Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler og toksiske metabolitter

5. Biologiske bekæmpelsesorganismers produktion af sekundære metabolitter in vivo

5.1 Indirekte bevis for antibiosis in vitro
5.2 Indirekte bevis for antibiosis in vivo
5.3 Produktion af sekundære metabolitter in situ
5.3.1 Jord og rhizosfære
5.3.2 Planteprodukter til konsum
5.4 Opsummering

Mange slægter af phyllosfære, jord og rhizosfære mikroorganismer herunder svampe, gær og bakterier er rapporteret at kunne producere sekundære metabolitter, så som antibiotika, der har en hæmmende effekt på mikroorganismer, eller sekundære metabolitter der er toksiske overfor dyr og mennesker så som mycotoksiner (Betina, 1989; Blakeman & Fokkema, 1982; Lübeck, 1994; Stirling et al., 1995; Smilanick, 1994). Antibiosis regnes da også for at være en mekanisme, der ofte er involveret i biologisk bekæmpelse af plantepatogener, selvom metabolitproduktion in situ som oftest ikke er påvist.

5.1 Indirekte bevis for antibiosis in vitro

In vitro produktion

Mange af de mikroorganismer, der har udvist effektiv biologisk bekæmpelse af plantesygdomme, heriblandt de arter, der ønskes anvendt i Danmark, har vist sig at være i stand til potentielt at producere sekundære metabolitter. I tabel 5.1 er antallet af identificerede metabolitter fra udvalgte mikroorganismer listet (Lübeck, 1994). Listen er dog ikke komplet, idet der konstant isolereres og identificeres nye stoffer. I forbindelse med disse stoffers eventuelle produktion in vivo og dermed potentiel risiko for at fødevarer kontamineres med toksiske metabolitter skal flere vigtige forhold tages i betragtning:

1. Langt hovedparten af de identificerede sekundære metabolitter er isoleret efter in vitro dyrkning på kunstige næringssubstrater. Mediets næringssammensætning, pH, vandpotentiale, lys, temperatur m.v. har dog stor indflydelse på både den kvalitative og den kvantitative metabolitproduktion (Demain, 1992; Slininger & Shea-Wilbur, 1995). Der findes i litteraturen kun ganske få eksempler angående påvist metabolitproduktion in vivo d.v.s. på og i planter og i jord i forbindelse med biologisk bekæmpelsesorganismer (se. afsnit 5.3)
2. Mange antagonister er testet i dualcultures, hvor den potentielle antagonist og patogenet inkuberes samtidigt på agar og en inhiberingszone udtrykker antagonistens væksthæmmende effekt overfor patogenet. Inhiberingszonen tages til udtryk for at antagonisten har produceret diffunderbare metabolitter. Adskillige undersøgelser har dog vist, at det langtfra altid er muligt at korrelere antibiosis in vitro med biologisk bekæmpelse in vivo (Fravel, 1988; Renwick et al., 1991).
3. Indenfor slægter, arter og isolater (stammer) kan der være stor variation i såvel den kvalitative som den kvantitative metabolitproduktion. Det betyder i praksis, at der ikke umiddelbart kan drages konklusioner vedrørende et specifikt isolats metabolitproduktion ud fra kendskab til produktionsmønstret for andre isolater af arten.

Dilemma

Hvordan skal man med hensyn til risikovurdering forholde sig til en organisme, der in vitro producerer en lang række metabolitter, hvoraf en eller flere antages at kunne være skadelige for mennesker, men hvor der ikke er indikation for, at antibiosis som følge af metabolitproduktion er involveret i bekæmpelsen. Skal der analyseres for restkoncentrationer af toksiske metabolitter, og i givet fald hvilke ?.

Tabel 5.1. Antal identificerede sekundære metabolitter fra udvalgte mikrobiologiske bekæmpelsesmidler (MBO)¹⁾. Oplysninger vedrørende markedsføring af MBO og godkendelse af MBO i andre EU lande eller USA er angivet.

Table 5.1. Number of identified secondary metabolites from biological control agents (BCA). Information on BCA marketed in Denmark and registration in other EU countries or the USA.

Se her

5.2 Indirekte bevis for antibiosis in vivo

Non-metabolitproducerende mutanter

I bestræbelserne på at bevise sekundære metabolitters betydning i praktisk biologisk bekæmpelse, er der indenfor de seneste år anvendt et approach der bygger på in vivo assay og molekylær genetiske metoder med følgende hovedpunkter: (i) Der udvikles et plantebioassy, hvor biologisk bekæmpelsesaktivitet kan påvises, (ii) et vildtypeisolat med god bekæmpelsesaktivitet in vivo og som producere antibiotika in vitro selekteres, (iii) vildtypeisolatet muteres, og en mutant, der ikke kan producere det pågældende antibiotika selekteres, og (iv) ved hjælp af et genomisk bibliotek fra vildtype isolatets DNA komplementeres mutant- isolatet, så evnen til antibiotikaproduktion genetableres. Med udgangspunkt i den skitserede fremgangsmåde, er det med stor sandsynlighed vist, at de sekundære metabolitter phenazine og 2,4-diacetylphloroglucinol produceret af Pseudomonas fluorescens og P. aureofaciens er involveret i biologisk bekæmpelse af plantepatogener (Keel et al., 1992; Weller & Thomasshow, 1994). Wilhite et al. (1994) viste at gliotoxin produceret af Trichoderma virens er involveret i biologisk bekæmpelse af rodpatogenet Pythium ultimum in vivo. Syv mutanter med manglende evne til gliotoxin produktion gav således relativt set kun 54% sygdomshæmning som gennemsnit i sammenligning med vildtypen (100%), der blev dog ikke ikke fremstillet komplementerede gliotoxinproducerende mutanter. Studier som de ovennævnte repræsenterer stærke genetiske beviser, der understøtter, at antibiosis også kan spille en stor rolle for biologisk bekæmpelse af plantesygdomme med MBO i naturlige systemer in vivo. En anden fordel er, at der identificeres en metabolit, der med stor sandsynlighed produceres in vivo, og derved får man følgelig mulighed for at analysere planteprodukter med hensyn til eventuelle restkoncentrationer af den pågældende metabolit.

Applikation af metabolitter til planter

En anden metode til indirekte påvisning af sekundære metabolitters betydning i biologisk bekæmpelse af plantepatogener bygger på en direkte applikation af en metaboilt produceret af antagonisten in vitro til planter inokuleret med patogenet. Såfremt metabolitten kan hæmme patogenet in vivo, er det en indikation for at antibiosis er involveret i bekæmpelse in situ (Cutler & Hill, 1994; Kenerly & Andrews, 1990).

5.3 Produktion af sekundære metabolitter in situ

Grunden til, at der kun er få rapporter angående detektion af sekundære metabolitter i forbindelse med biologisk bekæmpelse af plantepatogener beror formodentlig på et eller flere af nedenstående forhold:

1. De metabolitter, der er fundet af betydning ved in vitro studier, bliver ikke produceret in vivo
2. Der produceres sekundære metabolitter in vivo , men disse nedbrydes eller adsorberes hurtigt i det naturlige miljø (se afsnit 4.3).
3. Der produceres sekundære metabolitter in vivo, men metoder til analyse af metabolitter er utilstrækkelige.
4. Langt de fleste undersøgelser af biologisk bekæmpelse af plantepatogener har ikke haft til formål at detektere eventuelle metabolitter produceret af antagonisten.

I det følgende vil den tilgængelige viden angående produktion af sekundære metabolitter detekteret in situ i forbindelse med mikrobiologiske bekæmpelsesorganismers aktivitet og bekæmpelse af plantepatogener blive beskrevet.

5.3.1 Jord og rhizosfære

Gliotoxin

Allerede i 50'erne blev gliotoxin isoleret fra frø og fra landbrugsjord iblandet plantemateriale, der var inokuleret med mikroorganismen Trichoderma viride (T. virens ?) (Wright, 1952). I løbet af 90'erne er der desuden kommet publikationer vedrørende produktion af gliotoxin i jord og voksemedier i forbindelse med biologisk bekæmpelse af rodpatogener som Pythium ultimum og Rhizotonia solani med Trichoderma virens formuleret i alginatpiller.

Gliotoxin er rapporteret at have antibakteriel, antifungal, antiviral, immunosuppresive aktivitet og mammalian toxicitet. LD₅₀-værdien er bestemt til 25 mg/kg (rotter) (Walter & Lumsden, 1997). Gliotoxin er følsom overfor oxidation og varme og toksinet inaktiveres efter 10 min. varmebehandling ved 100°C (Walter & Lumsden, 1997).

Produktion på frø

Wright (1956c) anvendte et isolat af T. viride, der producerede gliotoxin in vitro og viste, at der kunne isoleres gliotoxin fra frøskapper af ært, hvede og sennep frø, når disse var inokuleret (bejdset) med sporer af T. viride og inkuberet i usteril pottemuld. For frø inkuberet uden T. viride sporer kunne der ikke detekteres gliotoxin, hvilket viser, at frøeksudater understøttede produktionen af toksinet. Målinger af gliotoxin indholdet i ærtefrøkapper over en 12 døgns inkubationsperiode viste endvidere, at gliotoxin ikke blev introduceret med sporer af antagonisten, idet toksinet først blev detekteret efter 3 døgns inkubation. Den maksimale produktion af gliotoxin blev opnået efter 6 døgn, hvorefter produktionen faldt markant (tabel 5.2). Det beror formodentlig på at frøeksudater er en nødvendig og begrænsende næringskilde for produktionen af gliotoxin, og at eksudaterne er opbrugt i løbet af denne periode. Den nære sammenhæng mellem næringskilde og gliotoxinproduktion blev endvidere understøttet af undersøgelserne, der viste, at på det tidspunkt hvor den højeste koncentration af gliotoxin i frøkappen blev målt (89µg/g frøkappe), kunne der til sammenligning i jorden lige omkring frøet kun detekteres 0.4 µg per g jord (Wright, 1956c).

Det var endvidere også muligt at detektere gliotoxin i frøkappen fra frø, der ikke var bejdsede med T. viride, såfremt frøene blev sået i en kompostjord med en stor naturlig forekomst af T. viride (Wright, 1956c).

Tabel 5.2 Produktion af gliotoxin på ærtefrø bejdset med Trichoderma viride og dyrket i pottemuld inkuberet ved 25°C (modificeret efter Wright, 1956c).

Table 5.2. Production of gliotoxin on pea seeds coated with Trichoderma viride and grown in soil at 25°C.

Produktion i jord tilsat planterester

I flere undersøgelser er effekten af tilførsel af T. viride og organisk

materiale til jord undersøgt. T. viride producerede gliotoxin i usteril jord, såfremt der samtidig blev tilført næring i form af 1-5% (w/w tørvægt) tørrede formalede kløverblade eller opblødte hvedestrå (Wright, 1952; 1956 a & b).

Undersøgelserne viste endvidere, at en sænkelse af pH-værdier i jord eller tilsatte organiske substrater forøgede T. viride's produktion af gliotoxin i visse jordtyper (Wright, 1956b). Generelt var et højt indhold af tilgængelige planterester i jorden dog den mest betydende faktor for gliotoxinproduktion.

Produktion fra alginatpiller

Alginatpiller indeholdende T. virens og en næringskilde i form af hvedeklid kan ved iblanding til jord og kunstige vækstmedier bekæmpe rodpatogenerne Pythium ultimum og Rhizotonia solani (Walter & Lumsden, 1997). Gliotoksinproduktion menes at være en væsentlig mekanisme i den biolgiske bekæmpelse (Harris & Lumsden, 1997;Wilhite et al., 1994).

Lumsden et al. (1992) undersøgte indvirkningen af dyrkningsmediets sammensætning på produktionen af gliotoxin efter iblanding af klid-alginat piller formuleret med T. virens til fire typer af vækstmedier. Som det fremgår af tabel 5.3 kunne der detekteres et højere indhold af gliotoxin i voksemedier og jorde med et højt indhold af organisk materiale end i mere mineralske jordtyper (sandjord). Andre undersøgelser har da også vist at næringsstoffer er nødvendige for den biologiske bekæmpelsesaktivitet af T. virens (Lewis & Papavizas, 1985 og 1987), ligesom produktion af gliotoxin in vitro er meget afhængig af næringsammensætningen.

Temperaturens indflydelse på in vivo produktionen af gliotoxin er også undersøgt. I et voksemedium tilsat alignatpiller med T. virens, kunne gliotoxin detekteres efter 3 døgns inkubation i et temperaturinterval fra 15°C til 30 °C. Den største produktion blev detekteret ved 30°C, hvor produktionen var ca. 5 gange så stor som ved 15 °C (Lumsden et al., 1992).

Tabel 5.3. Detektion af gliotoxin i jorde og voksemedier efter tilførsel af alginat/klid piller med Trichoderma virens og 3 døgns inkubation ved 20-25°C (Modificeret efter Lumsden et al., 1992).

Table 5.3. Detection of gliotoxin in soils and artificial growth media after application of alginate/bran pills with Trichoderma virens incubated 3 days at 20-25°C.

¹⁾ sphagnum/vermiculit/næringsstoffer
²⁾ komposteret loamy soil/sphagnum/perlite (3:3:1, v/v)
 

Persistens

I en meget koncentreret blanding af usterilt voksemedie og alginat piller med T. virens (1:1 w/w) blev der detekteret op til 0.65 mg gliotoxin per g pille efter 1 døgns inkubation men ingen gliotoxin til t=0. Mængden af gliotoxin aftog med tiden men kunne dog detekteres efter 18 døgns inkubation (<0.1 mg/g pille) (Lumsden et al.,1992). Lumsden & Walter (1995) angiver, at gliotoksin produceret efter inkorporering af alginat piller i jord bevarer aktiviteten en kort periode, hvorefter toksinet inaktiveres af jordens mikrobiota. Det angives endvidere, at de undersøgelser der viser dette forhold, ikke er publiseret.

Produktionsfasen

Gliotoxin kunne detekteres i mediet i en afstand af 4-5 cm fra centrum af alginatpillen. Denne afstand var den samme som den afstand T. virens var vokset ud fra alginatpillen. Produktionen af gliotoxin var således associeret med mycelievækst i den ekspanderende koloni. In vivo blev gliotoxin altså dannet i vækstfasen (tropofasen) og ikke som det ofte synes at være tilfældet med sekundære metabolitter i den såkaldte stationære fase (idiofase) (Lumsden et al., 1992; Lübeck, 1994).

Opsummering vedrørende gliotoxin

Den mikrobiologiske bekæmpelsesorganisme T. virens ( evt. også T. viride) kan producere gliotoksin in vivo, men produktionen er stærkt afhængig af tilgang til en anvendelig næringskilde så som eksudater fra frø eller organiske planterester i jorden eller en formulering af organismen i alginatpiller tilsat passende næringskilder. En høj inkubationstemperatur på 25-30°C synes at være optimal for produktionen af gliotoksin i jord. Desuden tyder undersøgelserne på, at gliotoxinkoncentrationen i jord aftager forholdsvis hurtigt, dels når adgangen til næringskilder mindskes og dels som følge af mikrobiologisk nedbrydning og adsorption i jord og voksemedier.

Phenazine

Pseudomonas fluorescens isolat 2-79 blev isoleret fra hvederødder i en markjord, der var supressiv overfor goldfodsyge (take-all decline) fremkaldt af patogenet Gaeumanomyces graminis (Weller & Cook, 1983). Ved bejdsning af hvede med 2-79 er der i markforsøg opnået en god bekæmpelse af goldfodsyge. P. fluorescens er rhizosfære kompetent, og den biologiske bekæmpelseseffektivitet tilskrives i høj grad isolatets produktion af den sekundære metabolit phenazine eller PCA (phenazine-1-carboxylic acid) i rhizosfæren (Weller & Thomashow, 1994). PCA er et kondenseret heterocyklisk phenazine derivat med antibakteriel og antifungal aktivitet. LD₅₀ angives til 400 i.v. (Lübeck, 1994).

Tabel 5.4. Produktion af PCA i rhizosfæren af hvede bejdset med Pseudomonas fluorescens 2-79 og biologisk bekæmpelse af goldfodsyge i markjord (Mod. efter Thomashow et al.,1990).

Table 5.4. Production of PCA in the rhizosphere of wheat coated with Pseudomonas fluorescens 2-79 and biological control of take-all in field soil.

¹⁾ Phenazine blev ekstraheret fra rødder med vedhængende jord (friskvægt)
 

Produktion i rhizosfæren

PCA's betydning for biologisk bekæmpelse af goldfodsyge er vist ved hjælp af en mutant af 2-79 uden evnen til PCA- produktion (phz -) og en komplementeret mutants genetablerede PCA produktion (se evt. afsnit 5.2). PCA blev således kun isoleret fra rhizosfæren af planter fra frø bejdset med 2-79 vildtypen eller det komplementerede mutant-isolat (tabel 5.4). Produktionen af PCA i rhizosfæren fra 2-79 bejdsede hvedefrø dyrket under markforhold (12-27 ng PCA/g rod) var af samme størrelsesorden som for planter dyrket i væksthus. Væksthusforsøgene viste endvider, at PCA produktionen i rhizosfæren var uafhængig af, om jorden var inokuleret med patogenet. Det indikerer, at nærings-forsyningen i hvedens rhizosfæren generelt er tilstrækkelig til at understøtte produktion af PCA, uanset om patogenet er tilstede eller ej (Thomashow et al., 1990).

2,4-diacetylphloroglucinol

Keel et al. (1992) anvendte et isolat af Pseudomonas fluorescens (CHA0) til iblanding til et voksemedie (gnotobiotisk system) bestående af vermiculit, kvartssand og kvartspulver, der blev inokuleret med patogenet Gaeumannomyces graminis var. tritici inden såning af hvede. Som det fremgår af tabel 5.5 var der en stærk positiv korrelation mellem sygdomshæmning og isolat CHA0 (CHAO,(phl+)) med det gen, der koder for metabolitten 2,4-diacetylphloroglucinol (phl). En mutant af CHA0 uden genet (CHA0, phl-) havde en langt svagere sygdomsreduktion. Ydermere kunne komplementering af mutanten (CHA625/pME3128, (phl+)) genetablere en højere grad af bekæmpelse. Det var endvider muligt at isoler phl fra rhizosfæren af hvederødder for begge phl+ isolater i størrelsesordenen 0.94-1.36 µg/g rod for CHA0 (phl+) og 0.19-0.26 µg/g rod for CHA625/pME3128 (phl+). Forsøget viser endvidere at bekæmpelsen ikke afhænger signifikant af rhizosfærepopulationen af Pseudomonas (Tabel 5.5)

Tabel 5.5. Produktion af 2,4-diacetylphloroglucinol (phl) i rhizosfæren af hvede efter tilførsel af Pseudomonas fluorescens, bekæmpelse af Gaeumannomyces graminis og rhizosfærepopulationen af Pseudomonas. (Modificeret efter Keel et al., 1992).

Table 5.5. Production of 2,4-diacetylphloroglucinol (phl) in the rhizosphere of wheat after soil application of Pseudomonas fluorescens, disease control of Gaeumannomyces graminis and the rhizosphere population of Pseudomonas.

Se her

5.3.2 Planteprodukter til konsum

Det har ikke været muligt at finde eksempler på detektion af sekundære metabolitter på blade og frugter som følge af anvendelse af MBO til bekæmpelse af plantepatogener. Der er dog to undersøgelser, der påviser produktion af sekundære metabolitter på kartoffelknolde.

Pyrrolnitrin blev detekteret i sår på kartoffelknolde en uge efter at kunstigt sårede knolde var inokuleret med Pseudomonas cepacia og patogenet Fusarium sambucinum (Burkhead et al., 1994). Hvert sår blev inokuleret med ca. 2.75 x 10⁵ cfu af P. cepacia, og efter 7 døgns fugtig inkubation ved 15°C kunne der isoleres 1.2-1.7 x 10⁶ cfu per sår, og der blev detekteret pyrrolnitrin i sårene (3 x 2 mm) svarende til minimum 0.87 ng per sår. Det er endvidere værd at bemærke, at der kun blev detekteret pyrrolnitrin i de sår, der var inokuleret med både patogenet Fusarium og antagonisten P. cepacia , mens metabolitten ikke kunne detekteres fra sår, der alene var inokuleret med P. cepacia..

Efter behandling af kartoffelknolde med Trichoderma virens var Aluko & Hering (1970) i stand til at detektere antibiotika produktion på sklerotier af patogenet Rhizotonia solani isoleret fra knoldene. På selve knoldene kunne metabolitterne derimod ikke isoleres. De isolerede toxiner var formodentlig gliotoxin og viridin.

5.4 Opsummering

Mange biologiske bekæmpelsesorganismer (MBO) kan producere sekundære metabolitter in vitro. Antibiosis regnes da også for at være en mekanisme, der ofte er involveret i biologisk bekæmpelse af plantepatogener. Det er dog vigtigt at pointere, at in vitro metabolitproduktion i mange tilfælde ikke er korreleret med den biologisk bekæmpelseeffekt in vivo. Som det fremgår af ovenstående gennemgang er informationer omkring MBO'ers produktion af sekundære metabolitter in vivo desuden meget begrænset.

Den foreliggende viden indikerer, at for MBO'ers produktion af sekundære metabolitter i jorden, i rhizosfæren eller på frø sået i jord er tilgængelighed af næringsstoffer i form af exudater fra frø og rhizosfære eller organiske planterester af afgørende betydning. Det må formodes at MBO'ers potentielle produktion af sekundære metabolitter i og på planter generelt er under kompleks påvirkning af mange økologiske parametre så som substrat, temperatur, pH, mikrobielle interaktioner m. fl. som det også beskrevet for produktion af toksiske metabolitter i kapitel 4.

På baggrund af det begrænsede kendskab til MBO'ers in situ metabolitproduktion kan der ikke drages generelle konklusioner. Den potentielle risiko må vurderes på baggrund af den specifikke organismes økologi og kendskab til den potentielle metabolitproduktion, herunder akut toksisitet og den producerede metabolits mængde og persistens.