Evaluation of in vitro assays for determination of estrogenic activity in the environment

Evaluation of in vitro assays for determination of estrogenic activity in the environment

2 Resumé (dansk)

Det er igennem de seneste år konstateret, ved undersøgelser i en række forskellige lande, at der i nogle tilfælde kan registreres østrogen aktivitet i det akvatiske miljø, der er i stand til at påvirke faunaen.
(Xeno)østrogener menes at ende i det akvatiske miljø primært via kommunalt og industrielt spildevand. Desuden kan drænvand fra marker være en yderligere kilde til (xeno)østrogener i det akvatiske miljø.
En vifte af naturlige og menneskeskabte stoffer vides at besidde østrogen aktivitet. I det akvatiske miljø er den østrogene aktivitet primært blevet tilskrevet de naturlige østrogener, 17b-østradiol (E2), østron (E1) og østriol (E3), og det syntetiske østrogen, ethinyløstradiol (EE2), der anvendes i p-piller. Desuden kan xenoøstrogener som alkylfenoler og bisfenol A i mindre grad også bidrage til den østrogene aktivitet i det akvatiske miljø.
In vitro assays måler den totale østrogene aktivitet i en vandprøve fra miljøet uanset hvilke stoffer, der er ansvarlige for aktiviteten. Den totale østrogene aktivitet i en prøve sammenlignes så med aktiviteten af det naturlige østrogen, E2, og udtrykkes som østradiolækvivalenter (EEQ). En række studier, hvor der har været anvendt in vitro assays, har demonstreret østrogen aktivitet i spildevand og overfladevand i forskellige lande. Den totale østrogene aktivitet (udtrykt som EEQ-værdier) målt i urenset spildevand er 0,6-153 nanogram pr. liter. I renset spildevand er EEQ-værdierne som regel under 25 nanogram pr. liter. Der er dog i USA målt værdier helt op til omkring 150 nanogram pr. liter. I overfladevand er der generelt fundet EEQ-værdier fra under 1 nanogram pr. liter og op til 15 nanogram pr. liter. Der er dog i én undersøgelse fundet værdier på op til omkring 80 nanogram pr. liter. De EEQ-niveauer, der er fundet i nogle akvatiske systemer, er høje nok til at inducere østrogene effekter i laboratorieforsøg med fisk.

Adskillige in vitro assays er blevet udviklet til at måle den østrogene aktivitet af enkeltstoffer eller komplekse blandinger. Hvert assay måler forskellige endpoints på forskellige niveauer af den biologiske kompleksitet af østrogen virkning. De fleste assays tilhører én af tre kategorier: 1) østrogenreceptor-bindingassays som måler et stofs bindingsaffinitet for østrogenreceptoren; 2) celledelingsassays som måler stigningen i antallet af østrogensensitive celler (E-screen), og 3) reportergenassays som måler østrogenreceptorafhængig transkriptionel og translationel aktivitet. Intet enkelt in vitro assay kan anses som ideelt for vurdering af den østrogene aktivitet i spildevand og overfladevand. De har alle deres fordele og begrænsninger.

De fleste østrogenreceptorbindingsassays kvantificerer et teststofs evne til at konkurrere med radioaktivt mærket E2 om binding til østrogenreceptoren. Prøven tilsættes sammen med en overskud af radioaktivt mærket E2 til isolerede østrogenreceptorer, hvorefter mængden af ubunden radioaktivitet måles. Østrogenreceptorbindingsassay s er hurtige, men er betydeligt mindre følsomme end de andre in vitro assays. Desuden er de vanskelige at automatisere og har derfor begrænset anvendelighed som screeningsværktøj. Yderligere kræver østrogenreceptorbindingsassays specialiserede laboratoriefaciliteter på grund af de radioaktive stoffer. Endelig giver bindingen af et stof til østrogenreceptoren kun en indikation af, at stoffet måske har østrogen virkning. Østrogenreceptorbinding medfører ikke nødvendigvis de efterfølgende komplekse reaktioner, der er involveret i østrogen virkning.

I E-screen assayet måles delingen af humane MCF-7 brystkræftceller som svar på østrogen. E-screen assayet er baseret på følgende tre forudsætninger: faktorer i (i)serum tilsat dyrkningsmediet hæmmer delingen af MCF-7 celler, (ii)østrogener inducerer celledeling ved af ophæve denne hæmmende effekt, og (iii) ikke-østrogene stoffer ophæver ikke det hæmmende signal der er til stede i serum. Det har dog vist sig, at E-screen assayet måske ikke er så østrogenspecifikt som antaget, da en række ikke-østrogene stoffer har vist sig at influere på celledelingen i MCF-7 celler, i hvert fald hos nogle cellelinier. Desuden er der observeret betydelige forskelle i resultater opnået med E-screen i forskellige laboratorier. Endelig er E-screen assayet mere langsommeligt end de andre assays og må derfor betragtes som upraktisk for ekstensive moniteringsstudier.

Reportergenassays er baseret på et stofs evne til at stimulere østrogenreceptorafhængig transkriptionel aktivitet. Reportergenassays gør brug af genmanipulerede humane cancerceller eller gærceller transfekteret med østrogenresponselementer forbundet med et reportergen. I de humant-baserede reportergenassays (ER-CALUX, MVLN celle assay og chimerisk receptor/reportergenassays) koder reportergenet for luciferase og i det gær-baserede reportergenassay (YES) koder reportergenet for b-galactosidase. Gærceller er yderligere transfekteret med DNA-sekvensen for den humane østrogenreceptor, da gærceller ikke besidder endogene østrogenreceptorer. I reportergenassays tilsættes prøven til de transfekterede celler. De østrogene stoffer i prøven binder til østrogenreceptoren, som aktiveres og binder til østrogenresponselementerne. Denne binding initierer ekspressionen af reportergenet og derved syntesen af enzymet. Et passende substrat i inkuberingsmediet metaboliseres af det nyligt syntetiserede enzym, hvilket resulterer i dannelsen af et nemt målbart produkt.
De pattedyr-baserede reportergenassays har den store ulempe sammenlignet med det gær-baserede assay, at pattedyrceller er vanskeligere og dyrere at dyrke. Desuden er de mere sårbare over for cytotoksiske effekter. En anden fordel ved YES-assayet er, at det er en mere simpel metode, der ikke kræver cellelysis, da produktet fra reportergenet frigives til mediet. Ved sammenligning af YES-assayet med de pattedyr-baserede reportergenassays ses dog klare forskelle i respons på (xeno)østrogener og anti-østrogener. For det første er der forskelle i følsomheden mellem de to pattedyr-baserede endogen receptor/reportergenassays (ER-CALUX og MVLN celle assay ) og YES-assayet, hvilket afspejler sig i, at de førstnævnte kan detektere lavere koncentrationer af (xeno)østrogener. For det andet ses forskelle på responset på anti-østrogener hos pattedyr-baserede reportergenassays og YES-assayet, idet det sidstnævnte ikke altid kan bestemme anti-østrogen aktivitet, men af og til registrerer denne som agonistisk. Denne ”begrænsning”, som YES-assayet har tilfælles med østrogenreceptorbindingsassays, kan betragtes som en fordel, hvis dét, man er interesseret i, er at registrere stoffer som interagerer med østrogenreceptoren og udviser er respons og således har potentielle hormonforstyrrende effekter. Ud fra dette synspunkt kan pattedyr-baserede reportergenassays faktisk underestimere det østrogene potentiale i en kompleks vandprøve.
Et vigtigt problem ved anvendelsen af in vitro assays til at teste prøver fra det akvatiske miljø er tilstedeværelsen af hæmmende/cytotoksiske stoffer. Gær-assays er muligvis bedre til monitering af prøver fra miljøet, da disse prøver ofte er kontaminerede med andre stoffer, der interfererer med væksten og levedygtigheden af dyreceller men ikke gærceller.
Reportergenassays synes at være et passende valg for monitering af østrogen aktivitet i forskellige miljømatricer. Det endelige valg af hvilket reportergeneassay der skal benyttes (pattedyr-baseret eller gær-baseret) afhænger af vigtigheden af en lavere detektionsgrænse holdt op imod vigtigheden af simpel udførelse og lavere omkostninger.

Betydelige fordele ved in vitro assays i forhold til kemiske analyser er, at ingen ukendte stoffer med østrogen aktivitet overses, og at der tages hensyn til kombinationseffekter i analysen. Kemisk analyse af alle stoffer med potentiel østrogen aktivitet ville være meget dyrt og ukendte østrogene stoffer, inklusive metabolitter, kan stadig være til stede i prøver fra miljøet. Ved en kombination af de to typer af analyse, kan man både få et mål for den østrogene aktivitet i en prøve, samt (til dels) identificere og kvantificere de stoffer, der er årsag til den østrogene aktivitet.

Fordelene ved in vitro assays frem for in vivo assays er blandt andet lavere omkostninger og tidsforbrug såvel som at man undgår brug af forsøgsdyr. In vitro assays er dog ikke altid pålidelige i deres forudsigelser for udfaldet i in vivo assays og bør aldrig bruges alene ved vurdering at potentielt skadelige østrogene effekter i det akvatiske system. In vitro assays besidder som regel minimale metaboliske evner. Som et resultat heraf kan ekstrapolering fra in vitro til in vivo systemer føre til falske negative resultater for stoffer, der bioaktiveres, og overestimeringer for stoffer, der hurtigt nedbrydes in vivo. Desuden afspejler in vitro assays ikke biotilgængelighed, interaktion mellem biologiske systemer og de komplekse processer som optagelse, binding til proteiner, transport, fordeling og udskillelse af stoffer, som spiller en rolle in vivo. Ydermere skal man være opmærksom på, at der eksisterer østrogene effekter, som er baserede på andre mekanismer end receptorbinding, f.eks. interferenser med hormonsyntese og -metabolisme. Prøver fra miljøet bør derfor også testes for deres østrogene aktivitet i relevante in vivo tests, såsom vitellogenininduktion eller gonadeeffekter i fisk.