| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Effekter af pulseksponering med pyrethroider på vandløbsinvertebrater

2 Metoder

• 2.1 Metodebeskrivelse
• 2.2 Forsøgsorganismer
  • 2.2.1 Valg of forsøgsorganismer
  • 2.2.2 Opmåling af forsøgsdyr
• 2.3 Bevægelsesadfærd i laboratoriet
  • 2.3.1 Overordnet forsøgsstrategi
  • 2.3.2 Forsøgsbetingelser
  • 2.3.3 Registrering af bevægelsesadfærd i laboratoriet
  • 2.3.4 Generelt forsøgsdesign
  • 2.3.5 Relativ toksicitet af pyrethroider anvendt i Danmark
  • 2.3.6 Pulsvarighedens betydning
  • 2.3.7 Temperaturens betydning
  • 2.3.8 Pesticidblanding
  • 2.3.9 Koncentrations-respons-forsøg med udvalgte arter
  • 2.3.10 Restitueringsforsøg
  • 2.3.11 Rovdyr-byttedyrs-interaktion
  • 2.3.12 Statistisk metode
• 2.4 Drift i strømrender
  • 2.4.1 Overordnet forsøgsstrategi
  • 2.4.2 Strømrender
  • 2.4.3 Dosering af lambda-cyhalothrin i strømrenderne
  • 2.4.4 Drifteksperimenter
  • 2.4.5 Flerarts-forsøg
  • 2.4.6 Statistisk metode
• 2.5 Oversigt over udførte forsøg
• 2.6 Pesticidvalg
• 2.7 Kvantificering af lambda-cyhalothrin
  • 2.7.1 Metodebeskrivelse

2.1 Metodebeskrivelse

Bevægelsesadfærden hos vandløbsinvertebrater anbragt i glaspetriskåle i laboratoriet blev registreret ved hjælp af et computerstyret videosporingsystem før, under og efter forskellige former for pulseksponering for pyrethroider, primært lambda-cyhalothrin. Effekten på bevægelsesadfærden blev sammenholdt med lambda-cyhalothrins indvirkning på drift og effekter i flerarts-forsøg i udendørs strømrender. Laboratorieforsøgene blev udført ved Biologisk Institut, SDU, mens strømrendeforsøg blev udført hos Afd. for Ferskvandsøkologi, DMU, Silkeborg. For at opnå realistiske koncentrations-respons-sammenhænge blev de reelle koncentrationer af pyrethroidet lambda-cyhalothrin bestemt i såvel laboratorie- som strømrendestudierne.

2.2 Forsøgsorganismer

2.2.1 Valg of forsøgsorganismer

De anvendte forsøgsorganismer er blevet udvalgt på baggrund af følgende kriterier:

1.        De skulle være repræsentative for de mest udbredte taxonomiske grupper af vandløbsinvertebrater i Danmark.

2.        De skulle have forskellig tolerance overfor pesticider og andre påvirkninger.

3.        De skulle være forskellige med hensyn til livshistorie, fødebiologi og deres forventede adfærdsrepons overfor pesticider (nogle forventedes at øge aktiviteten, andre ikke).

4.        De skulle være robuste under forhold med ikke-strømmende vand, så de kunne anvendes i videosporingssystemet i laboratoriet.

Da der ikke var vandbevægelse i de til videosporingsforsøgene anvendte petriskåle, ville visse vandløbsinvertebrater ikke kunne overleve i laboratorieopstillingen. De fem testorganismer, der blev anvendt i såvel laboratorie- som strømrendeforsøg, inkluderede ferskvandstangloppen Gammarus pulex, slørvingen Leuctra nigra, døgnfluen Heptagenia sulphurea, vårfluen Sericostoma personatum, og huesneglen Ancylus fluviatilis. Endvidere blev vandbænkebideren Asellus aquaticus anvendt til laboratorieforsøg. Indsamlingslokaliteterne er angivet i Tabel 2.1.

Tabel 2.1. Indsamlingslokalitet for forsøgsorganismer anvendt i laboratoriet (L) og strømrenderne (S)

2.2.2 Opmåling af forsøgsdyr

Hovedparten af alle invertebrater anvendt i laboratorieforsøgene samt fra strømrendeforsøgene blev ethanolkonserveret og efterfølgende målt, således at deres størrelsesfordeling mellem de enkelte forsøg eventuelt kunne inddrages i vurderingen af resultaterne. For at kunne relatere størrelsen af de anvendte invertebrater til andre undersøgelser blev tørvægten beregnet på baggrund af tidligere beskrevne relationer mellem længden af en given morfologisk enhed (f.eks. bredden af hovedkapslen) og dyrenes tørvægt (Zelinka & Marvan 1976; Iversen & Jessen 1977; Friberg et al. 2002). For visse arter var det nødvendigt at etablere nye relationer (A. aquaticus og A. fluviatilis). Dette blev gjort ved at indsamle nye individer på indsamlingslokaliteterne og dernæst måle den relevante morfologiske enhed. Derefter blev dyrene tørret, uden først at være konserveret, til konstant vægt ved 60 °C. Ved hjælp af simpel lineær regression blev der dernæst opstillet en model, hvorved den morfologiske enhed kan konverteres til en tørvægt. Tabel 2.2 viser gennemsnitsvægt og standard error på de individer af invertebrater, der er indgået i de enkelte eksperimenter.

Tabel 2.2. Tørvægt af de anvendte individer af invertebrater (gns ± SEM), samt længde-tørvægts-relationer

2.3 Bevægelsesadfærd i laboratoriet

2.3.1 Overordnet forsøgsstrategi

Der blev gennemført en række forsøg med G. pulex, der havde det dobbelte formål at optimere forsøgsdesignet til eksponering af de øvrige arter af invertebrater samt at dokumentere generalisérbarheden af de opnåede resultater med henblik på ekstrapolering af observerede effekter på bevægelsesadfærden i laboratoriet til effekter på drift i strømrenderne.

Indledningsvis blev eksponeringsforsøg med fem pyrethroider gennemført for at undersøge, hvorvidt det var muligt at evaluere eventuelle skadevirkninger af pyrethroider som stofgruppe på baggrund af studier af ét modelpyrethroid. Betydningen af pulseksponeringens varighed for adfærdsresponset blev undersøgt med henblik på fastlæggelse af modelpulsvarigheden. Da der i de planlagte laboratorieforsøg ville blive anvendt forskellige vandtemperaturer, og da der forventeligt ville være visse temperatursvingninger i strømrendeforsøgene, blev temperaturens indvirkning på adfærdsresponset hos G. pulex undersøgt i det temperaturinterval, som forventedes anvendt, d.v.s. ca. 5-15 °C. Endelig blev et mindre forsøg gennemført med G. pulex eksponeret for modelpyrethroidet i kombination med et af de hyppigst forekommende pesticider i vandløb, glyphosat, for at vurdere, hvorvidt denne samtidige tilstedeværelse ændrede adfærdsresponset.

Efter valget af modelpyrethroid og modelpulsvarighed blev eksponeringsforsøg med krebsdyrene G. pulex og A. aquaticus, slørvingen L. nigra, døgnfluen H. sulphurea, vårfluen S. personatum og sneglen A. fluviatilis gennemført for at øge vidensgrundlaget for vurderingen af effekter på vandløbsinvertebrater. Med henblik på at opnå større indsigt i mulige langtidsvirkninger af kortvarige pulseksponeringer blev restitueringsforsøg af tre ugers varighed gennemført med G. pulex og A. aquaticus. Mulige effekter af pyrethroider på interspecifikke interaktioner blev undersøgt ved et studie af rovdyr-byttedyrs-interaktionen mellem G. pulex (rovdyr) og L. nigra (byttedyr).

2.3.2 Forsøgsbetingelser

Opbevaring af dyr og udførelsen af forsøg foregik ved SDU i Biologisk Instituts akvarierum ved konstant temperatur med en fotoperiode på 12 timers lys og 12 timers mørke. Ved hjemkomst til akvarierummet blev dyrene, efter et døgns temperaturakklimering i gennemluftet åvand, overført til kunstigt ferskvand (ISO 6431 test water, OECD 2000) (Tabel 2.3). G. pulex og A. aquaticus blev herefter akklimeret i mindst en uge ved 15±1 °C inden forsøgsstart. For at minimere dødeligheden af de indsamlede forsøgsorganismer blev L. nigra, S. personatum og A. fluviatilis i stedet akklimeret i 1-3 dage ved 6±1 °C inden forsøgsstart, mens H. sulphurea blev akklimeret 1 dag ved 10±1 °C.

Tabel 2.3. Kunstigt ferskvand (ISO 6431 test water, OECD 2000)

2.3.3 Registrering af bevægelsesadfærd i laboratoriet

Et state-of-the-art videosporingssystem, EthoVision Pro (Noldus Information Technology, Holland) blev anvendt til kvantificering af bevægelsesadfærd. Hardware- og softwareopsætning samt adfærdsarena- og eksponeringsdesign er tidligere blevet optimeret i forbindelse med et pesticidforskningsprojekt (Nørum & Bjerregaard 2003) (Figur 2.1).

Figur 2.1. Videosporingssystemet (EthoVision Pro).

Med videosporingssystemet kvantificeres dyrenes bevægelsesmønstre ved vektorregning (Figur 2.2) og nedbrydes i en række adfærdsparametre. F.eks. er følgende adfærdsparametre blevet anvendt for Gammarus pulex i et tidligere projekt (Nørum & Bjerregaard 2003):

• tilbagelagt afstand
• gennemsnitshastighed i bevægelse
• andel af henholdsvis svømmeadfærd, kravleadfærd og inaktivitet
• gennemsnitlig varighed af en svømmebevægelse
• antal svømmebevægelser

Figur 2.2. Kvantificering af bevægelsesadfærd ved vektorregning.

Den faktiske bevægelsesadfærd (øverst) estimeres ved vektoregning (nederst) baseret på rådatafiler indeholdende information om ændringer i objektets x,y-koordinater over tid.

En lang række yderligere adfærdsparametre kan beregnes v.hj.a. videosporingssystemets software. I nærværende projekt præsenteres kun resultater for parameteren ”tilbagelagt afstand”, da det er det mest integrerede og lettest fortolkelige respons til sammenligning af arternes relative følsomhed over for pyrethroideksponering.

2.3.4 Generelt forsøgsdesign

Designet af et typisk forsøg er følgende: Dyrene akklimeres natten over i glaspetriskåle (diameter: 9 cm) indeholdende 80 ml kunstigt ferskvand. Alle 16 dyrs baggrundsadfærd registreres derefter i en kontrolperiode (enten 30 eller 90 minutter) i vand, der ikke er tilsat pyrethroid. Dernæst afbrydes videosporingen midlertidigt. Det udvalgte pyrethroid, opløst i ethanol + vand (20 ml), tilføres 8 af petriskålene (den eksponerede gruppe). De resterende 8 petriskåle (kontrolgruppen) tilføres tilsvarende mængde ethanol + vand. Det anvendte volumen på 20 ml er tilstrækkeligt til at sikre fuldstændig opblanding i petriskålene. Tilsætningen af væsken foretages længst muligt fra dyrets position, og videosporingen genoptages 2 minutter efter afbrydelsen. Kontrolgruppens og den eksponerede gruppes adfærd følges derefter i endnu en periode (typisk 90 minutter), hvorefter forsøget afsluttes, og en poolet vandprøve (ca. 700 ml) med vand fra den eksponerede gruppes 8 petriskåle indsamles til bestemmelse af aktuelle koncentrationer. Den endelige koncentration af ethanol var 100 µl/l, hvilket ikke overstiger grænserne for opløsningsmidler i OECD Test Guidelines for dafnietest (OECD 2000).

2.3.5 Relativ toksicitet af pyrethroider anvendt i Danmark

Den relative toksicitet af fem pyrethroider (alpha-cypermethrin, cypermethrin, lambda-cyhalothrin, tau-fluvalinat og esfenvalerat) blev undersøgt ved at registrere adfærdsresponset hos eksponerede G. pulex ved 4 forskellige koncentrationer (1, 10, 100 og 1000 ng/l). Eksponeringen varede 90 minutter. Baseret på de opnåede resultater blev lambda-cyhalothrin udvalgt som modelpyrethroid til de efterfølgende studier. Forsøgene blev udført ved 15±1 °C.

2.3.6 Pulsvarighedens betydning

Betydningen af pulseksponeringens varighed for adfærdsresponset blev fastlagt ved eksponering af G. pulex for 4 lambda-cyhalothrin-koncentrationer (1, 10, 100 og 1000 ng/l) med en varighed på op til 5 timer. Baseret på de opnåede resultater er en modelpulsvarighed på 90 minutter blevet valgt. Forsøgene blev udført ved 15±1 °C.

2.3.7 Temperaturens betydning

En undersøgelse af temperaturens indflydelse på toksiciteten blev gennemført ved eksponering af G. pulex for 2 lambda-cyhalothrin-koncentrationer (10 og 100 ng/l) ved 3 temperaturer (5, 10 og 15 °C). Eksponeringen varede 90 minutter.

2.3.8 Pesticidblanding

Effekten af samtidig eksponering for lambda-cyhalothrin og glyphosat hos G. pulex blev undersøgt. Glyphosat blev valgt, da det hyppigt forefindes i danske vandløb. Indledningsvis blev G. pulex eksponeret for glyphosat ved 3 koncentrationer (100, 1000 og 10000 ng/l). Dernæst blev G. pulex eksponeret for lambda-cyhalothrin ved 4 koncentrationer (1, 10, 100 og 1000 ng/l) i kombination med glyphosat (1000 ng/l). Eksponeringen varede 90 minutter. Forsøgene blev udført ved 15±1 °C.

2.3.9 Koncentrations-respons-forsøg med udvalgte arter

Lambda-cyhalothrins akutte effekt på de valgte arter af forsøgsorganismer blev undersøgt ved 5 koncentrationer (0,1-10000 ng/l afhængig af arten, se Tabel 2.6) med henblik på beskrivelse af koncentrations-respons-sammenhænge ved miljørealistiske eksponeringsniveauer. Eksponeringen varede 90 minutter. Forsøgene blev udført ved 10±1 °C, da visse af de anvendte arter forventeligt ville have en dårlig overlevelse ved 15 °C. Da vandtemperaturen kunne tænkes at påvirke lambda-cyhalothrins toksicitet, blev alle invertebraterne testet ved samme temperatur for at sikre sammenligneligheden m.h.t. toksicitetsvurderingen.

2.3.10 Restitueringsforsøg

Restitueringsforsøg er blevet gennemført med G. pulex og A. aquaticus ved 3 lambda-cyhalothrin-koncentrationer (10, 100 og 1000 ng/l) for at vurdere dyrenes evne til at komme sig efter en pulseksponering. Grupper af forsøgsdyr (30 stk fordelt i tre glaspetriskåle med 250 ml vand) blev eksponeret for lambda-cyhalothrin i enten 1½ eller 4½ time i kunstigt ferskvand. Dernæst blev de skyllet forsigtigt, men grundigt, i rindende hanevand, inden de blev overført til ukontamineret kunstigt ferskvand. Overlevelsen og graden af immobilisering blev herefter fulgt i en 21-dages restitueringsperiode, idet hvert individ ved visuel observation blev registreret som værende død, immobil eller aktiv. Døde dyr blev fjernet løbende. Ved restitueringsperiodens udløb blev overlevende, aktive individer videosporet. Forsøgene blev udført ved 15±1 °C.

2.3.11 Rovdyr-byttedyrs-interaktion

Effekten af lambda-cyhalothrin på rovdyr-byttedyrs-interaktionen mellem G. pulex og L. nigra blev undersøgt ved 3 koncentrationer (1, 10 og 100 ng/l). I dette forsøg blev G. pulex akklimeret natten over i glaspetriskålene, mens L. nigra blev akklimeret som samlet gruppe i ét akvarie natten over. Eksponeringen foregik på følgende måde: umiddelbart efter tilsætningen af lambda-cyhalothrin til en petriskål med en G. pulex blev et mindre plastikrør (diameter: 2,7 cm) placeret midt i petriskålen (diameter: 9 cm), og en L. nigra blev overført til røret. Videosporingen blev påbegyndt, og dyrene blev indledningsvis eksponeret i 30 minutter, mens de blev holdt adskilt. Herefter blev plastikrøret fjernet, og interaktionen mellem G. pulex og L. nigra blev fulgt i yderligere 60 minutter under fortsat eksponering. I alt blev følgende antal par observeret: Kontrolgruppe: n=24, 1 ng/l: n=25, 10 ng/l: n=18, 100 ng/l: n=16. Da eventuelle ændringer i rovdyrsadfærden hos G. pulex kunne skyldes, at eksponerede L. nigra ikke var spiselige for G. pulex, blev endnu en forsøgsrække gennemført: L. nigra blev her eksponeret separat for 100 ng/l i 30 minutter, inden de blev overført til ukontamineret vand i plastikrørene, mens G. pulex ikke blev eksponeret. Herefter blev plastikrøret fjernet, og interaktionen mellem G. pulex og L. nigra blev fulgt i 60 minutter. I alt blev 9 par observeret. Forsøgene blev udført ved 15±1 °C. Denne temperatur er i overensstemmelse med den, som generelt blev anvendt til forsøg med G. pulex. For L. nigra’s vedkommende blev en temperatur på 10±1 °C anvendt i ovennævnte koncentrations-respons-forsøg med udvalgte arter. Der var ingen observerbare ændringer i L. nigra’s adfærd i rent vand ved 15±1 °C.

2.3.12 Statistisk metode

Resultater fra videosporingsforsøgene blev primært evalueret ved repeated measures ANOVA. Regressionsanalyse blev anvendt i restitueringsforsøget og i studiet af rovdyr-byttedyrs-interaktionen. Den statistiske analyse blev foretaget ved hjælp af SAS^®. I alle tilfælde blev et signifikansniveau på a=0,05 anvendt.

2.4 Drift i strømrender

2.4.1 Overordnet forsøgsstrategi

Der blev gennemført to typer af eksperimenter i strømrender: Drift og flerarts-studier. I drifteksperimenter blev det umiddelbare driftrespons hos vandløbsinvertebrater undersøgt under og efter pulseksponering med lambda-cyhalothrin i semi-naturlige vandløbsrender. Undersøgelserne inkluderede krebsdyret G. pulex, slørvingen L. nigra, døgnfluen H. sulphurea, sneglen A. fluviatilis og vårfluen S. personatum. Vandløbsinvertebraterne blev eksponeret for lambda-cyhalothrin i 90 minutter, hvorefter driften fortsat blev registreret indtil 150 minutter fra eksponeringens start. Der blev målt drift 60 min før eksponering, ved start af eksponeringen og herefter hver 30. minut, i alt 7 gange per forsøgsserie (-60, 0, 30, 60, 90, 120 og 150 minutter). Vandløbsinvertebraterne blev eksponeret for 2 eller 4 koncentrationer af lambda-cyhalohtrin afhængig af arten. Alle eksperimenter med undtagelse af et enkelt med G. pulex blev gennemført om dagen. Eftersom langt de fleste vandløbsinvertebrater udviser størst drift om natten, blev der ligeledes gennemført et forsøg om natten for at undersøge om organismernes, her G. pulex, højere aktivitetsniveau og tilbøjelighed til at gå i drift om natten påvirkede deres driftrespons ved lambda-cyhalothrin-eksponering.

Eksperimenterne med samspil, eller interaktioner, mellem organismerne blev udført i såvel laboratoriet som i strømrenderne. Det samspil, der blev undersøgt, var rovdyr-byttedyrsadfærd. I laboratoriet blev prædations-effektiviteten af krebsdyret G. pulex på slørvingen L. nigra undersøgt ved forskellige koncentrationer af lambda-cyhalothrin. G. pulex ernærer sig primært som detritivor men kan også fungere som et effektivt rovdyr. I strømrender blev det undersøgt, hvorledes duftstoffer fra ørred (Salmo trutta) påvirker G. pulex’s driftadfærd ved forskellige koncentrationer af lambda-cyhalothrin. Det vides fra tidligere undersøgelser, at individer af G. pulex nedsætter deres driftaktivitet, når der er duftstoffer fra ørreder tilstede i vandet (Friberg et al., 1994). Dette er en antiprædator adfærd, der har til formål at reducere sandsynligheden for, at det enkelte individ bliver spist, da ørreder primært indtager deres føde fra driften. Samtidig er det kendt fra tidligere undersøgelser, at G. pulex øger deres driftaktivitet, når de bliver eksponeret for lambda-cyhalothrin (Lauridsen & Friberg, 2005). Ved at tilsætte ørred-duftstoffer til vand, der blev tilledt renderne, kunne det undersøges, hvilke af disse to modsatrettede adfærdsstimuli, der dominerer, og dermed sandsynliggøres om eksponering med lambda-cyhalothrin øger prædationsrisikoen i vandløb.

I flerarts-eksperimenterne blev de længerevarende effekter af eksponering med lambda-cyhalothrin undersøgt med hensyn til direkte og indirekte effekter. Undersøgelsen inkluderede krebsdyret G. pulex, slørvingen L. nigra, døgnfluen H. sulphurea, og sneglen A. fluviatilis udsat i de samme strømrender efter eksponering for to koncentrationer af lambda-cyhalothrin. Eksponering (90 minutter) foregik i laboratoriet dagen før eksperimentets start for at undgå det umiddelbare tab i drift. Forsøget forløb i 10 dage med daglig måling af drift. Derudover blev omsætning af organisk stof og algebiomassen målt for at få indblik i indirekte effekter af pyrethroideksponeringen.

2.4.2 Strømrender

Undersøgelserne blev udført på DMU’s udendørs vandløbsrende-faciliteter i Lemming, 8 km nord for Silkeborg. Systemet består af 12 vandløbsrender som konstant fødes med frisk grundvand, der hele året har en temperatur på 7-8 °C (Figur 2.3). Inden vandet ledes i renderne, føres det ned af en iltningstrappe og gennem et trykfilter, hvor bl.a. partikler og jern bindes (se Tabel 2.4). Fra trykfiltret føres vandet til en fødekasse (50x70x60cm), hvorfra det, via et rørsystem, fordeles ligeligt til alle 12 render, så de har en konstant vandføring på 3,2 l min^-1. De 12 vandløbsrender er fire meter lange og 10 cm brede. Faldet på vandløbsrenderne er indstillet til 1%, hvilket svarer til et naturligt fald på strygsekvenser i mindre danske vandløb. Substratet i vandløbsrenderne er udlagt således, at det imiterer en strygsekvens i et mindre dansk vandløb med grus og sten samt bladpakker i partierne med strømlæ (Figur 2.4). Ved den anvendte substratfordeling er vandets gennemsnitlige opholdstid i renderne 58,2 ± 1,3 sekunder og den gennemsnitlige strømhastighed 0,064 m sek^-1 (Tabel 2.4). Terminalt i hver vandløbsrende falder/løber hele vandføringen gennem et driftnet (maskevidde 1 mm) som opfanger alle invertebrater større end 1 mm, der føres med strømmen.

Figur 2.3. Foto af forsøgsopstillingen med de 12 vandløbsrender. Driftnettene er placeret i de lodrette nedløbsrør forrest i billedet.

Tabel 2.4: Fysiske og kemiske parametre for vandet i strømrenderne

Såvel vandløbsrenderne som sedimentet i vandløbsrenderne blev udskiftet mellem alle forsøgsserier, således at hver forsøgsserie indledtes med at etablere sedimentet. Først blev hver vandløbsrende tilført 4,5 kg småsten (1-3 cm) fordelt jævnt på en 3 meter lang strækning. Småstenene var forinden konditioneret 7 dage i vandløbsvand for at skabe en naturlig biofilm på substratet. Efter fordelingen af gruset blev der udlagt knytnævestore sten for hver 30. centimeter. Disse sten blev indsamlet samme dag som etableringen af vandløbsrenderne i Hulbæk, et lille vandløb 5 km øst for Silkeborg. Inden stenene blev udlagt i vandløbsrenderne, blev de renset for dyr og skidt. Efter udlægningen af sten blev der i strømlæet bag hver sten placeret 2 elleblade (Alnus glutinósa (L)), som forinden var konditioneret 5 dage i kildevand ved 10°C. Efter udlægningen af elleblade blev en Stowaway Tidbit temperatur logger placeret i nedstrømsenden af substratsstrækningerne.

Figur 2.4. Foto af de 3 meter lange substrat-strækninger bestående af grus, sten og elleblade.

2.4.3 Dosering af lambda-cyhalothrin i strømrenderne

Lambda-cyhalothrinopløsningerne blev fremstillet ved at opløse en given mængde stof i 100 ml ethanol (96%). Ud fra denne stamopløsning blev der fremstillet en fortyndingsrække med ethanol til de ønskede koncentrationer. Opløsningerne blev fremstillet således, at der skulle tilsættes 10 ml opløsning til 1 L demineraliseret vand for at opnå de ønskede koncentrationer.

Lambda-cyhalothrin blev doseret med 10 ml min^-1 til enkelte render ved hjælp af en peristaltisk pumpe (Ole Dich Type 110 med 12 kanaler). For hvert eksperiment blev den aktuelle vandføring målt i renderne for at beregne, hvor stort et volumen af pesticidopløsning, der skulle doseres til den enkelte rende. Fra hvert eksperiment blev der udtaget vandprøver til pesticidanalyse.

2.4.4 Drifteksperimenter

Drifteksperimenterne blev gennemført i strømrender om dagen med undtagelse af et enkelt forsøg med G. pulex, der blev udført om natten. Alle forsøgsdyr blev introduceret til renderne dagen før eksperimenterne. Om morgenen før eksperimentet blev dyrene, der var driftet ud om natten, erstattet. Inden eksponeringsstart blev der yderligere målt drift i 60 minutter for at sikre, at driften var stabiliseret. Var driften i denne periode meget høj, blev forsøget ikke gennemført.

2.4.5 Flerarts-forsøg

Eksperimentet med effekter på flere arter sammen blev gennemført i april 2005 i perioden fra 11.-21. april. Renderne blev 3 dage før eksperimentets start forsynet med substrat bestående af småsten (1-3 cm i diameter) samt knytnævestore sten. Småstenene blev fordelt jævnt på en strækning på 2,5 meter i hver rende. Småstenene var forinden blevet konditioneret i en måned i næringsrigt vand fra Lemming Å. Småstenene blev her fordelt i et tyndt lag i plastikkar og opbevaret i et klimarum (14 ºC) på DMU’s faciliteter i Silkeborg. Over karrene blev der ophængt UV-lamper, der gav konstant belysning i konditioneringsperioden. Konditioneringen af småstenene skulle sikre etableringen af en naturlig biofilm på stenene. 21 af stenene blev taget fra til måling af baggrundsniveauet i algebiomasse. De knytnævestore sten blev hentet i et mindre unavngivet vandløb ved Sdr. Vissing samme dag som etableringen af renderne. Inden udlægninen blev de vasket rene for snavs og dyr. Der blev placeret 7 sten pr. rende med 25 cm mellemrum. Stenene nummereredes 1-7, startende længst opstrøms. Ved den anvendte substratfordeling var vandets gennemsnitlige opholdstid i renderne 51,6 ± 2,7 sekunder og den gennemsnitlige strømhastighed 0,068 ± 0,003 m sek-1.

Der blev placeret fem bladpakker i hver rende foran de knytnæve store sten (nr. 2-6). Hver bladpakke bestod af 10 bøgeblade (Fagus sylvatica). Bladene blev indsamlet i et lille unavngivet skovvandløb i Velling skov og var således allerede konditioneret inden forsøget. Bladene blev forsynet med en snor, der holdt dem sammen i pakker, og snoren blev fæstnet under de knytnævestore sten, således at bladpakkens placering var sikret under hele forsøget. Bladpakkerne blev placeret samtidig med etableringen af vandløbsrenderne dvs. 3 dage inden forsøget start. Forinden var bladpakkerne blevet vådvejet og 15 blade desuden taget fra til referencemålinger. De fem bladpakker i hver rende blev benævnt A-E i nedstrøms retning. Efter etableringen af vandløbsrenderne blev en Stowaway Tidbit temperatur logger placeret i nedstrømsenden af substratstrækningerne, og temperaturfluktuationerne blev målt i 24 timer (Tabel 2.4).

Lambda-cyhalothrin stamopløsningen blev blandet i 1 L kildevand i plastikkar, og dyrene blev nedsænket heri umiddelbart efter. Dyrene til kontrolforsøget blev nedsænket i kar med den tilsvarende mængde ethanol som blev benyttet i opløsningen med den højeste koncentration. Eksponeringen foregik i klimarum (4 ºC), og karrene med dyr blev beluftet under hele forløbet. De nominelle koncentrationer af lambda-cyhalothrin var 10 og 100 ng l^-1. Eksponeringen fandt sted dagen før forsøgets start (d. 9/4-05) og varede 90 minutter. Efter eksponering blev dyrene overflyttet til beluftede kar med rent kildevand i 24 timer. Karrene med G. pulex og L. nigra blev forsynet med bøgeblade, og karrene med H. sulphurea og A. fluviatilis blev forsynet med biofilmbelagte sten.

På forsøgets første dag blev dyrene introduceret i vandløbsrenderne umiddelbart opstrøms for sektionen med substrat. I hver rende blev der udsat 65 G. pulex, 45 L. nigra, 16 H. sulphurea samt 25 A. fluviatilis, hvilket gav de i Tabel 2.5 viste individtætheder. Disse individtætheder ligger indenfor, hvad der naturligt kan forekomme i danske vandløb (Iversen, 1988; Friberg et al. 1994; Friberg, 1997). Der var 4 replikater af hhv. kontrol og behandlingerne med 10 og 100 ng l^-1 lambda-cyhalothrin.

Tabel 2.5 Individtætheder i vandløbsrenderne

Igennem hele forsøgsperioden blev driftnettene tømt hver 24 timer, og alle levende individer blev reintroduceret til strømrenderne for at opretholde passende tætheder. Dette var nødvendigt, da renderne ikke er lange nok til, at invertebraterne kan have en naturlig bevægelsesadfærd i et længere tidsrum, herunder at opstrømsmigration ikke er mulig, når først dyrene er fanget i driftnettene. Såfremt invertebraterne ikke var blevet reintroduceret, ville de indirekte effekter på græsning og omsætning af organisk stof alene afspejle forskelle i tætheder i renderne og ikke påvirkningen fra eksponeringen med lambda-cyhalothrin. Ved tømning af hvert driftnet blev dyrene overført til en hvid fotobakke, hvor de blev talt op og deres tilstand vurderet på tre forskellige niveauer; upåvirket (velbevaret flugtrespons ved fysisk berøring), påvirket (hæmmet flugtrespons ved fysisk berøring) og døde. Desuden blev tre småsten sorteret fra i hver rende på 5., 8., og 10. forsøgsdag til klorofylanalyser. Efter den sidste tømning af driftnettene på 10. forsøgsdag blev alle bladpakkerne taget fra til vægtanalyser, og vandløbsrenderne blev tømt. Substratet blev konserveret i ethanol og blev senere grovsorteret under luplampe for at genfinde de tilbageværende dyr. Bladpakkerne blev efterfølgende tørret i 24 timer ved 60 ºC, hvorefter tørvægten blev bestemt. Herefter blev en kendt fraktion af hver bladpakke forasket ved 600 ºC i 24 timer, og den askefri tørvægt blev bestemt. Væksten af mikroalger på småstenene blev undersøgt ved klorofylekstrahering i et kendt volumen ethanol (96%) i 16 timer i mørke, hvorefter en kendt delprøve fra hver ekstrahering blev centrifugeret i 10 minutter ved 2000 omdr. min^-1 og målt i et spektrofotometer ved to forskellige bølgelængder (665 nm samt 750 nm). Klorofylindholdet af hver ekstrahering blev beregnet i forhold til hver småstens projicerede areal. Det projicerede areal blev bestemt ved at tegne et omrids af den enkelte sten på papir, hvorefter arealet blev bestemt ved vejning.

2.4.6 Statistisk metode

Alle statistiske analyser er foretaget indenfor en enkelt forsøgsserie bestående af kontrol og to behandlinger. Der er ikke foretaget analyser mellem forsøgsserierne, da de blev gennemført på forskellige tidspunkter i projektperioden og derfor ikke er direkte sammenlignelige. De statistiske metoder, som er blevet anvendt til analyse af data fra strømrenderne (både enkeltarts- og flerarts-forsøgene) i nærværende projekt, er primært traditionel ANOVA samt repeated measures ANOVA, idet de forskellige responsvariable observeres henover tiden for de samme render. Variansanalysen har ligeledes indeholdt parvise sammenligninger med fokus på sammenligninger til kontrolgruppen. Parvise sammenligninger blev gennemført ved brug af en Bonferroni-korrigeret t-test. Yderligere uddybning af den statistiske metode er angivet i Bilag A. De statistiske analyser blev foretaget ved brug af SAS^®. For at lette læsbarheden af resultatafsnittet er F- samt t-værdier angivet i tabeller, mens p-værdierne er angivet i selve teksten.

2.5 Oversigt over udførte forsøg

Tabel 2.6 Oversigt over udførte forsøg

2.6 Pesticidvalg

Valget af pyrethroider var primært baseret på Bekæmpelsesmiddelstatistikken for 2002 (Miljøstyrelsen 2003), hvoraf det fremgik, at pyrethroider blev anvendt til sprøjtning af 80% af alle insekticidbehandlede arealer. Pyrethroiderne udgjorde 4 ud af 9 anvendte insekticider; nemlig alpha-cypermethrin, cypermethrin, lambda-cyhalothrin og tau-fluvalinat, der hver blev sprøjtet på ca. 100.000 ha. Laboratorieforsøg med disse pyrethroider blev gennemført. Endvidere blev det i 2002 forbudte pyrethroid, esfenvalerat, anvendt. Esfenvalerat ønskedes undersøgt, da der under forsøg udført i forbindelse med et tidligere pesticidforskningsprojekt var opnået resultater, der detaljeret beskriver det adfærdstoksikologiske respons bl.a. hos esfenvalerat-eksponerede G. pulex og A. aquaticus (Nørum & Bjerregaard 2003). Endelig foreligger der en række målinger af esfenvalerat-koncentrationer i danske vandløb. Esfenvalerat tænktes derfor anvendt som reference-pyrethroid. De fem valgte pyrethroider er syntetiske insekticider, der virker agonistisk på spændingsafhængige natriumkanaler i nervesystemet hos både target og non-target organismer. Til pesticidkombinationsforsøget blev glyphosat anvendt, da det er hyppigt forekommende i danske vandløb.

Alpha-cypermethrin

CAS Nummer:    67375-30-8

Navn:                      (R,S)-alpha-cyano-3-phenoxybenzyl(1-R,S)-cis-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropancarboxylat

Molekylærformel:    C₂₂H₁₉Cl₂NO₃

Molvægt:                 416,31

Cypermethrin

CAS Nummer:    52315-07-8

Navn:                      (R,S)-alpha-cyano-3-phenoxybenzyl(1-R,S)-cis,trans-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropancarboxylat

Molekylærformel:    C₂₂H₁₉Cl₂NO₃

Molvægt:                 416,31

Lambda-cyhalothrin

CAS Nummer:    91465-08-6

Navn:                      (RS)-alpha-cyano-3-phenoxybenzyl 3-(2-chloro-3,3,3-trifluoropropenyl)-2,2-dimethylcyclopropancarboxylat

Molekylærformel:    C₂₃H₁₉Cl F₃NO₃

Molvægt:                 449,86

Tau-fluvalinat

CAS Nummer:    102851-06-9

Navn:                      (RS)-alpha-cyano-3-phenoxybenzyl N-(2-chloro-a,a,a-trifluoro-p-tolyl)-D-valinat

Molekylærformel:    C₂₆H₂₂Cl F₃ N₂O₃

Molvægt:                 502,92

Esfenvalerat

CAS Nummer:    66230-04-4

Navn:                      (S)-alpha-cyano-3-phenoxybenzyl(S)-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyrat

Molekylærformel:    C₂₅H₂₂ClNO₃

Molvægt:                 419,91

Glyphosat

CAS Nummer:    1071-83-6

Navn:                      N-phosphomethylglycin

Molekylærformel:    C₃H₈NO₅P

Molvægt:                 169,07

2.7 Kvantificering af lambda-cyhalothrin

2.7.1 Metodebeskrivelse

For at opnå realistiske koncentrations-respons-sammenhænge mellem pyrethroidkoncentration og indvirkning på bevægelses- og driftadfærd er de reelle koncentrationer af lambda-cyhalothrin blevet bestemt i såvel laboratorie- som strømrendeeksponeringssystemerne. Metoden bygger på erfaringer fra et tidligere pesticidforskningsprojekt (Nørum & Bjerregaard 2003), hvor metoder til bestemmelse af bl.a. pyrethroiderne cypermethrin og esfenvalerat blev udviklet. Metodens princip er baseret på fastfaseekstraktion af pesticidkontamineret ferskvand efterfulgt af opkoncentrering ved inddampning, samt kvantificering ved omvendt fase HPLC-MS. Metoden er baseret på vandprøver med et volumen på 100-1000 ml.

2.7.1.1 Forbehandling af vandprøver

Umiddelbart efter opsamling af afmålt vandprøve indeholdende lamdba-cyhalothrin tilsættes en kendt mængde intern standard (esfenvalerat).

2.7.1.2 Fastfaseekstraktion

Ekstraktion af lambda-cyhalothrin fra vandprøven foretages på en C18-søjle (Sep Pak Vac, 6 cc, 1 g, C18 cartridges, fra Waters). Søjlen konditioneres med 5 ml methanol og vaskes med 5 ml Milli-Q vand. Prøven påsættes søjlen ved 20 kPa vacuum, svarende til ca. 3 ml/min. Dernæst vaskes søjlen med 5 ml Milli-Q vand og tørres i 1-2 minutter ved 30-40 kPa vacuum. Pesticidet elueres med 4 ml methanol. Eluatet inddampes efterfølgende til tørhed under luftstrøm og genopløses i 0,300 ml 75% methanol.

2.7.1.3 LC-MS analyse

Det anvendte Hewlett Packard LC-MSD-system består af en HP Series 1100 HPLC (solvent degasser, binær pumpe, autosampler og termostatreguleret kolonneafdeling) og et G1946A MSD quadropole massespektrometer udstyret med electrospray ionisation (ESI) i positiv mode. Til kvantificeringen anvendes en HPLC-kolonne (C18, 150×2,1 mm, Phenomenex fra Subware) med forkolonne af samme materiale. Der anvendes et væskeflow på 0,4 ml/min, en injection af 50 µl prøve, og en kolonnetemperatur på 25 °C. Følgende LC solventer blev brugt: Eluent A: 10 mM ammoniumacetat:methanol, 990:10 (v:v). Eluent B: 10 mM ammoniumacetat:methanol, 10:90 (v:v). Der elueres med følgende gradient (Tid, % B): (0 min, 75%); (3 min, 100%); (14 min, 100%); (14,1 min, 75%); postrun-tid: 6 min, 25% B. Massespektrometer-opsætning: Mode: ESI positiv (SIM: m/z 467 for lambda-cyhalothrin). Der benyttes intern standardisering med esfenvalerat (SIM: m/z 437). Drying gas temperature: 350 °C. Drying gas flow: 10 l/min. Nebulizer pressure: 30 psig. Capillary voltage: 3500 V. Fragmentor: 50 V. Standardkurven beregnes udfra standarderne: 0,7; 3,5; 35,0; 70,0 og 350 ng/ml injiceret standard. Lambda-cyhalothrin og esfenvalerat elueres efter henholdsvis 7,4 min og 8,0 min.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 September 2006, © Miljøstyrelsen.