[Forside] [Indhold] [Forrige] [Næste]

2. Baggrund

	2.1 Bioremediering
	2.2 PAH
	2.3 Svampe
	2.4 Sammenfatning

2.1 Bioremediering

Bioremediering er betegnelsen for tiltag til oprensning af forurenet jord med mikroorganismer (bakterier og svampe). De fleste organiske stoffer kan under de rette forhold nedbrydes og udnyttes af mikroorganismer som kulstof- og energikilde. Nedbrydningsraten kan dog være så langsom, at stoffet må betegnes som persistent. Miljøfremmede stoffer (xenobioter; menneskefremstillede kemikalier der kun har været i biosfæren i kort tid) er ofte svært nedbrydelige eller persistente som fx. chlorerede alifater (opløsningsmidler), pentachlorphenol (PCP), polychlorerede biphenyler (PCB) m.fl. men også naturlige organiske stoffer kan under normale forhold være svært nedbrydelige/persistente. Blandt mikroorganismerne er det hovedsageligt bakterier, der er årsag til nedbrydning af organiske stoffer i dybere jordlag, idet svampe hovedsageligt forekommer i de allerøverste jordlag, hvor der er rigeligt med ilt. I selv meget dybe boringer findes bakterier omend i mindsket antal med dybden [Albrechtsen (1988) og Sinclair & Ghiorse (1989)]. Forholdene i jorden er under uforurenede omstændigheder normalt oligotrophe, dvs. lav substratkoncentration og -flux, hvilket bakterierne her har tilpasset sig. For at bioremediering kan lykkes må stoffet være tilgængeligt og nedbrydeligt, og reaktionsprodukterne skal ligeledes være nedbrydelige, så slutprodukterne er uskadelige. Endvidere skal nedbrydningsraten være så høj, at nedbrydningen sker indenfor en overskuelig tid.

Bioremediering i Danmark er idag hovedsageligt begrænset til behandling af forurenet jord på særligt indrettede anlæg. Her er undergrunden sikret mod nedsivning med en membran, perkolat opsamles og recirkuleres, og der føres tilsyn med processen. Det er hovedsageligt benzin-, olie- og tjæreforurenet jord, der behandles på disse anlæg.

I 1993 blev der håndteret ca. 300.000 tons forurenet jord, svarende til oprydning af 183 depoter, hvor hovedparten (ca. 200.000 tons) blev behandlet biologisk på specielt indrettede anlæg før en endelig slutdeponering eller genanvendelse; resten blev behandlet ved forbrænding eller ekstraktion [Miljøstyrelsen (1993 & 1995)].

Grænseværdier
Økonomien og kapaciteten i jordrenseanlæggene er stærkt afhængige af opholdstiden. For at bringe opholdstiden ned, optimeres nedbrydningsprocesserne ved beluftning (vending eller indblæsning af luft), næringsstoftilførsel (gødskning) og recirkulation af perkolat (vanding og podning).

Før den rensede jord frigives, skal PAH koncentrationen være under 5 mg/kg, BTEX (benzen, toluen, ethylbenzen, xylen)< 0,5 mg/kg og total kulbrinter < 25 mg/kg [Miljøstyrelsen (1992)]. Analyserne foretages af et uvildigt laboratorium. Afhængigt af restkoncentrationen frigives jorden til forskelligt formål/depot. For en svær forurening med PAH'er er det ofte disse stoffer, der sætter grænsen, da alifater og BTEX (mono aromaterne benzen, toluen, ethylbenzen og xylen) er relativt let nedbrydelige.

I dag foretages analyserne efter ekstraktion af jordprøver med organiske opløsningsmidler. Indeholder jorden væsentlige mængder humus vil en væsentlig del af PAH'erne kunne bindes hertil og ikke blive ekstraheret ved den vanlige procedure, men kræve en delvis basisk hydrolyse af humusstofferne først [Mahro et al (1994)]. Tilsætning af humus vil derfor give en "kunstig" sænkning af indholdet, men eventuelt immobilisere forureningskomponenterne. Det er idag ikke tilladt at fortynde sig ud af en forureningsproblematik, men problematikken kan blive aktuel at undersøge, i forbindelse med fastsættelse af analyse procedurer og acceptkriterier for jord inokuleret og oprenset med svampe.

2.2 PAH

Kulbrinte sammensætningen af benzin, olie og tjære er meget komplex og varierer meget, men kan angives ved følgende kemiske grupper [Miljøstyrelsen (1993)]:

Jord hidrørende fra nedlagte gasværker, asfalt- og tjærevirksomheder har et højt indhold af polyaromatiske hydrocarboner (PAH).

Nedbrydelighed
Alle disse naturlige kulbrinter er biologisk nedbrydelige under aerobe forhold - dog i forskellig grad. Generelt er nedbrydeligheden (nedbrydningsraten) mindre jo større og jo mere komplekst molekylet er (dog med undtagelser). Nedbrydningsraten stiger: n-alkaner > isoalkaner > cykliske alifater > aromater > PAH. Mikroorganismerne vil endvidere nedbryde de lettest nedbrydelige stoffer først.

Mikrobiologisk nedbrydning af aromater foregår kun aerobt og nedbrydningsraten mindskes med større kompleksitet. PAH med 2-3 ringe nedbrydes relativt hurtigt af bakterier og kan udnyttes som substrat, mens PAH med flere ringe regnes for svært nedbrydelige og kun nedbrydes ved cometabolisme; sidekæder på ringstrukturerne mindsker yderligere nedbrydeligheden [Elmendorf et al 1994]. Endvidere sorberes PAH humusstoffer hvilket gør dem utilgængelige for bakteriel nedbrydning og opløseligheden mindskes med stigende antal ringe. Nedbrydningsmekanismerne kan opsummeres til følgende [Mahro et al 1994]:

Nedbrydningsmekanismer

	Mineralisering: Fuldstændig mineralisering, der kun er påvist for prokaryoter (bakterier) for PAH med op til 4-ringe, katalyseres af dioxygenase og muliggør bakteriers vækst på PAH som eneste kulstof- og energikilde eks. nedbrydning af naphtalen.
	Delvis nedbrydning: eukariote celler (svampe og mammale celler) nedbryder PAH delvist som led i en detoxificering. Under denne nedbrydning dannes som mellemprodukt epoxid som er meget reaktivt overfor nukleinsyrer og dermed carcinogent. Epoxidet kan hydroxyleres eller reagere med andre stoffer til flere forskellige mindre toxiske nedbrydningsprodukter.
	Cometabolsk nedbrydning: Ved cometabolisme udnyttes PAH ikke som substrat, men nedbrydes delvist som sidereaktion ved nedbrydning af andet substrat. Nedbrydningsprodukter i form af phenol, catechol- eller chinon derivater ophobes ofte.
	Uspecifik radikal oxidation: Denne mekanisme er beskrevet for hvidmulds dannende svampe og skyldes disse trænedbrydende svampes evne til at nedbryde lignin. Nedbrydningen af lignin foregår ved uspecifikke extracellulære enzymer der virker i stil med peroxidase. Oxidationen initieres af frie radikaler der dannes ved reaktion med hydrogenperoxid. Da nedbrydningen er extracellulær kan selv sorberede stoffer nedbrydes. Nedbrydningen medfører en stor variation af nedbrydningsprodukter.

Sorption
PAH sorberes kraftigt til jord. Fordelingskoefficienterne (Kd), som afhænger af jordens indhold af organisk kulstof (med større C-indhold sorberes mere), stiger med stigende antal aromatiske ringe og er i størrelssesordenen 1000 til 15000 g/cm3, hvilket betyder at den største andel er sorberet til partikler, og deres mobilitet ved nedsivning eller i en grundvandsstrømning er ringe [Walter et al 1995]. Samtidig tilstedeværelse af olie medfører et drastisk fald i sorptionen (til hhv. 38% og 43% for naphtalen og chrysen ved tilstedeværelse af 0,1% olie) og dermed en øgning af mobiliteten [ibid.].

Opløselighed
Opløseligheden i vand er endvidere meget lav og falder drastisk med øget antal ringe (fx benzen (1 ring) 1780 mg/l, naphtalen (2 ringe) 31 mg/l, anthracen (3 ringe) 0,08 mg/l, chrysen (4 ringe) 0,002 mg/l), og mindskes yderligere ved tilstedeværelse af sidekæder på ringstrukturerne. Dette betyder, at der er meget lave koncentrationer tilgængelige for bakteriel nedbrydning, da disse fortrinsvis optager stoffer i opløsning for derefter at nedbryde dem med intracellulære enzymer. Svampene udskiller extracellulære enzymer og vil derfor have større potentiale for nedbrydning af sorberet stof.
Binding til humus
McFarland og Qiu (1991) viste at for radioaktivt mærket PAH-forurenet jord inokuleret med Phanerochaete chrysosporium var nedbrydningsraten 1,1 mg PAH/g·jord/dag mod 0,24 mg/g/dag uden svamp, men at nedbrydningsprodukterne blev bundet til humus. Mahro et al (1994) har vist, at sandblandet leret muldjord, der tilsættes PAH, i løbet af 25 dage binder 50% af PAH, så det ikke ekstraheres med organiske opløsningsmidler, mens basisk hydrolyse (0,2M NaOH i methanol) ekstraherede resten. Gængse EPA forskrifter benytter kun organiske opløsningsmidler til ekstraktion forud for analyse, hvilket derfor giver relativt lavere målte værdier. Forsøg med radioaktivt mærket PAH tilsat jord med PAH nedbrydende organismer viste at næsten 100% af radioaktiviteten kunne genfindes i jorden, hvoraf de ca. 90% kunne ekstraheres (organisk ektraktion og basisk hydrolyse), og ca. 10% derfor var covalent bundet [ibid]. Tilsvarende forsøg med jord/kompost blanding (mere humusrigt) gav ca. 50% mineralisering (helt nedbrudte PAH), ca. 50% kunne genfindes i jorden, hvoraf kun ca. 10% kunne ekstraheres (organisk ektraktion og basisk hydrolyse) [ibid]. Af den ekstraherbare fraktion var ca halvdelen den oprindelige PAH (5%) og halvdelen nedbrydningsprodukter (5%) [ibid]. Dette betyder at 40% af den oprindelige mængde PAH blev inkorporeret i humus ved covalent binding af nedbrydningsprodukter eller PAH.

Tilsvarende mængder af bundet PAH er fundet af Eschenbach et al (1995) og Zarht (1995), hvor sidstnævnte endvidere undersøgte toxiciteten (den anvendte biotest var ikke nærmere beskrevet) af jorden, som viste at toxiciteten mindskedes med tiden, og at stofferne ikke længere var biotilgængelige efter 2_ år.

Nedbrydning vs tilgængelighed
Schaefer et al (1995) viste ved laboratorieforsøg at i "naturligt" forurenet jord med >200 mg PAH/kg blev 70-90% nedbrudt inden for 6 måneder (mindre mængder gav mindre nedbrydningsgrad), mens der ved kunstigt forurenet jord med mindre mængder kunne opnås endda højere nedbrydningsprocenter. Dette indikerer at biotilgængeligheden mindskes med tiden som følge af sorption.

Barclay et al (1995) har i flydende kulturer vist at op til 40% PAH/nedbrydningsprodukt bindes til biomassen (ca 60% af nedbrydningsprodukterne er i mediet) for senere at blive frigivet til mediet som nedbrudt PAH.

Sammenfatning af reviews
Med ovenstående beskrevne undersøgelser foretaget af Mahro et al (1994) m.fl. bør publikationer med dokumenteret nedbrydning af PAH i jord alle vurderes kritisk, idet en stor del af postuleret nedbrudt stof formentlig er bundet til jordens organiske fraktion - om det så har en toxikologisk effekt bør undersøges nøjere. Ekstraktion af PAH fra jord bør foretages ved en to-trins ekstraktion ved organisk ekstraktion efterfulgt af en forsæbning (methanol hydrolyse) som beskrevet af Eschenbach et al (1994).

2.3 Svampe

Svampe er blevet dyrket "industrielt" siden det 6.århundrede i Kina til spiseformål, og produktionen af spisesvampe idag udgør flere 100.000 tons årligt fordelt på flere forskellige arter. Dyrkningen foregår på et celluloseholdigt substrat der eventuelt er beriget med næringsstoffer. De mest almindelige substrater/ (svampe) er hestegødning/(champignon, Agaricus bisporus), halm/(Østershat, Pleurotus ostreatus) og træ/(Shiitake, Lentinus edodes). Idag udnyttes svampe i stor udstrækning industrielt til fremstilling af mange forskellige slags organiske forbindelser fx. antibiotika, industrielle enzymer, citronsyre m.m.

Dyrkning
Fremgangsmåden ved dyrkning af svampe til konsum varierer kun lidt [Bech (1990); Chang & Miles (1989); MacCanna (1984); Groos (1989); Raaska (1993); Singer & Harris (1987)]. De fleste svampedyrkere køber deres inokulom der oftest er baseret på korn som substrat. Inokulom fremstilles ved at pode et flydende medium med en agarkultur. Når den flydende kultur er udvokset, homogeniseres den i kort tid for at fragmentere myceliet, der herefter får lov at hvile i et par dage. Det homogeniserede mycelium benyttes så til at pode et fast substrat som kan være hakket halm, savsmuld, ris, hirse eller anden kornsort. Det faste substrat er opfugtet/kogt til et fugtindhold på 50-70%, autoklaveret og eventuelt tilsat kalk (for at øge pH) og gips (for at hindre klumpning). Efter gennemvoksning af det faste substrat er det klar til podning af produktionssubstratet. I tilfælde hvor produktionssubstratet er halm, gennemblødes det først, hvorefter det pasteuriseres 1-2 døgn ved 60-65°
C. Podemængden angives ofte til 2% (w/w).

Svampe har et stort potentiale til nedbrydning af organiske stoffer. Selv xenobiotiske stoffer som syntetiske polymere (plastik) kan nedbrydes af svampe, og svampe forefindes i de fleste biotoper. Deres potentiale som nedbrydere ses også tydeligt ved nedbrydning af træ, hvor nogle arter har specialiseret sig i nedbrydningen af lignin, der ellers har en uhyre kompliceret struktur og kun nedbrydes mikrobielt af svampe; bakterierne kan først udnytte cellulosen fra træ, efter at det er delvist nedbrudt af svampe eller højere organismer.

Svampene udskiller extracellulære enzymer til nedbrydning af komplekse organiske strukturer. De trænedbrydende svampe, der vokser i et relativt kvælstoffattigt substrat, har et ydre slimlag, som man mener tilbageholder enzymer og dermed er økonomiserende. Udskillelsen af enzymer udnyttes industrielt fx. til produktion af lipase vha. genmanipulerede gærsvampe.

Svampe er med få undtagelser strikt aerobe mikroorganismer og forekommer derfor ikke naturligt i større jorddybder. I de øvre jordlag koloniserer svampe deres vækstmedium effektivt: Hyfelængden i skovjord er bestemt til hhv. 307, 57 og 11 m/g jord i dybderne 0-10, 10-20 og 20-40 cm [Dissing et al (1985)].

Svampe transporterer næringsstoffer fra kilden til vækstzonen, således at de er istand til at kolonisere eller overvokse eventuelle næringsfattige eller tørre områder fx. den trænedbrydende svamp Ægte Hussvamp (Serpula lacrymans) der kan vokse flere meter over eller gennem murværk.

Flere svampearter er velkendte nedbrydere af olieprodukter:

	Lentinus lepideus (creosot (PAH og phenoler) behandlede master, [Glancy et al (1989)],
	Phanerochaete chrysosporium (PAH, phenol, DDT, PCB, HCH, PCP, dioxin)[Bumpus (1987), Kennes (1994), Barclay (1995), Aust (1993), Gold (1993), Tien (1993), Hüttermann (1993) og Shiahpush ],
	Trametes versicolor (PAH, phenol) [Summerwill (1993)],
	Amorphoteca resinae (creosot, PAH),
	Candida sp (diesel) [Okpokwasili (1988)],
	Bjerkandera adusta (PAH)[Field (1993)],
	Pleurotus ostreatus (PCB, PAH) [Hüttermann (1993), Zeddes (1993), Anderson, (1996)].

Fordelen ved at anvende svampe er, at de:

	kan dyrkes industrielt
	har et større enzymatisk potentiale end bakterier
	udskiller extracellulære enzymer
	kan vokse/sprede sig i jord
	selv transporterer næringsstoffer til vækst-/nedbrydningszonen.
	kan nedbryde ellers svært nedbrydelige stoffer

Bakterier og svampe har hver sin PAH nedbrydningsmekanisme [Cerniglia (1984)]. Bakterierne dihydroxylerer aromatiske forbindelser med dioxygenase og dehydrogenase forud for ringåbning, og er i stand til at udnytte forbindelserne i metabolismen. Nedbrydningen hos svampe sker enzymatisk (ved tilsvarende mekanisme som hos mammale celler) ved dannelse af et epoxid, der kan dihydroxyleres enzymatisk. Epoxider er meget reaktive og kan derfor bindes til forskellige stoffer (proteiner, humus, nukleinsyrer) eller spontant omdannes til phenoler. Det er ikke påvist om svampe kan udnytte PAH i metabolismen.

Fuldstændig nedbrydning (mineralisering) er påvist for PAH'er med op til 6 ringe af Martens (1982). Her blev det endvidere påvist ved forsøg med kompostering (der er meget mikrobielt aktivt/diverst), at adaptionstiden var i størrelsesordenen 3 måneder, før nedbrydningen gik igang, men at der derefter kunne nedbrydes 10-20% i løbet af 10 uger.

Field et al (1993) har med cellefrit vækstmedium vist, at de initielle nedbrydningstrin sker med extracellulære enzymer og, at dette system initieres af næringsmangel. Bumpus et al (1985 & 1987) har vist, at Phanerochaete chrysosporium er i stand til at nedbryde de vigtigste xenobiotiske stoffer i flydende medium (chlorerede alifater, PCB, DDT, dioxin, PAH, hexachlorohexan) med samme enzymsystem, der benyttes ved nedbrydning af lignin samt eventuelt andre enzymsystemer (de trænedbrydende svampe har flere u-specifikke extracellulære enzymsystemer beregnet til nedbrydning af lignin [Buswell & Odier (1987)]). Kennes et al (1994) har vist, at der ved nedbrydning af PAH med Phanerochaete chrysosporium dannes quinoner som nedbrydningsprodukter.

Barclay et al (1995) har i flydende kulturer vist, at kun omkring 3% PAH mineraliseres fuldstændigt af Phanerochaete chrysosporium. For PAH i jord har Eschenbach et al (1995) vist, at i løbet af 6 måneder var mineralisering af størrelsesordenen 5-70% nedbrudt med den naturlige bakterieflora (yderlighederne var for hhv. benz(a)pyren og naphtalen).

2.4 Sammenfatning

Flere forskere har påvist PAH nedbrydningspotentiale for forskellige trænedbrydende svampe i flydende medium samt i jord.

PAH sorberes kraftigt til jordpartikler, så mobiliteten og den bakterielle tilgængelighed er lav. PAH sorberer så kraftigt til jordens organiske fraktion, at det ikke ekstraheres med organiske opløsningsmidler.

Mekanismen for svampes nedbrydning af PAH er hovedsageligt en uspecifik oxidation med frie radikaler katalyseret af svampenes extracellulære peroxidase system.

Kun en lille del af den nedbrudte PAH er fuldstændigt mineraliseret i jord, mens hovedparten består af diverse nedbrydningsprodukter; i husholdningskompost mineraliseres en større del pga. større biologisk aktivitet/diversitet.

Nedbrydningsprodukterne inkorporeres for en stor dels vedkommende i humus med covalente bindinger og er derfor ikke ekstraherbare eller biologisk tilgængelige.

[Forside] [Indhold] [Forrige] [Næste] [Top]