Evaluation of Analytical Chemical Methods for Detection of Estrogens in the Environment

Evaluation of Analytical Chemical Methods for Detection of Estrogens in the Environment

Dansk sammenfatning

Nærværende rapport giver et overblik over kemiske analysemetoder til analyse af steroidøstrogener i (primært 17ß-estradiol (E1), Østron (E2), og ethinylestradiol (EE2)) i miljømatricer, såsom spildevand fra renseanlæggets indløb og udløb, overflade vand, grundvand, slam, gylle, drænvand og jord. Rapporten foreslår endvidere en række overvejelser og rekommandationer i forbindelse med valg af analysemetode til en specifik matrice. Endelig er også nogle økonomiske overvejelser berørt.

En analysemetode består af flere individuelle trin; prøveudtagning, prøveopbevaring, prøveforberedelse samt analyse/detektion. Alle disse trin har indflydelse på den endelige analysekvalitet. På grund af steroidøstrogenernes begrænsede stabilitet er prøveopbevaring en vigtig faktor for at opnå et tilfredsstillende resultat. Prøveforberedelsestrinnet kan tit være meget tidskrævende og omstændigt. Kvaliteten af den endelige prøveoprensning er samtidigt afgørende for det videre valg af analyseudstyr til den egentlige detektion eller kvantifikation af analytten.

Steroid østrogener udskilles i nogen grad som konjugater med urin eller fæces. Både mennesker og dyr udskiller disse stoffer. Koncentrationsniveauet i relevante miljøer er ofte i størrelsesorden 0,01 ng/l til 500 ng/l, afhængig af dels det pågældende steroidøstrogen og dels typen af miljømatrice. Der findes som regel relativt høje koncentrationsniveauer i indløbsvand til renseanlægget sammenlignet med behandlet spildevand, grundvand og overfladevand. Steroidkonjugaterne er mere vandopløselige end steroiderne selv, derfor kan de kun analyseres ved hjælp af LC-MS. Således er en række LC-MS baserede analysemetoder udviklet til at analysere både de konjugerede og ikke konjugerede østrogener samtidigt. På grund af konjugaternes lave damptryk, er det ikke muligt at analysere disse direkte ved hjælp af GC-teknikker. Indirekte analyse kan dog udføres ved hjælp de enzymatiske dekonjugeringsteknikker der udviklet for miljømatricer. Ved anvendelse af disse er det muligt at analysere det totale østrogen niveau i en prøve både ved hjælp af GC-MS.

I litteraturen foreslås forskellige detektionsmetoder til analyse af steroid østrogener. GC eller HPLC med traditionelle detektionsprincipper (HPLC-DAD, HPLC-UV, GC-FID) findes ikke anvendelig til dette formål på grund af metodernes lave sensitivitet og dårlige selektivitet. Anvendelse af GC eller LC i kombination med MS og helst MS-MS er at foretrække, fordi der herved opnås analysemetoder med en højere sensitivitet og bedre selektivitet. Med immunokemiske teknikker opnås ligeledes tilfredsstillende sensitivitet, men deres anvendelse er af flere grunde problematisk og de kan kun benyttes hvis nedenstående overvejelser tages i betragtning. Både single GC-MS og LC-MS kan benyttes, selv til komplicerede matricer såsom slam, gylle og jord hvis analysemetoden benytter sig af en tilfredsstillende valideringsmetode indeholdende en række kvalitetskriterier. Hvis disse krav overholdes vil der være muligt at opnå detektionsgrænser (LOD) på ca. 0,3 til 2 ng/l med GC-MS i overfladevand eller behandlet spildevand ellers vil LOD ligge på ca. 20 ng/l. Lidt højere med LC-MS baserede metoder.

De mere avancerede LC-MS-MS eller GC-MS-MS metoder er de mest følsomme og har den højeste selektivitet og foreslås derfor benyttet specielt hvis østrogener skal måles i urene matricer (slam, gylle, eller jord) eller lave koncentrationer (overfladevand, spildevandsudløb). For disse teknikker vil LOD ligge på 0,1 til 0,5 ng/l for både GC og LC baserede metoder.

Metoder med en LOD på under 0,1 ng/l er ikke kommercielt tilgængelige og kræver yderligere forskning, hvad angår både prøveforberedelse og benyttelse af sensitive triple quadrupole instrumenter. Anvendelse af immunokemiske teknikker er også meget følsomme (LOD er rapporteret fra 0,05 ng/l og opefter) for i hvert fald spildevandsprøver med behandlet spildevand. Men metodernes selektivitet er dårlig sammenlignet med LC-MS-MS og GC-MS-MS. Specielt skal man være påpasselig med ikke at analysere prøver hvor ikke prøveoprensningen er i top. Falsk positive resultater og stor variabilitet er problemer der generelt ses ved benyttelse af de immunokemiske metoder. De foreslås derfor ikke benyttet som eneste analyseteknik, men kan pga. deres høje følsomhed og lave pris indgå i kombination med MS teknikkerne i en samlet større analysestrategi. Sådanne analysestrategier er dog i dag ikke udviklet.

Uden tvivl vil man, også på dette område, i løbet af få år se en langt større anvendelse af de mere avancerede MS-MS teknikker, der langt hen af vejen også vil blive integreret i automatiserede on-line systemer hvorved mange prøver kan analyseres på kort tid og til en fornuftig pris. Flere nye ekstraktionsteknikker, der dog endnu ikke kommercielt tilgængelige, er også på vej. Her skal nævnes molekylære imprinting materialer og immunoaffinitets kolonner, der vil simplificere prøveforberedelsen og gøre analysemetoderne både mere sensitive og mere selektive. Anvendelsen af biosensorer er en anden teknologi, der også i nær fremtid vil være et alternativ til de kromatografiske metoder i analysen af steroid østrogener i miljøet.