| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Test for human bioopløselighed af jordforureninger

Bilag B

Test for bioopløselighed af PAH fra jord

Metodebeskrivelse

1 INTRODUKTION

Test for human bioopløselighed er en test, der simulerer opløsningen af ikke flygtige PAH fra forurenet jord i menneskets mave- og tarmsystem efter indtagelse af et måltid. Testen kan benyttes til at måle den relative bioopløselighed i forhold til forud definerede referencebetingelser. Fortolkning og anvendelse af testresultater er beskrevet i tekstdelen af denne rapport, Miljøprojekt nr. XYZ, 2005 udgivet af Miljøstyrelsen.

For human bioopløselighed af tungmetaller benyttes en anden version af testen, som findes i Bilag A.

2 PRINCIP

I testen behandles jorden med opløsninger, der i sammensætning svarer til menneskets spyt, mavesaft og tarmvæske. Testopløsningerne indeholder uorganiske salte, pH buffer, enzymer, lipider og andre typiske komponenter i menneskets fordøjelsesvæsker. Som første del af testen tilsættes babymad, der simulerer fødeindtag sammen med jorden.

Inden test forbehandles jorden ved tørring og sigtning, og der udtages en delprøve til kemisk analyse. Krav til analysemetode og –kvalitet er specificeret i tekstdelen til denne rapport.

Testen omfatter 3 trin:

1. jord blandes med føde og spyt, og inkuberes i 5 minutter ved 37°C under blanding.
2. efter de fem minutter tilsættes mavesaft og blandingen inkuberes 2 timer ved 37°C under blanding.
3. derefter tilsætte tarmsaft, galde og bicarbonatopløsning, og denne blanding inkuberes 2 timer ved 37°C under opblanding.

Efter end inkubering centrifugeres blandingen, og den ovenstående vædske tages af og analyseres.

Ved test for PAH benyttes alle 3 trin.

3 UDSTYR

Nedenfor er beskrevet typer af udstyr med angivelse af mærke som eksempel.

3.1 Ovn, indstillet til 40°C ± 2°C
3.2 Sigte med 2 mm åbning fremstillet af polypropylen eller anden hård plast
3.3 Håndmorter af porcelæn
3.4 Riffle boks af rustfrit stål
3.5 Teflonbelagt stål spatel
3.6 Skvalpe til ”all over” omrystning med frekvens ikke under 10 rpm [28],
3.7 Polycarbonat testglas med polycarbonat låg.
3.8 Målekolber og Erlenmeyer kolber.
3.9 Thermostateret vandbad indstillet til 37°C ± 2°C og forsynet med timer til programmeret start indenfor 24 timer.
3.10 Centrifuge indstilbar til 3.000 g ± 100 g med indsatser svarende til benyttede testglas.
3.11 Dispensere, 1-10 mL.
3.12 Magnetomrører og magneter.
3.13 pH meter med kombinations pH electrode.
3.14 Finpipetter med pipettespidser,
3.15 Carlsbergpipetter
3.16 Analysevægt, 0,1 –1000 mg ± 0,1 mg.
3.17 Grovvægt
3.18 Klimarum indstillet til 37°C ± 1°C og forsynet med thermostatreguleret varmeblæser

Udstyr er rengjort efter ”metalopvaskeprocedure” med forudgående desinfektion ved maskinopvask. Dette indebærer skylning med fortyndet saltsyre (4.12.1) i 2 skyllebade og rent vand (benyttes til 3 opvaske, skiftes så), efterfulgt af tørring i varmeskab og opbevaring tildækket med låg eller aluminiumsfolie indtil brug.

4 KEMIKALIER OG OPLØSNINGER

Benyttede kemikalier er af analysekvalitet, med mindre andet er anført. Renset vand af Millipore kvalitet (Milli Q anlæg) benyttes i alle tilfælde. Fabrikat og leverandør navne er alene givet som eksempler. Mindre mængder af opløsninger med samme koncentrationer kan fremstilles ved proportional justering af mængder, og til hjælp hertil foreligger et regneark.

4.1 NaCl, Merck.
4.1.1 Opløsning af NaCl, 350.6 g/2 L.
4.2 KSCN, Merck
4.2.1 Opløsning af KSCN, 10 g/500 mL.
4.3 NaH₂PO₄, Merck.
4.3.1 Opløsning af NaH₂PO₄, 88.8 g/L.
4.4 Na₂SO₄, vandfrit, Merck.
4.4.1 Opløsning af Na₂SO₄, 28.5 g/500 mL.
4.5 KCl, Merck.
4.5.1 Opløsning af KCl, 89.6 g/L.
4.6 CaCl₂ · 2H₂O, Merck.
4.6.1 Opløsning af CaCl₂ . 2H₂O, 2.22 g/100 mL.
4.7 NH₄Cl, Merck.
4.7.1 Opløsning af NH₄Cl, 1.53 g/50 mL.
4.8 NaHCO₃, Merck.
4.8.1 Opløsning af NaHCO₃, 169.4 g/2 L.
4.9 KH₂PO₄, Merck.
4.9.1 Opløsning af KH₂PO₄, 8 g/L.
4.10 MgCl₂, Merck.
4.10.1 Opløsning af MgCl₂, 5 g/L.
4.11 NaOH, Merck.
4.11.1 Opløsning af NaOH, 2 g/50 mL.
4.12 HCl, 37 % g/g (sg 1,18 kg/L), Merck.
4.12.1 Opløsning af HCl, fortynd 8 mL 37% HCl til 1 L med rent vand
4.13 Urinstof, Merck.
4.13.1 Opløsning af urinstof, 25 g/L.
4.14 D+ Glucose, vandfrit, Merck.
4.14.1 Opløsning af glucose, 65 g/L.
4.15 D-Glucuronsyre, Fluka.
4.15.1 Opløsning af glucuronsyre, 2 g/L.
4.16 D-Glucosaminehydrochlorid, Merck.
4.16.1 Opløsning af glucosaminhydrochlorid, 33 g/L.
4.17 Urinsyre, Merck.
4.18 -Amylase, Merck (nuværende produkt under udskiftning hos RIVM).
4.19 Mucin, Roth, art. nr. 8494 73-95%.
4.20 Pepsin, Merck, art. nr. K27462885 042.
4.21 BSA (serum albumine bovine, fraktion V), Merck, art. nr. K28215718 109.
4.22 Pancreatin, Merck, art. nr. F 1187530 245.
4.23 Lipase, type II, crude, Sigma, art. nr. L-3126 EC 3.1.1.3 [9001-62-1].
4.24 Galde, freeze dried bovine, Sigma, art. nr. B-3883 [8008-63-7].
4.25 Babymad, kyllingeret med kartoffelmos, Nestlé, holdbarhed til 27-08-05, 200 g, per 100 g 80 kcal, 3,5 g protein, 8,5 g kulhydrat og 3,5 g fedt ^[29]

Stamopløsningerne 4.1.1 til 4.16.1 fremstilles og opbevares i køleskab, <5°C, i glasflasker med skruelåg. Dog skal opløsning af CaCl₂ (4.6.1) og NH₄Cl (4.7.1) fremstilles frisk for hver testserie. Stamopløsninger kan gemmes 3 måneder køligt, 1-5°C, og fremstillingsdato/-initialer anføres på flaskerne.

Der fremstilles 4 fordøjelsesvædsker: spyt, mavesyre, tarmsaft og galde. Hver vædske fremstilles ved 1:1 sammenblanding af 2 separat fremstillede opløsninger af henholdsvis organiske og uorganiske komponenter, hvorefter yderligere komponenter opløses i blandingen.

Der foretages kontrol af pH på fremstillingsdagen for opløsningerne, samt inden ibrugtagning af færdige vædsker.

De 4 vædsker fremstilles dagen før brug, hvorefter de placeres i koldt vandbad indstillet til opvarmning til 37°C med start 2 timer før ibrugtagning den næste dag. Afvejede mængder af faste stoffer fremstilles inden sammenblanding af væskerne, f.eks. i vejebægre dækket med urglas eller lignende.

Krav til præcision af afvejninger er:

De enkelte opløsninger fremstilles i målekolber svarende til total volumen opløsning. Kontrol af pH foretages ved ophældning af lille delmængde i pH målebæger, ikke ved neddypning af elektrode i vædskerne.

4.26 Spyt, uorganisk.

4.27 Spyt, organisk.

4.28 Spyt, fordøjelsesvædske

Bland de 500 mL spyt uorganisk, 4.25, med de 500 mL spyt organisk, 4.26, i 1 L glasflaske med skruelåg og forsynet med magnet. Placer flasken på magnetomrører og tilsæt følgende, idet opløsning af hvert enkelt stof afventes, inden næste stof tilsættes.

290 mg α-amylase (4.18)
15 mg urinsyre (4.17)
25 mg mucin (4.19)

Kontroller pH til 6,8 ± 0,2. Justér om nødvendigt ved tilsætning af fortyndet NaOH (4.11.1) eller koncentreret HCl (4.12).

4.29 Mavesaft, uorganisk.

4.30 Mavesaft, organisk.

4.31 Mavesaft, fordøjelsesvædske

Bland de 500 mL mavesaft uorganisk, 4.28, med de 500 mL mavesaft organisk, 4.29, i 1 L glasflaske med skruelåg og forsynet med magnet. Placer flasken på magnetomrører og tilsæt følgende, idet opløsning af hvert enkelt stof afventes, inden næste stof tilsættes.

1 g BSA (4.21)
2,5 g pepsin (4.20)
3 g mucin (4.19)

Pepsin opløses langsomt og kræver ½ times konstant omrøring inden næste stof tilsættes.

Kontroller pH til 1,30 ± 0,02. Justér om nødvendigt ved tilsætning af fortyndet NaOH (4.11.1) eller koncentreret HCl (4.12).

Denne opløsning vil i reglen indeholde lidt hvidt svæv.

4.32 Tarmsaft, uorganisk.

4.33 Tarmsaft, organisk.

4.34 Tarmsaft, fordøjelsesvædske

Bland de 500 mL tarmsaft uorganisk, 4.31, med de 500 mL tarmsaft organisk, 4.32, i 1 L glasflaske med skruelåg og forsynet med magnet. Placer flasken på magnetomrører og tilsæt følgende, idet opløsning af hvert enkelt stof afventes, inden næste stof tilsættes.

9 mL CaCl₂ (4.6.1)
1 g BSA (4.21)
9 g pancreatin (4.22)
1,5 g lipase (4.23)

Kontroller pH til 8,1 ± 0,2. Justér om nødvendigt ved tilsætning af fortyndet NaOH (4.11.1) eller koncentreret HCl (4.12). Denne fordøjelsesvædske vil ofte indeholde en smule hvidt svæv.

4.35 Galde, uorganisk.

4.36 Galde, organisk.

4.37 Galde, fordøjelsesvædske

Bland de 500 mL galde uorganisk, 4.34, med de 500 mL galde organisk, 4.35, i 1 L glasflaske med skruelåg og forsynet med magnet. Placer flasken på magnetomrører og tilsæt følgende, idet opløsning af hvert enkelt stof afventes, inden næste stof tilsættes.

10 mL CaCl₂ (4.6.1)
1,8 g BSA (4.21)
30 g galde (4.24)

Kontroller pH til 8,2 ± 0,2. Justér om nødvendigt ved tilsætning af fortyndet NaOH (4.11.1) eller koncentreret HCl (4.12).

Denne opløsning er grøn og uklar, men indeholder ikke synlige partikler. Opløsningen må ikke være brun, men skal så genfremstilles.

5 KEMISKE ANALYSER

Testopløsninger analyseres for PAH ved væske/væske ekstraktion (dråber af methanol kan tilsættes for at bryde emulsion) med dichlormethan, oprensning på fastfasekolonne efterfulgt af GC-MS og med isotopmærkede PAH som intern standard og kalibrering overfor ekstern standardkurve udført med spikede prøver af fordøjelsesvæske. Hele mængden af testopløsning inklusive eventuelle fedtperler skal medtages i ekstraktionen. Mindste krav til analysekvalitet er anført i hovedrapportens tekstdel kapitel 4.

For prøver til analyse for PAH skal analysen igangsættes straks efter ved testen ved tilsætning af ekstraktionsmiddel, mens ekstraktionen skal foretages den efterfølgende dag. Prøver opbevares under alle omstændigheder køligt (1-4°C). Hvis opbevaring er nødvendig, tilsættes intern standard, hvorefter prøverne nedfryses.

6 FREMGANGSMÅDER

Repræsentative jordprøver udtages i ”syltetøjsglas” eller tilsvarende, der fyldes helt og opbevares køligt (1-4°C) ikke længere end 1 uge.

6.1 Forbehandling af jordprøver

Inden test foretages følgende forbehandling af jordprøver:

• tørring af mindst 250 g vejet jord i ovn ved 40° til konstant (<5% ændring i vægttab per 24 timer) vægt (start- og slutvægt noteres)
• manuel frasortering af sten, grene m.v. over 2 mm
• forsigtig knusning af jordaggregater, evt. i håndmorter (porcelæn)
• manuel frasortering af evt tilbageværende sten over 2 mm
• sigtning til < 2mm
• eventuelt gentagelse af knusning og sigtning, hvis jordaggregater kan ses
• homogenisering af sigtet prøve ved omrøring
• udtagning af repræsentativ delprøve til test af tør, sigtet og homogeniseret prøve
• vejning af samlede frasorterede fraktioner

Der benyttes sigter af hård plast, teflonbelagte skeer, samt riffle box af rustfrit stål.

Der udtages altid 50 g tørret, sigtet og homogeniseret prøve i glasbeholder med skruelåg til analyse for indhold af PAH (ekstraktion/GC-MS).

Til test og til total analyse benyttes altså fraktionen under 2 mm. Det endelige resultat korrigeres til oprindelig tørvægt udfra vejetal for tør total prøve og tør frasorteret fraktion.

Denne fremgangsmåde bør ikke benyttes, såfremt flygtige stoffer (mange organiske forureninger herunder mindre PAH) skal testes.

6.2 Opsætning

I hver serie opsættes 2 blindprøver (tomme glas igennem hele proceduren), samt 1 dobbelttest for hvert prøvetagningssted og en jordkontrolprøve. Tillige opsættes dobbelttest af doseringsreference i hver serie, hvor testkoncentrationen bliver 5 x kriterieværdien. Der skal benyttes PAH opløst i acetone til fremstilling af doseringsreferencer, som f.eks. angivet nedenfor.

6.3 Test

Dag 1

Sæt skvalpen i klimarum og kontroller temperaturen til 37 ± 2°C.

Fremstil fordøjelsesvædsker og sæt dem i vandbad med koldt vand. Indstil vandbadet til at starte opvarmning til 37 ± 0.5°C 2 timer før påtænkt ibrugtagning af vædskerne på den efterfølgende dag 2. Sæt de færdige fordøjelsesvædsker, spyt, mavesaft, tarmsaft og galde, i vandbadet.

Dag 2

Bland 6 mL spyt, 12 mL mavesaft, 12 mL tarmsaft, 6 mL galde og 2 mL NaHCO₃ (4.8.1) i testglas og kontrollér, at pH > 5,0. Hvis dette ikke er tilfældet, fremstilles ny fordøjelsesvædsker. Bestem tørstof af føde i triplikat.

Afvej 0,4 g af jord og 4,5 g føde (vådt afvejet) i testglas, således at alle glas klargøres og sættes op i stativ. Sæt glassene op således, at der startes med blindprøver og prøver med lave koncentrationer og derefter fortsættes efter forventet koncentration.

Tilsæt med dispenser 6 mL spyt til hvert glas, luk glasset og ryst 5 minutter. Under brug af dispenser er flasken med fordøjelsesvædske placeret på magnetomrører med magnet i for at holde evt. svæv i suspension. Typisk arbejdes med serier på 25 tests, hvilket giver en passende arbejdsgang.

Tilsæt med dispenser (omrøring) 12 mL mavesaft til hvert glas, luk glasset, anbring i skvalpe i klimarum og bland i 2 timer.

Mål og noter i hvert glas pH (pH meter kalibreret ved pH 4 og 7), idet pH elektroden omhyggeligt skylles med rent vand i sprøjteflaske og aftørres med et nyt og rent stykke linse papir imellem neddypning i hvert testglas. pH vil være omkring 2,2, men må ikke være ikke under 2,0 og ikke over 2,5. Hvis dette ikke er tilfældet, kan testen ikke benyttes i standardudformning.

Tilsæt med dispenser (omrøring) 12 mL tarmsaft, 6 mL galde og 2 mL NaHCO₃ (4.8.1) til hvert glas (gennemfør med én fordøjelsesvædske ad gangen for hele serien), luk glasset, anbring i skvalpe i klimarum og bland i 2 timer.

Centrifuger testglas 5 minutter ved 2.500-3.000 g, og overfør derefter forsigtigt den ovenstående vædske til prøveglas. Til PAH overføres mindst 30 mL til organisk vaskede glasbeholdere med skruelåg og teflonindlæg.

Overførslen foretages ved først at udtage med udglødet Pasteur pipette med ny eller sikkert ren bold (for hver serie) overfladen af vædske med evt fedtperler og overføre til prøvebeholdere. Dette gøres nogle gange, herunder skylles siderne af glasset grundigt med vædske (uden at forstyrre bundfaldet), og Pasteur pipetten renses grundigt ved til sidst at skylle pipetten grundigt ved at suge frem og tilbage med lidt vædske fra glasset.

Mål og noter i hvert glas med rest pH (pH meter kalibreret ved pH 4 og 7), idet pH elektroden omhyggeligt skylles med rent vand i sprøjteflaske og aftørres med et nyt og rent stykke linse papir imellem neddypning i hvert testglas. pH vil være omkring 7.0, men skal være over 6.8 og under 7.2. Hvis dette ikke er tilfældet, kan testen ikke benyttes i standardudformning.

6.4 Kvalitetskontrol

Som kvalitetskontrol benyttes dobbelttest af blind i hver serie, 1 dobbelttest fra hvert prøvetagningssted, dobbelttest af doseringsreference i hver serie, samt som jordkontrolprøve mindst 1 test af et internt eller eksternt fremstillet, homogent og stabilt kontrolmateriale. Resultater af blindtest databehandles i X- og R-kort, af dobbelttest i r-kort, af doseringsreferencer i X- og R-kort og af jordkontrol i X-kort.

Fra blindtest fås detektionsgrænse, fra dobbelttest fås præcision (indenfor serier) på test af jordprøver og fra doseringsreferencer fås en løbende kontrol af genfinding i forhold til erfaringsværdi samt en kontrol af erfaringsmæssig præcision. Fra test af kontrolmateriale fås kontrol af genfinding i test af jord, samt af præcision på test af jordprøver (imellem serier).

Bemærk dog, at for PAH vil blindprøver i reglen give resultater under analysedetektionsgrænsen, således at test detektionsgrænse skal estimeres fra metodeindkøring.

Kontrolkort og kontrolgrænser opstilles efter indkøring og afprøvning af metoden.

6.5 Beregning

Der opnås følgende analyseresultater:

Koncentration C_j i jord i mg/kg tørstof
Koncentration C_ti i testopløsning i mg/L testopløsning
Koncentration C_bi i blindtestopløsning i mg/L testopløsning
Koncentration C_ri i doseringsreferenceopløsning i mg/L testopløsning

Hvor der er udført dobbeltests udregnes gennemsnit og benyttes videre.

Følgende størrelser kendes:

Afvejet mængde jord, m_ji i g
Tørstofindhold af jord, dw_ji i %
Volumen testopløsning 0,038 L (skal justeres for vandindhold i føde, måles)
Tilsat mængde forurening i doseringsreference, m_r i mg

Fraktionen af bioopløselig forurening i jorden, AF_j, beregnes som:

AF_j = ((C_t-C_b)*0,038)/(C_j*m_j/1000)

Fraktionen af bioopløselig forurening i doseringsreference, RA_r, beregnes som:

RA_r = ((C_r-C_b)*0,038)/m_r

Den relative bioopløselighed af jordens forureninger, RAF, beregnes som forholdet imellem den bioopløselige fraktion i jorden og i doseringsreferencen:

RAF = AF_j/AF_r

Fodnoter

[28] rpm: rotations per minute, fuldstændig opblanding af jord og testopløsning skal sikres for alle jordtyper, der testes

[29] Før første test undersøges, om babymaden er homogen og findelt, hvis ikke blendes inden brug.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Maj 2006, © Miljøstyrelsen.