes på baggrund af klorofylfluorescens, og det forudsættes dermed, at klorofylfluorescensen er proportional med biomassen. Dette er ikke helt korrekt, da klorofylfluorescens er et udtryk for algernes evne til at absorbere lys, der igen kan anvendes til at fiksere kulstof og dermed ny biomasse. Under standardiserede vækstforhold kan lysfikseringspotentialet dog forventes at være proportionalt med vækstpotentialet og dermed også biomassen.

4.1.3.1 Dyrkningsteknik

Algetesten er beskrevet af Arensberg et al. (1995) og (Mayer et al. (1997) og er i overensstemmelse med ISO’s standardtest for alger (International Organization for Standardization, 1989). Klonen stammer fra Institut for Vannforskning (NIVA) in Norge, hvor den er kaldt NIVA-CHL 1. Forsøgene startes ved, at man tilsætter alger fra en stamkultur til 4 ml ISO Standard 8692 vækstmedie (pH 8) i en 20 ml vial tilsat pesticider.

Til måling af pigmentindholdet ved forsøgets begyndelse bliver der udtaget 400 l af algesuspensionen til et reagensglas med skruelåg, hvortil der bliver tilsat 1,6 ml acetone mættet med MgSO4 (12 g l^-1). Prøverne stilles mørkt. Vialene med alger og vækstmedium placeres på et rystebord belyst nedefra med en intensitet på ca. 80 mol m-2 s^-1 (PAR). Rystebordet indstilles til 300 omdrejninger min^-1, hvilket sikrer god omrøring af algerne. Der udtages prøver på dag 1 og dag 2, på samme måde som ved forsøgets start, hvorefter forsøget afsluttes og slut pH måles. pH må ikke varierede mere end 1 pH enhed. På dag 3 kan algernes pigmentfluorescens (primært klorofyl a) måles på et fluorometer med en exitations-bølgelængde på 420 nm og en emmisionsbølgelængde på 670 nm.

4.1.3.2 Eksponering

Hver doseringskurve består af 10 replikater uden tilsat pesticider samt 8 pesticidkoncentrationer med hver to replikater. Hver binær blanding består af 5 blandingsforhold (83:17, 67:33, 50:50, 33:67 og 17:83) samt de to pesticider alene. Af tabel 7 fremgår, hvilke tokomponent blandinger, der blev undersøgt på alger.

Tabel 7. Tokomponent blandinger undersøgt på alger

Stamopløsningerne blev pH-justeret med HCl eller NaOH, hvis nødvendigt. Algerne blev tilsat i en koncentration på ca. 10 000 alger ml^-1. Koncentrationen på stamkulturen blev bestemt spektrofotometriskt.

4.1.3.3 Dataanalyse

Algernes vækstrate udregnedes ved at udføre en liniær regression på den naturlige logaritme til fluorescensen på dag 0, 1 og 2 og angivet i enheden dag^-1. Vækstraterne i de ubehandlede forsøgsled lå mellem 1,6 og 2,0 dag^-1. Doseringskurvernes forløb blev beskrevet med en log-logistisk doseringsmodel (Cedergreen & Streibig 2003), og isobolerne blev beregnet, som beskrevet i kap. 2, ved brug af et-trins modellen (Sørensen et al.). EC₁₀-isobolerne er alle beskrevet med to-trins modellen (Sørensen et al., 2005b) på nær de kurver, der udviste for kraftig antagonisme til at de kunne beskrives med Hewlett og Plackets isobolmodel (Hewlett, 1969).

4.1.4 Akvatiske bakterier

Microtox™ testen er en gennemprøvet og standardiseret metode som anvendes til screening af toksicitet i naturlige (blandings-) prøver (f.eks. ASTM Standard D-5660; ISO Draft 11348-3). I testen kvantificeres luminescensen hos bakterien Vibrio fisheri. Hos denne art udsendes lys som et biprodukt af metabolismen og enhver påvirkning af den cellulære aktivitet vil registreres som en ændring (reduktion) i luminescensen.

Sammenlignet med standardiserede in vivo test er Microtox testens følsomhed generelt lavere overfor toksiske stoffer, hvorimod dens præcision ofte er højere end i in vivo test. Endvidere er der publiceret ED₅₀ værdier for mere end 1200 enkeltstoffer

4.1.4.1 Dyrkningsteknik og eksponering

Inden forsøgene gennemførtes en opformering af en Vibrio fisheri kultur. Denne blev frysetørret og kan uden ændringer i viabilitet og følsomhed anvendes gennem flere måneder. Man er hermed sikret mod genetisk betingede ændringer i bakteriernes følsomhed. Gennem projektet blev der opformeret og anvendt 3 kulturbatch.

Microtox testen gennemførtes som korttidstest (5-30 min) i kulturbrønde og aflæsningen sker automatisk med selvregistrerende apparatur (Microtox Model 500 analyzer).

Inden en forsøgsrunde overførtes frysetørrede bakterier til Microtoxmedium, pH indstilles til 7.0 0.2, og suspensionen overførtes til kulturbrønde. Luminescensen blev målt efter 15 min (= kontrolværdi), der tilsattes pesticid (som enkeltstof, i to- eller trekomponent blandinger i 8 koncentrationer, hver koncentration i 2 replikater samt 4 kontroller), og luminescensen blev målt igen efter 5, 15 og 30 min. Effekten af pesticideksponering blev udtrykt som procent af kontrolmålingen (middel af 4 replikater) i den enkelte kulturbrønd. I 2002 blev det vist i forsøg med enkeltstoffer og i binære blandinger, at måling ved 30 min ikke adskilte sig fra målingen efter 15 min. Derimod skete der en øgning i variationen mellem replikater. På den baggrund blev måling af luminescens efter 30 min opgivet.

Hver binær blanding bestod af 3 blandingsforhold: 75:25, 50:50 og 75:25 samt de to pesticider alene. I tabel 8 er vist en oversigt over antal gennemførte Microtox test med pesticider i binære blandinger.

Tabel 8. Tokomponent blandinger undersøgt med Microtox test. Tallet i parantes angiver antal forsøg med blandingen. De to test med acifluorfen i blanding med chlorfenvinphos/dimethoat er gennemført henholdsvis med det rene stof og det formulerede produkt.

Forsøgene med trekomponent blandinger blev udført på tilsvarende måde som ved tokomponent blandinger. I hvert forsøg indgik foruden de 3 pesticider i blandingsforholdene 60:20:20, 20:60:20, 20:20:60 og 33:33:33, 6 tokomponent blandinger samt 3 test med de rene stoffer. I en række af disse blandinger indgik tokomponent blandinger, som ikke var undersøgt i de indledende forsøgsserier med tokomponent blandinger. I tabel 9 er vist en oversigt over de tokomponent blandinger, som indgik i disse forsøg.

Tabel 9. Tokomponent blandinger undersøgt med Microtox test som led i forsøgene med trekomponent blandinger. Tallet i parantes angiver antal forsøg med blandingen. En asteriks angiver, at blandingen ikke er undersøgt i forsøgserierne med tokomponent blandinger.

Som følge af at en række af tokomponent blandingerne ikke tidligere var undersøgt var det ikke muligt at klassificere alle 8 trekomponent blandinger på samme måde, som det er gjort for terrestriske og akvatiske planter (Tabel 10).

Tabel 10. Trekomponent blandinger undersøgt med Microtox test.

4.1.4.2 Dataanalyse

Luminescensen blev aflæst inden samt efter 5 og 15 min efter tilsætning af pesticid (i 2002 også efter 30 min). I de tilfælde, hvor luminescensen varierede mere end 20% i de 2 replikater blev denne koncentration udeladt i beregningen af effektkoncentrationer. På basis af luminescensværdierne blev gamma-forholdet beregnet, som er defineret ved forholdet mellem luminescens tabet og den oprindelige luminescens (inden pesticid tilsætning) i den samme prøve. Gamma-værdierne blev korrigeret for tidslige ændringer i luminescensen (som var uafhængige af pesticidtilsætning) ved:

hvor I_0c og I_tc er luminescensen efter tid 0 og t (5 min, 15 min) i kontrolprøverne, og I₀ og I_t er luminescensen efter tid 0 og t i pesticideksponeringerne.

Effektkoncentrationer (ED₂₅ og ED₅₀) blev beregnet ved lineær regression af log10-transformerede pesticidkoncentrationer og gamma-værdier. I flere tilfælde var det ikke muligt at beregne EC₁₀ værdier uden meget store usikkerhedsintervaller. Dette skyldes hovedsageligt "mangel" på koncentrationer i den nedre del af doseringskurven, fordi variationen mellem replikater ofte oversteg 20%. ED₂₅/ ED₅₀ isobolerne blev beskrevet med to-trins modellen (Sørensen et al., 2005b).

4.1.5 Dafnier

Dafnier er den mest anvendte testorganisme til beskrivelse af toksiske stoffers effekt i vandmiljøet. Både akuttest (48 eller 96 timer) og kronisk test (reproduktionstest) er gennem en omfattende afprøvning og interkalibrering mellem laboratorier og lande løbende blevet udviklet til generelt accepterede standarder indenfor OECD, EU og EPA. Den gennemførte standardisering betyder, at man nøje kender organismernes miljøkrav (pH, iltkoncentration etc.) samt den naturlige variabilitet, som igen bestemmer antal replikater, for at effektdoser kan bestemmes med stor og kendt sikkerhed. I EPA's database "AQUIRE" er der registreret mere end 6000 bestemmelser af akut toksicitet overfor dafnier, heraf mere end 1100 for effekter af pesticider. Der foreligger således et meget stort reference-grundlag. Dafnier er nært beslægtede med insekter og påvirkes på samme måde og med nær samme følsomhed som de skadeinsekter, som de specifikt virkende insekticider er tiltænkt. For ikke-specifikt virkende stoffer regnes dafnier generelt blandt de mest følsomme akvatiske organismer.

4.1.5.1 Dyrkningsteknik og eksponering

Forsøgene er gennemført med 24 timer gamle dafnier (Daphnia magna) fra en velfodret kultur. Til t = 0 overføres dafnier til 50 ml glas (5 i hver doseret med pesticider enkeltvist eller i blandinger (Figur 6). Døde (immobile) og levende dafnier i glassene noteres dagligt indtil 48 timer. Forsøgene gennemføres efter Dansk Standard uden fodring i ISO vand (DS/EN ISO 6341). Til kontrol af dafniernes relative følsomhed gennemføres jævnligt parallelforsøg med referencestof (ZnSO₄ 7H₂O)).

Figur 6. Forsøgsdesign med dafnier. En screeningstest består af 4-5 koncentrationer + kontrol med 20 dyr i hver koncentration fordelt på 4 glas med 5 i hvert. I kontrollen er der 30 dyr fordelt på 6 glas. En definitiv test gennemføres med 6-7 koncentrationer + kontrol + evt. kontrol med acetone. Efter 24 og 48 timer måles pH, O₂ og antal immobile dafnier.

Hver binær blanding bestod af 3 blandingsforhold: 75:25, 50:50 og 75:25 samt de to pesticider alene. I tabel 11 er vist en oversigt over antal gennemførte dafnie test med pesticider i tokomponent blandinger. Der er udført ét forsøg med hver blanding med undtagelse af blandingen azoxystrobin+prochloraz, som er undersøgt i 2 forsøg.

Tabel 11. Tokomponent blandinger undersøgt på dafnier.

4.1.5.2 Dataanalyse

Dafnietesten producerer binære data (individerne er enten mobile eller ikke-mobile døde) og traditionelt beregnes dosis-respons sammenhængen og effektkoncentrationer ved probitanalyse (OECD, Finney 1976). Indenfor området ED₁₀-ED₉₀ er der god overensstemmelse mellem probitmodellen og den logistiske model (Halekoh 2004) og estimerede ED₂₅/₅₀ værdier på samme dafnie datasæt viste en variation på mindre end 1%. Efter dafnietestene blev afsluttet i 2003 beregnedes ED-værdier med anvendelse af probitanalyse, men for at gøre resultaterne kompatible med isobolberegningerne (som forudsætter angivelse af standardafvigelse på ED-estimaterne) blev beregningerne gentaget med anvendelse af en log-logistisk model (Cedergreen & Streibig 2003). Isoboler for ED₂₅ og ED₅₀ blev beskrevet med to-trins modellen (Sørensen at al. 2005b),

4.1.6 MCF7 celleproliferationsassay

MCF-7 celle proliferationsassayet er baseret på en human brystcancercellelinie, som differentierer og deler sig, når der er østrogen til stede. Proliferation af cellerne er således indikation for, at der er et kemisk stof til stede med østrogen aktivitet. Metoden anvendes rutinemæssigt flere steder herunder Miljømedicin ved Syddansk Universitet (Andersen et al., 1999) til screening for miljøkemikalier med østrogene egenskaber.

4.1.6.1 Dyrkningsteknik og eksponering

MCF-7 celler udsås i 96 hullers mikrotiterplader. Efter 24 timer tilsættes en koncentrationsrække af testblandingen. Hver koncentrationsrække udføres i trippelsbestemmelse. Efter 6 dages inkubation bliver cellerne fikseret og farvet. Farveintensiteten, som er et mål for antallet af levende celler, aflæses i en ELISA-reader. Hvert forsøg inkluderer en standardrække af 17-østradiol (0,001 nM til til 10 nM). Det maksimale respons af 17-østradiol opnås ved 1 nM.

De pesticider, som indgik i undersøgelserne for østrogene egenskaber, var insekticiderne o,p-DDT, endosulfan og methoxychlor samt fungicidet fenarimol. Alle fire pesticider er klorerede organiske forbindelser. o,p-DDT og methoxychlor er persistente forbindelser, som er akkumuleret i miljøet, fødekæden og i humant væv. Endosulfan og fenarimol anvendes indenfor landbrug og gartneri i en række lande men er ikke godkendte i Danmark.

Blandingerne fremstilles ved fortynding af 10 mM stamopløsninger af pesticiderne opløst i ethanol (96%, Fluka Chemie, Schweiz). Fortyndingen sker i celledyrkningsmedium, og koncentrationen af ethanol i de fortyndede prøver overskrider ikke 0,5%. Testning af alle pesticider og blandinger er udført i mindst tre uafhængige forsøg, og i hvert af forsøgene er testningen udført som trippelbestemmelse. Af tabel 12 fremgår, hvilke tokomponentblandinger, der er undersøgt. Blandingerne o,p-DDT+endosulfan, endosulfan+fenarimol samt fenarimol+methoxychlor er undersøgt i blandingsforholdene 33:67, 50:50 samt 67:33%, mens blandingen o,p-DDT+methoxychlor er undersøgt i 5 blandingsforhold: 25:75, 33:67, 50:50, 67:33 og 75:25.

Tabel 12. Tokomponent blandinger undersøgt med MCF7-celleproliferationsassay

I forsøgene med trekomponentblandinger indgik blandingerne o,p-DDT+endosulfan+methoxychlor samt endosulfan+fenarimol+ methoxychlor. Sammensætningen af både to- og trekomponentblandingerne i disse forsøg blev fastlagt, som beskrevet for terrestriske planter i afsnit 3.2.1.2.

4.1.6.2 Dataanalyse

Resultaterne er angivet som den relative proliferative effekt (RPE), hvorved data normaliseres både i forhold til kontrolniveauet og det maksimale respons induceret af 17-østradiol (1 nM) i det respektive forsøg:

RPE = (PE_teststof ^-1)/( PE _{max 17-østradiol} ^-1)

hvor PE er responset normaliseret til 100.

For hver blanding afbilledes RPE som funktion af pesticidkoncentrationen, og der blev fittet en log-logistisk dosis respons model for hver doseringskurve ved hjælp af drc-pakken til R (Ritz & Streibig, 2005), hvorefter EC₅₀ og EC₁₀ værdierne blev estimeret. Isobolerne blev beregnet, som beskrevet i kapitel 2, ved brug af to-trins modellen (Sørensen et al. 2005a).

4.1.7 AR reportergenassay

Pesticidernes evne til at blokere androgen receptoren blev undersøgt ved hjælp af et reportergenassay for antiandrogene effekter (Vinggaard et al., 1999).

4.1.7.1 Dyrkningsteknik og eksponering

Chinese Hamster Ovary celler (CHO K1) blev udsået i mikrotiterplader, og hver brønd blev transfekteret med 75 ng cDNA bestående af ekspressionsvektoren for den humane androgenreceptor pSVAR0 og et MMTV-LUC reporter plasmid i en ratio på 1:100 ved hjælp af 0.15 l af transfektionsreagenset FuGene. Androgenreceptor agonisten R1881 (0.1 nM) plus/minus pesticider blev tilsat, og efter en inkubationsperiode på 24 timer blev cellerne lyseret, og aktiviteten af den dannede luciferase blev målt i et BioOrbit Galaxy luminometer.

De pesticider, som indgår i testningen for antiandrogene egenskaber, er fungiciderne vinclozolin, procymidon, og prochloraz samt insekticidet fenitrothion. Alle fire pesticider er klorerede organiske forbindelser. Vinclozolin og procymidon anvendes ikke længere i Danmark pga. effekterne på hormonsystemet, mens prochloraz stadig anvendes inden for landbrug og gartneri.

Pesticiderne enkeltvis og i kombination blev undersøgt i 12 koncentrationer i området 0.025 – 50 M i firedobbelt bestemmelse, og forsøgene blev gentaget 3 gange. Af tabel 13 fremgår hvilke tokomponentblandinger, der indgik i forsøgene. Forholdet mellem pesticiderne i tokomponent blandingerne blev fastlagt med udgangspunkt i de forventede EC₅₀ koncentrationer af pesticiderne, således at de to pesticider, under antagelse af ADM, ville bidrage med henholdsvis 25 og 75, 50 og 50 samt 75 og 25% af den samlede effekt af blandingerne. Dog blev blandingen af vinclozolin og procymidon undersøgt i de absolutte indbyrdes forhold 75:25, 50:50 og 25:75, uanset stofferne potens.

Tabel 13. Tokomponent blandinger undersøgt med AR reportergenassay

I forsøgene med trekomponentblandinger indgik blandingerne fenithrothion+procymidon+vinclozolin samt procymidon+prochloraz+ vinclozolin. Sammensætningen af både to- og trekomponentblandingerne i disse forsøg blev fastlagt som beskrevet for terrestriske planter i afsnit 3.2.1.2.

4.1.7.2 Dataanalyse

Rådata for enkeltstofferne og blandinger blev normaliseret, således at responset til 0.1 nM R1881 blev sat til 100%. For enkeltstofferne og hver blanding blev responset (inhibering af AR transkriptionel aktivitet) afbilledet som funktion af pesticidkoncentrationen og kurverne blev fittet til en log-logistisk dosis-respons model ved hjælp af drc-pakken til R (Ritz & Streibig, 2005), hvorefter EC₅₀ og EC₁₀ værdierne blev estimeret. Isobolerne blev beregnet, som beskrevet i kapitel 2 ved brug af to-trins modellen (Sørensen. et al. 2005a)

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 April 2006, © Miljøstyrelsen.