Evaluation of in vitro assays for determination of estrogenic activity in the environment

Evaluation of in vitro assays for determination of estrogenic activity in the environment

8 Konklusioner

Baggrund

Det er igennem de seneste år konstateret, ved undersøgelser i en række forskellige lande, at der i nogle tilfælde kan registreres østrogen aktivitet i det akvatiske miljø, der er i stand til at påvirke faunaen.
(Xeno)østrogener menes at ende i det akvatiske miljø primært via kommunalt og industrielt spildevand. Desuden kan drænvand fra marker være en yderligere kilde til (xeno)østrogener i det akvatiske miljø.
I det akvatiske miljø er den østrogene aktivitet primært blevet tilskrevet de naturlige østrogener, 17b-østradiol (E2), østron (E1) og østriol (E3), og det syntetiske østrogen, ethinyløstradiol (EE2). Desuden kan xenoøstrogener som alkylfenoler og bisfenol A i mindre grad også bidrage til den østrogene aktivitet i det akvatiske miljø.
In vitro assays måler den totale østrogene aktivitet i en vandprøve fra miljøet uanset hvilke stoffer, der er ansvarlige for aktiviteten. Det totale østrogene respons i en prøve sammenlignes så med størrelsen af det respons E2 fremkalder og udtrykkes som østradiolækvivalenter (EEQ).
Den totale østrogene aktivitet (udtrykt som EEQ-værdier) målt i urenset spildevand er 0,6-153 nanogram pr. liter. I renset spildevand er EEQ-værdierne som regel under 25 nanogram pr. liter. Der er dog i USA målt værdier helt op til omkring 150 nanogram pr. liter.
I overfladevand er der generelt fundet EEQ-værdier fra under 1 nanogram pr. liter og op til 15 nanogram pr. liter. Der er dog i én undersøgelse fundet værdier op til omkring 80 nanogram pr. liter.
De EEQ-niveauer, der er fundet i nogle akvatiske systemer, er høje nok til at inducere østrogene effekter i laboratorieforsøg med fisk.

Prøveforberedelse til in vitro analyse

Bestemmelse af østrogen aktivitet i prøver fra miljøet begynder med prøvetagning og opbevaring af prøverne indtil videre analyse. Der mangler dog i de fleste publikationer en detaljeret beskrivelse af de anvendte metoder til udtagning og opbevaring af prøver til in vitro undersøgelser.
Nogle studier indikerer, at der kan være tab af stoffer under ekstraktionsproceduren, specielt ved anvendelse af fastfase-ekstraktion.
Filtrerings- og ekstraktionsprocedurerne for prøver fra miljøet bør ordentligt valideres og optimeres før igangsættelse af ekstensive moniteringsstudier.

Evaluering af in vitro assays

Der er udviklet adskillige in vitro assays til screening for østrogen aktivitet. Testmetoderne er baseret på forskellige principper: direkte binding til
østrogenreceptoren, proliferation af østrogenafhængige MCF-7 celler (E-screen) og reportergenekspression.
Detektionsgrænserne for de forskellige assays varierer:
- Østrogenreceptorbinding: 272 ng E2/l
- E-screen: 0,27 ng E2/l
- Pattedyr-baseret reportergenassay (ER-CALUX): 0,1 ng E2/l
-YES-assay (gær-baseret reportergenassay): 1-3 ng E2/l.
Når man inkluderer de opkoncentrationsfaktorer, man anvender ved analyse af prøver fra miljøet, kan man bestemme en detektions-/ kvantifikationsgrænse for hele metoden:
- E-screen: 0,07-0,14 ng EEQ/l
- ER-CALUX: 0,001 ng EEQ/l
- YES-assay: 0,03 ng EEQ/l.
Østrogenreceptorbindingsassays har lav følsomhed og er vanskelige at automatisere, hvilket begrænser deres anvendelighed i moniteringsstudier af prøver fra miljøet.
E-screen assayet har den begrænsning, at et positivt respons ikke med sikkerhed kan tilskrives østrogenreceptoragonister, da en række ikke- østrogene stoffer har vist sig at influere på prolifereringen af MCF-7 celler, i hvert fald hos nogle cellelinier. Desuden er der observeret betydelige forskelle i resultater opnået med E-screen i forskellige laboratorier. Endelig må den lange analysetid anses for upraktisk i ekstensive moniteringsstudier.
Reportergenassays synes at være et passende valg for monitering af østrogen aktivitet i forskellige miljømatricer. Reportergenassays opdeles i de pattedyr-baserede og de gær-baserede assays.
Nogle pattedyr-baserede reportergenassays er højst følsomme. Til gengæld er pattedyrceller sværere og dyrere at dyrke.
Det gær-baserede reportergenassay (YES) er mindre følsomt og detekterer ikke altid antagonistisk aktivitet. Til gengæld er det mere simpelt og billigere at udføre.
Det endelige valg af hvilket reportergeneassay der skal benyttes (pattedyr-baseret eller gær-baseret) afhænger af vigtigheden af en lavere detektionsgrænse holdt op imod vigtigheden af simpel udførelse og lavere omkostninger.
Reportergenassays kunne foreslås som det første trin i at identificere hvilke prøver fra miljøet, der besidder østrogen aktivitet. Reportergenassays bør dog suppleres af in vivo assays (der tager højde for de komplekse processer, der foregår i hele dyr) for vurdering af potentielt skadelige effekter på faunaen.