|
Test for human bioopløselighed af jordforureninger 5 Afprøvning af RIVM testmetoder
Testmetoderne RIVM fastende og efter måltid er indarbejdet og afprøvet til test for bioopløselighed af metallerne bly, cadmium og nikkel, samt PAH forbindelserne benzo(a)pyren (BaP) og dibenz(a,h)anthracen (DBahA), henholdsvis. 5.1 Test for metallers bioopløselighedTest for metallers bioopløselighed er gennemført efter RIVMs metode for fastende betingelser /8/, hvor testmetoden er detaljeret givet i bilag A, tilrettet efter den samlede undersøgelses resultater. Metoden er sat op og indledende afprøvet for kritiske parametre som blindbidrag, forudsigelse af testdetektionsgrænse, genfinding af tilsatte metaller og praktisk håndtering af jordprøver i testen. Disse resultater er ikke vist, idet de primært tjener til justering af metoden under opsætning. Efter opsætning er testmetoden afprøvet efter principperne for validering af kemiske analysemetoder /67/, men i et omfang der er reduceret i forhold hertil. Resultaterne af testmetodeafprøvningen er vist i tabel 5.1. Tabel 5.1 Resultater af testafprøvning for metaller, fastende metode
Detektionsgrænsen for testen er for alle metallerne under kravet om højst at være 1/10 af de relevante kriterier, se afsnit 4.2.2. Præcisionen ved testen er næsten tilfredsstillende for cadmium og bly i forhold til kravet om højst 7% total relativ standardafvigelse i kvalitetsklasse 3 /59/. For bly er præcisionen ikke tilfredsstillende, hvilket skyldes en høj variation, når testen er afprøvet over 3 dage. Gennemgang af proceduren under afprøvningen viste, at pH af testopløsningerne og dermed også pH under testen havde været faldende over de 3 testdage. Dette har formodentlig medført en stigende tendens i testresultaterne for bly over afprøvningens 3 dage og følgelig også den noget dårligere præcision imellem serierne. Den faldende pH i testopløsningerne tilskrives, at 2 opløsninger ikke blev frisk fremstillet til hver serie, og kravet herom er nu fremhævet i testforskriften. Det skal bemærkes, at testkvaliteten er svarende til eller bedre end rapporteret fra RIVM for test efter måltid /57/. Genfinding som bioopløselig metal var under (cadmium og nikkel) eller langt under (bly) 100% af den til jorden tilsatte mængde. De tilsvarende genfindinger for testsystemet uden jord er vist i tabel 5.2. Tabel 5.2 Resultater af test for metaller, fastende metode uden jord
Resultaterne viser, at præcisionen uden jord var sammenlignelig med præcisionen med jord i testen, samt at genfindingen undtagen for bly var tæt på 100% uden jord i testsystemet. Resultaterne tyder ikke på, at tilstedeværelse af hvedemel påvirker genfindingen af metallerne i testen. Derfor er den toksikologiske reference hvedemel efterfølgende erstattet af en doseringsreference, som blot er test tilsat en opløsning af tungmetallerne. Endelig viser en genfinding på tæt på 100% for de 2 kationiske metaller cadmium og nikkel, at kolloider i testopløsningerne ikke skilles fra testopløsningen i faseadskillelsen (centrifugering), idet dette på grund af binding af kationerne til kolloiderne ville have vist sig som genfindinger væsentligt under 100%. Genfindingen i testen uden jord er altså tæt på 100% for cadmium og nikkel, mens den er 61-77% for bly. For metaller, der kan udfælde i tarm segmentets neutrale pH og med tilstedeværelse af f.eks. phosphat, kan ikke forventes 100% genfinding af tilsat letopløseligt metalsalt i testen. Denne tendens forstærkes, hvis testen tillige indeholder jord, idet slut pH i testen og indholdet af fældende anioner yderligere øges. Derfor kan kravet for kvalitetsklasse 3 /59/ om genfinding af et kontrolmateriales sande værdi indenfor 95-105% ikke efterprøves ved test af simple kontrolprøver. Genfinding af tilsat bly på under 100% i testen forventedes kompenseret i den praktiske udførelse ved udregning af den relative bioopløselighed, se dog også afsnit 5.3. Der foreligger ikke referencematerialer certificerede med hensyn til indhold af bioopløselige stoffer efter RIVM fastende, ligesom der endnu ikke gennemføres egentlige præstationsprøvninger herfor. I afprøvningen af testmetoden er her i fase 1 foretaget test af én jordprøve, Oker 11, for hvilken testresultater er opnået i andre laboratorier og med andre test- og analysemetoder, tabel 5.3. Tabel 5.3 Resultater af test af Oker 11 jord for bioopløselighed af metaller med forskellige testmetoder/i forskellige laboratorier
Det skal bemærkes, at resultater for bioopløselighed givet i tabel 5.3 ikke kan sammenlignes direkte, idet bioopløseligheden her opgives relativ til total koncentrationen, og denne i et vist omfang afhænger af analysemetoden, se tabel 4.7. Som eksempel kan anføres, at beregnes bioopløseligheden af bly som opnået i denne undersøgelse ikke relativt til denne undersøgelses total koncentration, men relativt til total koncentrationen som målt af RIVM for den samme jord, se tabel 4.7, så bliver bioopløselighedsresultatet 0.22. Der bliver altså bedre overensstemmelse imellem bioopløselighedsresultaterne opnået på forskellige laboratorier, hvis de beregnes relativt til total koncentrationer opnået med samme metode. Lineariteten af testen er efterprøvet op til 4-5 x den relevante kriterieværdi for det enkelte metal ved test af tilsætning uden jord. For cadmium og nikkel er vist linearitet, mens der for bly er fundet signifikant afvigelse fra linearitet (Z-test, 95% konfidensniveau /67/). Den manglende linearitet kan formodentlig forklares ved den tidligere omtalte dag til dag variation, idet lineariteten blev testet over flere dage. Resultaterne af linearitetstest er vist i figur 5.1. Figur 5.1 Resultater for efterprøvning af linearitet ved test for metaller uden jord Under afprøvningen af test for metaller er løbende foretaget analyse af de stamopløsninger, som er fremstillet til og benyttet ved tilsætning af kendte mængder metal til prøverne. Resultaterne af disse analyser viser, at analyseresultater og beregnet indhold stemmer overens for alle metaller over hele afprøvningsperioden, se tabel 5.4. De beregnede koncentrationer er benyttet i alle videre udregninger. Tabel 5.4 Resultater af analyser af stamopløsninger igennem afprøvningsperioden for test for metaller
5.2 Test for PAH's bioopløselighedTest for PAH forbindelsers bioopløselighed er gennemført efter RIVMs metode svarende til efter måltid /9/, hvor testmetoden er detaljeret givet i bilag B, tilrettet efter den samlede undersøgelses resultater. Metoden er sat op og indledende afprøvet for kritiske parametre som blindbidrag, forudsigelse af testdetektionsgrænse, genfinding af tilsatte PAH og praktisk håndtering af jordprøver i testen. Disse resultater er ikke vist, idet de primært tjener til justering af metoden under opsætning. Efter opsætning er testmetoden afprøvet efter principperne for validering af kemiske analysemetoder /67/, men tekniske vanskeligheder i forbindelse med analyserne af testopløsninger for PAH betød, at resultaterne var behæftet med for stor usikkerhed og viste en utilfredsstillende genfinding af tilsatte PAH. Efter afhjælpning af de analysetekniske vanskeligheder er foretaget en afprøvning af de vigtigste parametre for testens ydelse. Resultaterne af testmetodeafprøvningen er vist i tabel 5.5. Tabel 5.5 Resultater af testafprøvning for PAH, efter måltid metode
Detektionsgrænsen for PAH er opnået ved test af naturlige jordprøver, hvor detektionsgrænsen for testen for DBahA er sat op for at svare til den detektionsgrænse, som opgives for analyserne af testopløsningerne. Detektionsgrænsen for testen overholder for begge PAH målsætningen om at være højst 1/10 af den relevante kriterieværdi, se afsnit 4.2.2. Afprøvningen er foretaget på én dag i én serie, og præcisionen imellem serier kan dermed ikke angives. Præcisionen overholder ikke kravet til højest 7% relativ total standardafvigelse for kvalitetsklasse 3 /59/. Dette er dog forventeligt, når den sædvanlige analysekvalitet for organiske forureninger i jord tages i betragtning. Det skal bemærkes, at testkvaliteten er svarende til eller bedre end rapporteret fra RIVM for samme test /57/. Genfindingen af tilsat PAH som bioopløselig PAH er for begge stoffer noget under 100%. Den tilsvarende genfinding for testsystemet uden jord er vist i tabel 5.6. Tabel 5.6 Resultater af test for PAH, efter måltid metode uden jord
Den relative standardafvigelse lader sig ikke beregne, da der kun indgik 2 prøver af hver slags (test uden jord og test uden jord med hvedemel), men den gennemsnitlige relative variationsbredde var 3-10% og dermed væsentligt lavere end den relative standardafvigelse som målt for testen med jord tilsat. Resultaterne viser, at genfindingen uden jord og uden jord med hvedemel er sammenlignelig med genfindingen med jord i testen. Resultaterne tyder ikke på, at tilstedeværelse af hvedemel påvirker genfindingen af PAH i testen. Derfor er den toksikologiske reference hvedemel efterfølgende erstattet af en doseringsreference, som blot er test tilsat en opløsning af PAH forbindelserne. Endelig viser en genfinding ikke langt fra 100% for de 2 PAH, at kolloider i testopløsningerne ikke skilles fra testopløsningen i faseadskillelsen (centrifugering), idet dette på grund af binding af PAH til kolloiderne ville have vist sig som genfindinger væsentligt under 100%. Genfindingen i testen uden jord på samme niveau som med jord viser, at PAH i testen i et vist omfang bindes i uopløselige testkomponenter og ikke i komponenter, der tilføres med jorden. Derfor kan kravet for kvalitetsklasse 3 /59/ om genfinding af et kontrolmateriales sande værdi indenfor 95-105% ikke efterprøves ved test af simple kontrolprøver. Der er ikke i denne del af afprøvning testet jordprøver, for hvilke der foreligger pålidelige resultater af bioopløselighedstest fra andre laboratorier eller med andre tests. Genfinding af tilsat PAH på under 100% i testen forventedes kompenseret i den praktiske udførelse ved udregning af den relative bioopløselighed. Lineariteten af testen er efterprøvet op til 500 x den relevante kriterieværdi for den enkelte PAH ved test af tilsætning uden jord. Testen er fundet lineær over hele intervallet. Det skal bemærkes, at afprøvning af linearitet blev udført med analyser af testopløsninger med betydelig analyseusikkerhed og genfinding afvigende fra 100%, fordi ikke alle tekniske vanskeligheder med analysemetoden endnu var løst. Resultaterne af linearitetstest er vist i figur 5.2. Figur 5.2 Resultater for efterprøvning af linearitet ved test for PAH uden jord Under afprøvningen af test for PAH er løbende foretaget analyse af de stamopløsninger, som er fremstillet til og benyttet ved tilsætning af kendte mængder PAH til prøverne. Resultaterne af disse analyser viser, at analyseresultater og beregnet indhold stemte overens for begge PAH over hele afprøvningsperioden, se tabel 5.7. De beregnede koncentrationer er benyttet i alle videre udregninger. Tabel 5.7 Resultater af analyser af stamopløsninger igennem afprøvningsperioden for test for PAH
5.3 Variationer i test pHDer er tidligere opstillet krav til slut pH i testopløsninger efter såvel mave- som tarm segment, både for testen svarende til fastende for hold og til efter måltid /68/. Disse krav skulle sikre bioopløselighedsforhold indenfor det fysiologisk korrekte, og således forhindre for lav opløsning af jordforureninger i både mave og tarm, samt udfældning som følge af forhøjet pH. Under gennemførelse af tests af jordprøver fra danske forurenede grunde (se kapitel 6) er foretaget målinger af pH i testopløsningerne, og disse er i tabel 5.8 opsummeret sammen med de tilstræbte pH intervaller for testene. Udfra de ønskede og opnåede pH værdier i testopløsningerne, samt udfra de i kapitel 4 diskuterede forhold vedrørende pH i de forskellige testsegmenter er i tabel 5.8 angivet et interval for pH i testsegmenterne, som skal være opfyldt. Tabel 5.8 pH i testopløsninger sammenholdt med tilstræbte pH intervaller
Kravværdierne for pH under testen er indført i analysemetoderne, Bilag A og B. Det skal bemærkes, at endnu ikke offentliggjorte resultater af undersøgelser foretaget af RIVM viser, at med test af reduceret jordmængde (0.06 g imod standard 0.6 g) kan pH også for udvalgte danske jordprøver holdes under 1.8 efter mave segment {Oomen 2005 218 /id}. Særligt for bly er slut pH i tarm segmentet kritisk, idet bly udfældes ved den relativt høje pH, som tilstræbes i dette segment: Pb++ + 2OH- I ren vandig opløsning starter udfældningen, når pH overskrider cirka 6 ved høj koncentration af bly /69/, men pH for udfældning afhænger både af blykoncentrationen og af tilstedeværelsen af kompleksbindende stoffer i opløsningen. Det skal bemærkes, at der på nuværende tidspunkt ikke er enighed om ligevægtskonstanten (opløselighedsproduktet) for udfældning af bly fra vandig opløsning indenfor godt 4 størrelsesordener (højeste 4.2×10-15, laveste 1.4×10-20) /69/. Det lader sig ikke gøre simpelt at forudsige den kritiske pH og bly koncentration for udfældning af bly i en kompliceret opløsning svarende til det, der benyttes ved test for bioopløselighed. Af den årsag er bioopløselighedstesten baseret på udførelse af referencetest, som benyttes til udregning af den relative bioopløselighed korrigeret for f.eks. udfældning af bly. Ved første gennemførelse af RIVM fastende test for de hjemhentede jordprøver i undersøgelsens fase 2, se afsnit 7.3, sås det for en stor del af jordene, specielt for jorde forurenet med mineaffald, at kravene til slut pH ikke var opfyldt. Derfor blev der udført en delundersøgelse af sammenhængen imellem slut pH i test under fastende forhold og opløseligheden af bly. Delundersøgelsen er gennemført ved at foretage test med tilsætning af en kendt mængde af et letopløseligt blysalt, hvorefter pH i det sidste tarm segment blev justeret ved tilsætning af forud fastlagte mængder af stærk base (NaOH). For fuldstændighedens skyld gennemførtes dette også for cadmium og nikkel. Resultaterne af denne delundersøgelse viste, se figur 5.3, en nogenlunde konstant genfinding af nikkel over det undersøgte pH interval, en konstant genfinding af cadmium indtil pH = 5.5 og derefter et fald, samt en faldende genfinding af bly indtil cirka pH = 5 og derefter en konstant genfinding. Figur 5.3 Sammenhæng imellem bioopløselighed af tilsatte metaller og pH i delundersøgelse af pH effekt
For at få en bedre beskrivelse af sammenhængen imellem pH og genfinding af metallerne blev de reference tests inddraget, der er blevet gennemført under hele afprøvningsforløbet. Resultatet er vist for bly i figur 5.4. Figur 5.4 viser faldende bioopløselighed af bly i pH intervallet 4.0-5.2 og konstant bioopløselighed i pH intervallet 5.2-7.0. Med udgangspunkt i de samlede data er opstillet funktioner til beregning af referencebioopløselighed udfra slut pH i den enkelte test, tabel 5.9. Tabel 5.9 Funktioner til beregning af referencebioopløselighed udfra slut pH i testen
Figur 5.4 Sammenhæng imellem bioopløselighed af bly og pH i delundersøgelse af pH effekt og tidligere gennemførte reference tests
På grund af den store følsomhed af bioopløseligheden af særligt bly for slut pH i RIVM fastende testens tarm segment kan beregning af relativ bioopløselighed udfra slut pH i den enkelte jordprøves testopløsning efter tarm segment med fordel benyttes og ikke beregning udfra en eksperimentel toksikologisk reference, der i mange tilfælde har udvist en anden pH. Denne fremgangsmåde er benyttet i undersøgelsen af sammenhæng imellem RIVM fastende in vitro test data og in vivo biotilgængelighedsdata, se afsnit 7.3, fase 2. 5.4 Variationer i testbetingelser for PAHTil yderligere belysning af testbetingelsernes indflydelse på bioopløselighed af PAH er med RIVM testmetoden efter måltid gennemført undersøgelser af effekten af forøget testtid i tarm segmentet (standard 2 timer og 4 timer), undersøgelse af effekten af trinvis øgning af pH i tarm segmentet og af effekten af lavere pH i tarm segmentet. Der er i testen benyttet en dansk jord forurenet med PAH fra en porcelænsfabrik, og testene er udført i triplikat undtagen 4 timer lav pH i tarm segment, der er udført i duplikat. Resultaterne er vist i tabel 5.10. For begge PAH gav øget testtid i tarm segmentet væsentligt øget relativ bioopløselighed fra jordprøven. Forskellene imellem de forskellige pH forhold ved 4 timers test tid er ikke statistisk signifikante (95% konfidensniveau), men antyder en lavere relativ bioopløselighed ved den trinvise øgning af pH. Ved testen over 4 timer og lav pH i tarm segment var slut pH omkring 6, for de øvrige omkring 7. Der er tidligere beskrevet /70/, at øget testtid i tarm segmentet havde begrænset effekt på den relative bioopløselighed af BaP i denne test (RIVM efter måltid), at øget testtid og øget koncentration af galde i tarm segmentet i nogen grad øgede bioopløseligheden, og endelig at øget pH i tarm segmentet i væsentlig grad øgede bioopløseligheden. Disse data blev opnået i tests tilsat PAH og uden ”rigtig” jord. Tabel 5.10 Relativ bioopløselighed af BaP og DBahA som funktion af testtid og pH justering i tarm segmentet for RIVM efter måltid
I udviklingen af testmetoden valgtes derfor at øge pH, idet dette blev anset for at give den højeste (mest konservative) bioopløselighed af PAH og andre organiske forureninger /70/. I denne undersøgelse er som standard benyttet den høje pH i tarm segmentet. Det må imidlertid konkluderes, at øget testtid yderligere kunne øge bioopløseligheden af PAH fra den undersøgte, ”rigtige” jordprøve, mens pH i tarm segmentet i denne undersøgelse havde begrænset effekt. Fodnoter [7] Måleresultater lavere end detektionsgrænsen for analyse af testopløsninger
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Pb(OH)2 (s)
