| Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler og toksiske metabolitter 6. Trichoderma harzianum's økologi6.1 Generelle vækstkrav og metabolitproduktion Taxonomi Den imperfekte svamp Trichoderma hazianum Rifai tilhører klassen Hyphomycetes under Deuteromycotina. Svampens perfekte stadium der henregnes til slægten Hypocrea Fr.forekommer dog kun sjældent i kultur (Rifai, 1969; Bissett, 1991). Trichoderma spp. består af mange arter så som T.virens, T.polysporum, T. viride, T.hamatum. Ud over morfolgiske forskelle mellem arter, er disse også meget forskellige f.eks. hvad angår vækstkrav og metabolitproduktion (Domsch et al., 1980; Lübeck, 1994; Widden & Scattolin, 1988). 6.1 Generelle vækstkrav og metabolitproduktionT. harzianum er på de fleste vækstmedier en hurtigtvoksende svamp, der sporulerer med små (2,8-3,2 x 2,5-2,8 µm) konidier (sporer), der er slimede og produceres enkeltvis og successivt (Rifai, 1969). Hyaline klamydosporer (diameter 6 til 12 µm) kan dannes interkalært eller terminalt på hyfesidegrene, men ses mest i ældre kulturer. Trichoderma harzianum er isoleret fra mange forskellige habitater og jordtyper og formodes at være udbredt over hele verden. T. harzianum kan leve saprofytisk på planterester i jorden som f.eks strå, kan være sekundær kolonisator på nedfaldsløv og er i stand til at bla. at nedbryde stivelse og cellulose (Domsch et al., 1980; Jeffries & Young, 1994). 6.1.1 SpiringSpiring af konidier er under påvirkning af fugtighed, temperatur, pH, CO2 og næring. Med hensyn til fugtighed kan konidier spire indenfor området -10 MPa til -7 Mpa og mættet vanddamp (100% RH), svarende til at spiring kan forekomme ved vandaktiviteter ( aw) fra ca. 0.93-0.95 og 1 (Domsch et al., 1980). Spiring synes at kræve en ekstern næringskilde, dog er den næring, der er knyttet til eksempelvis uvaskede konidier høstet fra næringsrigt substrat tilstrækkelig til at sikre en god fremspiring. Hvis næringsbetingelserne er ugunstige kræves også C02 for at få spiring. Spiringsprocenten er endvidere markant højere ved sure pH-værdier end ved neutrale pH forhold, og desuden er ældre konidier mere følsomme overfor ugunstige spiringsbetingelser end unge konidier (Danielson & Davey, 1973a). Såvel spiring som spiringshastighed er meget stærkt afhængig af temperaturen. Lifshitz et al. (1986) undersøgte spiring af konidier på vandagar ved 19°C og 26°C. Ved 19°C var ingen konidier spiret efter 10 timer og efter 26 timer var kun 26% spiret. Ved 26°C var 14% derimod spiret efter 10 timer og alle spiredygtige konidier (98%) var spiret efter 18 timer. Ved undersøgelse af spiring på PDA fandt O'Neill et al. (1996), at mere end 90% af konidierne var spiret efter 15 timer ved 15°, 20°, 26° og 30°C, mens ingen konidier var spiret efter 2 døgns inkubation ved 5° og 37°C. 6.1.2 VækstKnudsen & Bin (1990) fandt at densiteten af hyfer, der vokser ud fra alginat piller var størst i den tørreste jord med matrix-potentiale på -0.5 MPa mod den mere fugtige jord med -0.03 MPa. Overlevelsen af T. harzianum i lerjorde med matrixpotentialer spændende fra -13,5 MPa (meget tør) til -0.135 MPa blev undersøgt og var størst i den fugtige jord (Liu & Baker, 1980). I de fleste jorde er et matrixpotentiale omkring markkapicitet (ca -0.03 MPa til -0.01 MPa) optimal for plantevækst (Brady, 1984). Sådanne forhold synes også generelt at være gunstige for vækst af Trichoderma, idet Eastburn & Butler (1991) fandt, at matrix potentialer fra -0.05 MPa til -0.1 MPa gav den højeste saprofytiske aktivitet af T. harzianum, derefter aftog aktiviteten lineært med faldende matrixpotentiale fra -0.75 MPa til -1.5 MPa og i vandmættet jord (0.0 MPa) var der ligeledes ringe aktivitet af Trichoderma. Pitt & Hocking (1997), anfører at minimum aw værdier for vækst af T. harzianum er 0.91 ved 25°C, hvilket svarer til et vandpotentiale på ca. -13 MPa. Temperatur Vækst af T. harzianum er stærkt temperaturafhængig, som det fremgår af de nedenfor refererede undersøgelser. Ud af 4 isolater var kun et isolat i stand til at vokse ved 7°C, men isolatet kunne ikke sporulere ved denne temperatur på trods af en inkubationsperiode på mere end 10 døgn (Danielson & Davey, 1973b). Tronsmo & Dennis (1977) undersøgte væksten af 6 isolater af T. harzianum på 2% malt ekstrakt agar ved 2°,5°,10° og 20° C og fandt at ingen af isolaterne kunne vokse ved 2°C, men ved 5°C var 5 af isolaterne i stand til at vokse, og ved henholdsvis 10° og 20° C kunne alle isolater vokse. Selvom der er isolat variation, anses temperaturkravene for vækst af T. harzianum generelt at ligge indenfor en minimumstemperatur på 5°C og en maksimumtemperatur på ca. 36°C (Pitt & Hocking, 1997). Det er dog lykkedes Tronsmo (1989a og 1989b) at selektere et isolat (P1) der er i stand til at vokse ved en lavere temperatur, 3°-34°C. P1 er en mutant af T. harzianum 107, der oprindeligt er isoleret fra træspåner. Fastlæggelse af T. harzianums optimale væksttemperatur er på baggrund af in vitro forsøg angivet til 27-30°C. I jord er den optimale temperatur for kompetitiv kolonisering dog tilsyneladende betydeligt lavere, nemlig mellem 15-21°C (Eastburn & Butler, 1991). CO2-koncentration T. harzianum synes ikke at være negativt påvirket af forhøjet indhold af CO2. Ved neutralt til basisk pH (pH=7.5) vokser de fleste isolater af T. harzianum mere end dobbelt så hurtigt ved koncentrationer på 2% og 10% end i den naturlige atmosfære (ca. 0.03% CO2) (Danielson & Davey, 1973b). 6.1.3 MetabolitproduktionT. harzianum producerer en lang række volatile og non-volatile metabolitter (Dennis & Webster, 1971a og 1971b). Lübeck (1994) fandt på baggrund litteraturundersøgelser, at T. harzianum producerer ihvertfald 18 forskellige metabolitter. Der isoleres og karakteriseres dog til stadighed nye metaboliter så som trichocin HA og MA, harzianum A og harzianic acid, der således yderligere kan føjes til listen (Corley et al., 1994; Dickinson et al., 1995; Goulard et al., 1995; Hlimi et al., 1995; Sawa et al., 1994). De fleste karakteriserede metabolitter udviser antibakteriel og/eller antifungal virkning, men ingen af de karakteriserede metabolitter har udvist cytotoksisk effekter (Lübeck, 1994; Sawa et al.,1994). Det gælder også harzianum A, der ellers hører til gruppen af trichothecener, der ofte er mycotoksiner og potente cytotoksiner overfor eucaryotiske celler (Corley et al., 1994). Kun for ganske få af metabolitterne er den akutte toksisitet (LD50-værdi) kendt. Fire karakteriserede metabolitter har LD50 >150 mg/kg ved intraperitonal indgivelse (i.p.) og en enkelt nemlig isonitrinic acid F LD50 på 20 mg/kg (Lübeck, 1994; Sawa et al., 1994). Variation mellem isolater En del undersøgelser viser, at in vitro produktionen af sekundære metabolitter kan variere mellem isolater indenfor arten T.harzianum. Eksempelvis viste en undersøgelse af 9 isolaters produktion af volatile metabolitter, at kun 2 af isolaterne producerede antibiotika med antifungale effekter. En sammenligning af metabolitproduktionen af tre T. harzianum isolater viste produktion af henholdsvis 2, 2 og 3 metabolitter for hvert af isolaterne. En karakterisering af de isolerede metabolitter viste dog, at isolaterne producerede forskellige metabolitter (Almassi et al., 1991; Dennis & Webster, 1971; Ghisalberti, & Sivasithamparam, 1991). Økologiske parametre Temperaturer i intervallet 5° til 20°C influerede ikke på T. harzianum isolaternes evne til at producere volatile og non-volatile metabolitter in vitro (Tronsmo & Dennis, 1977 and 1978). Cooney et al. (1997) fandt, at den kvantitative produktion af 6-n-pentylpyrone på et fast medium af majskorn ikke blev påvirket af en temperaturstigning fra 15° til 20°C, derimod var der et mindre fald i produktionen ved 25°C på trods af at svampevækst blev initieret tidligere og var kraftigere ved denne temperatur. Serrano-Carreon et al. (1992) fandt, at produktionen af 6-pentyl-a-pyrone var størst i et flydende medium, der med hensyn til næringssammensætning var suboptimalt for vækst af T. harzianum. Selvom der er meget begrænset viden omkring økologiske parametres betydning for T. harzianums metabolitproduktion, må det dog formodes at produktionen generelt er under påvirkning af faktorer som substrat, temperatur, vandaktivitet, mikrobiel interaktion etc., som beskrevet i Kap 4 og 5 for henholdsvis mykotoksinproducerende svampe og for in situ metabolitproduktion af mikrobiologiske bekæmpelsesorganismer. Biologisk bekæmpelse En række undersøgelser viser, at applikation af specifikke metabolitter produceret af T. harzianum kan hæmme vækst af patogene svampe in vitro (Claydon et al., 1987; Cutler & Hill, 1994). Ved applikation af metabolitter til inficerede planter, er der opnået bekæmpelse overfor adskillige patogene svampe (Cutler & Hill, 1994). Antibiosis anses da også i flere tilfælde at være stærkt involveret i biologisk bekæmpelse med T. harzianum in vivo. In vivo detektion I forbindelse med applikation af T. harzianum til biologiske bekæmpelse af plantepatogener in vivo, er der ikke i litteraturen fundet eksempler på in situ detektion af metabolitter, der potentielt produceres af arten. Der er således ikke detekteret T. harzianum producerede sekundære metabolitter hverken i eller på planteprodukter eller i jord/rhizosfære. 6.2. Naturlig forekomst i jordbunden6.2.1 Forekomst i jordCfu/g jord T. harzianum kan være tilstede i jord som både mycelium, konidier og klamydosporer (Papaviza, 1985). Som det fremgår af Tabel 6.1 varierer det naturlige niveau af T. harzianum i jorde typisk mellem 102 cfu/g jord og til 104 cfu/g jord, hvor det laveste niveau må anses for at være mest almindeligt. Der er dog også rapporteret om koncentrationer så høje som 8 x 105 cfu/g i organiske jorde i Chile (Chet & Baker, 1981). Jordens indhold af T. harzianum er stærkt påvirkeligt af biotiske som abiotiske faktorer. Et højt indhold af såvel organisk materiale som et højt lerindhold muliggør generelt et højt populations niveau, svarende til at jorden har en højere "carrying capacity" (Alabouvette & Steinberg, 1995). Svampens aktivitet anses også generelt for at være højest ved sure pH-værdi (Chet, 1987; Harman & Taylor, 1988), men også ved relativet høje pH-værdier (8.0) kan svampen etablere et højt populationsniveau (Lo et al., 1996). Generelt giver forholdsvis høj fugtighed i jorden mellem 0.05 -0.1 MPa også optimale forhold for vækst af T. harzianum (Eastburn & Butler, 1991). Tabel 6.1. Naturlig forekomst af Trichoderma harzianum i forskellige jordtyper. Forfrugt eller afgrøde er angivet. Table 6.1. Natural occurrence of Trichoderma harzianum in soils. 6.2.2 Forekomst og etablering i rhizosfærenRhizosfære-kompetance blandt isolater af T. harzianum synes generelt at være en sjælden egenskab (Harman, 1992). Flere undersøgelser peger på, at vildtype isolater af T. harzianum generelt ikke er rhizosfære kompetente (sensu Ahmad & Baker), idet de ikke er i stand til intensivt at kolonisere de dannede rødder efter en tilførsel med frøet (Chao et al., 1986; Papavizas, 1982; Green & Jensen, 1995; Thrane et al., 1997). T. harzianum kan dog generelt udnytte eksudater fra spirende frø og derved kolonisere frøene, og oftest vil man også kunne genfinde mindre populationer af svampen 1-2 cm under frøet, formodentlig som følge af transport af konidier med vandstrømme (Chao et al.,1986; Green, 1996).Undersøgelser af rodkolonisering foretaget med et GUS-mærket isolat af det ikke rhizosfære-kompetente isolat af T3 viser, at kolonisering af rødderne er meget sporadisk og hovedsagelig knyttet til beskadigede og sårede områder af roden. Rodeksudater synes ikke generelt at kunne understøtte spiring af konidier eller vækst af mycelium og kolonisering af sunde rødder må betragtes som værende ringe (Green & Jensen, 1995; Green, 1995; Thrane et al., 1997) Rhizosfære kompetente isolater Rhizosfære kompetente isolater af T. harzianum er hovedsagelig fremkommet ved genetisk manipulation i form af UV-bestråling, fungicidmutagenbehandling eller protoplastfusion, og der er således tale om mutanter af T. harzianum vildtypeisolater (Ahmad & Baker, 1987; Ahmad & Baker, 1988; Harman, 1991; Sivan & Harman, 1991). Efter screening af en lang række T. harzianum isolater er det dog lykkedes Sivan & Chet (1989) at isolere og vise rhizosfære kompetance i et vildtypeisolat (T-35). Tabel 6.2. Populationstætheden af Trichoderma harzianum i rhizosfæren (cfu/g rhizosfærejord) angivet for forskellige isolater, plantearter og vækstbetingelser. Antagonisten er applikeret ved frøbejdsning. Table 6.2. Population density of T. harzianum in the rhizosphere (cfu/g rhizosphere soil) for different isolates, plant species and growth conditions. The antagonist were applied by seed coating. Rhizosfære kompetance bestemmes oftest ud fra målinger af cfu/g jord eller per cm rod. I tabel 6.2 er populationstætheden af T. harzianum på rodnettet angivet for forskellige isolater, plantearter og vækstbetingelser. For isolater af T. harzianum følger populationsdensiteten som oftest en C-formet kurve svarende til den største populationstæthed lige under frøet og mod rodspidsen (Ahmad & Baker, 1987). Isolatet 1295-22, der er fremkommet ved protoplastfusion af to T. harzianum isolater, er dog i stand til at kolonisere rodnettet af visse plantearter mere ensartet (Sivan & Harman, 1991). De rhizosfære kompetente isolater varierer med hensyn til populationstæthed på rødderne, og desuden kan isolaternes evne til at koloniserer rødder af forskellige plantearter variere (se tabel 6.2). Populationstætheden for isolatet 1295-22 var eksempelvis højere på rødder af majs end på rødder af bomuld (Sivan & Harman, 1991). Sure jordbundsforhold samt stigende temperatur synes generelt at fremme koloniseringen i rhizosfæren (Ahmad & Baker, 1987). Undersøgelser foretaget af Sivan & Chet (1989) tyder på, at rhizosfære kompetente isolater ikke er i stand til at kolonisere jorden udenfor rhizosfæren, idet populationen i non-rhizosfærejord var 100 gange lavere end i rhizosfære jorden og svarende til niveauet for naturlig forekomst. 6.3 Overlevelse og etablering i jordbundenOverlevelse og etablering af T.harzianum i jord og voksemedier er undersøgt for forskellige formuleringer og vækstbetingelser (Tabel 6.3). Ved tilførsel af et non-rhizosfærekompetent isolat af T. harzianum i form af konidier formuleret i klid fandt Lewis & Papavizas (1984), at T. harzianum populationen hurtigt faldt tilbage til det oprindelige niveau. Generelt vil det være svært at øge populationen på friland ud over det naturlige niveau, der findes i jorden (jordens carrying capacity), med mindre antagonisten kan udnytte rodeksudater fra en afgrøde (Lo et al., 1996) eller antagonisten tilføres i en formulering der bl.a.. sikre tilgængelig næring. I voksemedier med en lavere mikrobiel aktivitet er overlevelsen generelt stabil, og såfremt der samtidig er tilført en brugbar næringskilde kan populationen forøges, ihvertfald indenfor en kortere periode (Heiberg et al., 1996; Lumsden et al., 1989). Opsummering Ved iblanding af inokulum til markjord og andre vokstmedier er mulighederne for etablering og overlevelse formodentlig afhængig af (1) den mængde næring der tilføres med organismen, (2) om organismen er rhizosfærekompetent og (3) om tilførslen sker til jord eller til kunstige voksemedier, der har en lav mikrobiel buffer kapacitet (Alabouvette & Steinberg, 1995; Deacon, 1991). Tabel 6.3. Overlevelse af T. harzianum i jord efter iblanding af antagonisten til jord og voksemedier. Table 6.3. Survival of T. harzianum in soil after mixing inoculum of the antagonist into soil 6.4 Fyllosfære og efterhøstprodukter6.4.1 Naturlig forekomst i fyllosfæren og på høstprodukterSom det fremgår af henholdsvis tabel 2.4 og 2.5 anses T. harzianum ikke for at være naturligt forekommende på blade eller høstprodukter. En litteraturgennemgang viser dog, at arten i flere tilfælde kan isoleres fra overfladen af blade, rødder, frugter og frø (tabel 6.4.), selvom T. harzianum's naturlige miljø overvejende er jord og planterester. Fyllosfæren T. harzianum er isoleret i en ikke nærmere angivet frekvens fra fyllosfæren af kiwifrugt, drue, appelsin, eucalyptus og abrikos i Chile (Latorre et al., 1997). Fra Indien er det rapporteret, at T. harzianum er isoleret fra overfladen af raske blade af guava (Psidium guajava L.) sammen med bla. Penicillium og Aspergillus spp (Pandey et al., 1993) og fra overfladen af risblade (Gokulapalan & Nair; 1992). Trichoderma spp. herunder formodentlig også T. harzianum er endvidere isoleret i en lav frekvens fra dildblade dyrket i et dansk gartneri (Kaare Møller, pers. kom.). Efterhøst produkter Ekundayo (1987) rapporterer, at T. harzianum isoleres i 20-100% af tilfældene fra frisk okra, peberfrugt og "melon seeds", der var indsamlet fra lokale markeder i Nigeria. Efter soltørring af produkterne i 20 døgn kunne der dog ikke længere isoleres T. harzianum fra frugterne. Forekomst af T. harzianum på frø angives generelt at være lav og er formodentlig et resultat af kontaminering af frøene fra den naturligt forekommende population i jorden under høstprocessen (Pitt & Hocking, 1997; Sivapalan, 1993; Weiderbörner & Hindorf, 1989). I en enkelt undersøgelse er det påvist, at T. harzianum kan isoleres fra rådne lagrede æbler. Rådområder med vækst af Trichoderma var dog udelukkende centreret omkring væv der var såret (formodentlig af insekter) inden høst (Penrose et al.,1984). T. harzianum er også isoleret fra rådne cassava (Domsch et al., 1980). Tronsmo (1989 b) angiver at T. harzianum i ganske få tilfælde kunne isoleres fra uvaskede gulerødder lagret ved 4°C. I ovenfor citerede kilder er der overvejende tale om sjældne fund af organismen, og i de fleste tilfælde er der formodentlig tale om kontaminering med inaktive sporer. De fleste fund er endvidere rapporteret fra ikke tempererede klimaer. Tabel 6.4. Naturlig forekomst af Trichoderma harzianum i fyllosfæren og på efterhøst produkter. Table 6.4. Natural occurrence of Trichoderma harzianum in the phylloplane and on postharvest products. 6.4.2 Overlevelse og etablering på levende plantevævPå levende intakt plantevæv eksempelvis i fyllosfæren, er der en stærkt begrænset mængde næring tilstede. Desuden er der især under markforhold, men også ofte under mere kontrollerede forhold drastiske og gentagne mikroklimatiske fluktuationer i eksempelvis temperatur og luftfugtighed, hvilket stiller særlige krav til introducerede mikroorganismer, da disse ydermere skal konkurrere med den etablerede mikrobiota (Se endvidere afsnit 2.2 og 3.2). Under markforhold vil en stærkt begrænsede faktor for vækst af svampe være hurtigt opståede ændringer i substratets vandindhold. Trichoderma er således ikke i stand til at vokse på planterester, når vandpotentiale reduceres til -7 MPa, det er til gengæld svampe som Fusarium spp. og Penicillium spp. (Magan & Lynch, 1986). Antagonistens evne til at overleve skiftende perioder med henholdsvis tørre og fugtige forhold er også vigtig for organismens etableringsevnen. Efter en 6 timers periode på tørre nekrotiske løgblade var T. harzianum ikke i stand til at bekæmpe løgskimmel selvom plantematerialet i den efterfølgende periode blev holdt fugtigt. Det var derimod arter indenfor de i fyllosfæren natuligt forekommende slægter Alternaria og Cladosporium og gærsvampen Aureobasidium pullulans, også efter 3 successive perioder med skiftevis tørre og fugtige forhold. Såfremt T. harzianum er tilstede på overfladen af overjordiske plantedele, anses den for at være meget følsom overfor tørre perioder (Köhl & Fokkema, 1994). Spiring T. harzianum applikeres som oftest i en formulering, der hovedsagelig består af konidier. På grønne såvel unge som ældre blade af tomat var konidier af T.harzianum tilført i vandig suspension generelt ude af stand til at spire. Efter 7-14 dage var 4-9% af konidierne dog "opsvulmede", men ingen havde produceret spirehyfe (Elad & Kirshner, 1993). Konidier af T. harzianum observeret på blade af dild var tilsyneladende heller ikke i stand til at spire på trods af en høj luftfugtighed (Kaare Møller, pers. kom.). Det må formodes at T. harzianum isolater i almindelighed sjældent vil spire på intakt levende plantemateriale, med mindre der tilføres exogen næring. Denne sammenhæng er også almindeligt kendt både for naturligt forekommende saprofyter og for nekrotrofe patogener (Köhl & Fokkema, 1994). Se endvidere afsnit 2.2 Overlevelse og etablering Efter applikation af T. harzianum til levende og intakt plantevæv i form af blade, stængler, frugter etc. aftager populationsdensiteten generelt hurtigt (tabel 6.5). I løbet af en 2-3 ugers periode vil kun en lille procentdel af de tilførte spiringsenheder være levende, typisk < 1% (Elad & Kirshner, 1993; Migheli et al., 1994). Tabel 6.5. Overlevelse af Trichoderma harzianum i fyllosfæren og på frugt og grønsager Table 6.5. Survival of Trichoderma harzianum in the phyllosphere and on fruits and vegetables. I en række undersøgelser under naturlige betingelser er antallet af cfu efter to eller flere applikeringer sammenholdt med populationen af Trichoderma i ubehandlede parceller. Jordbærplanter blev i løbet af sommeren sprøjtet tre gange med T. harzianum suspensioner. Ca. 10 måneder efter den sidste behandling kunne der isoleres Trichoderma spp. fra behandlede plots. (Tronsmo, 1986). Forsøget viser, at Trichoderma spp i et vist omfang kan overvintre på jordbærplanter. I undersøgelser vedrørende biologisk bekæmpelse af Botrytis cinerea på druer, blev der 11 dage efter den sidste af 3 sprøjtninger isoleret 3.4 x 105 cfu /bær i de T. harzianum behandlede plots mod kun 2 x 103 cfu/bær fra usprøjtede plots (Elad,1994). Tronsmo & Dennis (1977) udsprøjtede T. harzianum til jordbærplanter, med sidste udsprøjtning 14 dage før høst. Trichoderma spp. blev isoleret fra behandlede plots i størrelsesordenen 102 -103 cfu/g friske bær, mens der blev ikke blev isoleret Trichoderma fra ubehandlede plots. Efter 2 sprøjtninger af agurkeplanter blev der isoleret ca. 5 x 105 per blad og 5 x 104 cfu/frugt mod ca. 1 x 104 cfu/blad og 1.5 x 103 cfu/frugt fra ubehandlede plots ved målinger udført 22 dage efter sidste sprøjtning (Elad et al., 1993). Undersøgelserne viser, at der specielt over kortere perioder kan etableres en signifikant højere population såvel i fyllosfæren som på frugter i plots der er sprøjtet med sporesuspensioner af T. harzianum. I forbindelse med disse undersøgelser var det ikke muligt at skelne mellem introducerede populationer T. harzianum og evt. naturligt forekommende populationer af T. harzianum. I relation til T. harzianum's ringe mulighed for at spire på intakt plantevæv, vil populationer formodentlig primært bestå af sporer. Økologiske parametre Overlevelsen af T. harzianum populationen på levende plantevæv afhænger især af luftfugtighed og temperatur, men faktorer som planteart, bladalder, planternes ernæring etc. har også betydning, ligesom både 2- og 3-faktor vekselvirkninger mellem flere af parametrene kan influere på overlevelsen (Elad & Kirshner, 1993). Luftfugtigheden er en af de mikroklimatiske parametre, der i høj grad påvirker overlevelsen T.harzianum. Således giver en høj relativ luftfugtighed (RH) på >95% en bedre overlevelse af T. harzianum på blade af tomat, peber og geranium end en RH<85% (Elad & Kirshner, 1993). Undersøgelser tyder endvidere på, at T. harzianum isolater kan variere med hensyn til overlevelsesevne i fyllosfæren (Gaulino et al., 1987; Latorre et al., 1997; Mighelli et al., 1994). Formulering Produktion og formulering af T. harzianum påvirker formodentlig konidiernes evne til overlevelse i fyllosfæren under markforhold (Harman et al., 1996; McKenzie et al., 1991; Elad, 1994). Eksempelvis kan tilsætning af næringsstoffer til formuleringen i form af malt og Pelgel (carboxymethylcellulose og gum arabic) i visse tilfælde fremme overlevelse og aktivitet af T. harzianum i fyllosfæren (Gullino et al., 1987; Harman et al., 1996; McKinzie et al., 1991). Biologisk bekæmpelse Gaulino et al. (1987) undersøgte 23 T. harzianum isolaters bekæmpelseseffektivitet overfor B. cinerea på druer ved 15°C og 28°C. Der var generelt bedre bekæmpelse ved den høje temperatur, hvilket dog var betinget af en høj luftfugtighed, et forhold der generelt ikke er gældende i områder, hvor der dyrkes vin under markforhold. Elad et al., (1993) fandt at temperaturer >20°C i kombination med RH mellem 80 og 97% gav de bedste betingelser for biologisk bekæmpelse af B. cinerea på agurk i kommercielle væksthuse. Isolat 1295-22 I forhold til T.harzianum isolaters generelt set ringe evne til overlevelse og etablering i fyllosfæren, synes isolat 1295-22, der er en protoplast-fusion mellem to T. harzianum isolater, at indtage en særstilling. Lo et al (1997 a) fandt at populationsniveauet efter udsprøjtning af 1295-22 til fyllosfæren af græs (Agrostis palustris Huds.) blev opretholdt i minimum en uge (se tabel 6.5) og ved mikroskopering viste det sig, at 1295-22 er i stand til at spire og danne mycelie på græsblade (Lo et al., 1997 b). Om 1295-22 isolatets tilsyneladende fyllosfærekompetance er gældende for andre plantearter er uvist, men ved applikation af 1295-22 til vinplanter under markforhold, var der ofte ringe overlevelse af isolatet (Harman et al., 1996). McKenzie et al. (1991) undersøgte overlevelsen af forskellige T. harzianum isolater (vildtyper, fungicidresistente mutanter og isolater fremstillet ved protoplastfusioner) på blade af tomat og vin. For alle isolater var der en stærkt faldende overlevelse over en 3 ugers periode, og vildtype isolater overlevede generelt bedre end mutanter og protoplastfusionerede isolater. 6.4.3 Overlevelse og etablering på nekrotisk eller såret plantevævNekrotisk plantevæv og sårflader udgør ved sammenligning med levende intakt plantevæv habitater, hvor der generelt er mere næring til rådighed for aktivitet og vækst af svampe. På nyligt opståede sårflader vil det desuden være muligt for den applikerede antagonist at etablere sig under forhold, hvor der er mindst mulig konkurrence, dels fra andre saprofyter og dels fra patogener (Köhl & Fokkema, 1994, afsnit 3.2). Kolonisering af sårflader T. harzianum er i stand til at kolonisere og sporulere på sårflader af tomatstængler efter inkubation ved 11°C over en periode på 11 døgn. Flere isolater blev testet og enkelte af disse var mere effektive end andre ved den forholdsvis lave inkubationstemperatur (Eden et al., 1996). Overlevelse O'Neill et al. (1996) fandt, at overlevelsen af T. harzianum i sårflader på tomatstængler blev reduceret over en 14 dages periode i de sår, der ikke var inficeret med Botrytis cinerea. Der blev endvidere fundet en bedre overlevelse ved 10°C og RH ca. 85-90% end ved 10°C og en RH på 60%. Biologisk bekæmpelse Kun ved samtidig eller tidligere inokulation med T. harzianum var det muligt at få en god bekæmpelse af B. cinerea i sårflader. Hvis sårflader først inokuleredes med B.cinerea efterfulgt af inokulering med T. harzianum 1 døgn senere, var der ingen reduktion i infektionsgraden (O'Neill et al., 1996). Eden et al. (1996) inokulerede sår med B. cinerea, så hele sårfladen var dækket og inokulerede derefter sårene med antagonistiske isolater, så kun halvdelen af sårfladen var dækket. Ved halv inokulering med T. harzianum kunne sygdomsreduktion ikke opretholdes. Det var derimod muligt ved halv inokulering med antagonistiske isolater af Cladosporium. Disse resultater tyder på at, T. harzianum ikke kan klare sig i konkurrencen med B. cinerea såfremt patogenet er etableret på sårfladen. 6.5 Spredning i relation til applikationmetodeFlere faktorer influerer på, om T. harzianum spredes fra plantedele, hvortil antagonisten direkte er applikeret og til andre plantedele, og i givet fald i hvor stort omfang T. harzianum spredes. Spredning vil bla. være afhængig af applikationsmetode, herunder dosis og behandlings-frekvens, antagonistens formulering, saprofytisk konkurrrenceevne, rhizosfærekompetance, generelle muligheder for overlevelse i det pågældende habitat og af høst- og bearbejdningsprocesser. 6.5.1 Spredning fra jord til ovenjordiske plantedeleSelvom T. harzianum er en udpræget jordbåren saprofyt, sker der i det naturlige miljø en spredning af svampen fra jord til forskellige ovenjordiske plantedele, som det fremgår af afsnit 6.4.1. Spredningmekanismer som beskrevet i afsnit 2.4. er formodentlig involveret. Der er kun få undersøgelser, der kan give information om spredning af T. harzianum fra jord til overjordiske plantedele, efter at antagonisten er introduceret til jord eller voksemedier. Iblanding Et Gus-mærket T. harzianum isolat af 1295-22 blev iblandet markjord svarende til 106 konidier per g. jord. Syv til ti dage efter såning kunne det mærkede isolat i ingen eller meget få tilfælde detekteres på græsblade (Lo et al., 1997b). Det skal i den forbindelse nævnes, at isolatet 1295-22, i modsætning til andre kendte T. harzianum isolater, tilsyneladende er fyllosfærekompetent, ihvertfald på græsblade. Samme isolat blev iblandet jord med en naturlig forekomst af Trichoderma estimeret til 1.8 x 104 cfu/g. Efter iblanding blev populationen signifikant forøget til 1 x 105 cfu/g. En kvantificering af Trichoderma populationen i græsfyllosfæren 17 dage efter såning viste, at T. harzianum iblanding ikke havde medført en signifikant stigning i fyllosfærepopulationen ved sammenligning med ubehandlede kontroller (Lo et al., 1997 a). Udsprøjtning På KVL er der foretaget en endnu ikke publiceret undersøgelse af muligheden for spredning af T. harzianum fra sphagnum til småplanter af dild. Dildfrø blev sået i sphagnum, hvorefter jordoverfladen blev vandet med en sporesuspension af det biologiske middel Supresivit (T. harzianum). Efter 14 døgns inkubation i klimakammer ved 20°C og meget høj luftfugtighed (.100% RH) blev T. harzianum i form af levedygtige sporer detekteret på småplanter i tilknytning til plantens vækstpunktet og desuden på bladspidser og ved bladnodier (Møller pers. kom.). T. harzianum menes at være spredt til fyllosfæren primært via vækstpunktets kontakt med jorden, hvorfra antagonisten sekundært er spredt til bladnodier og bladspidser, formodentlig via kondensvand. Den meget høje luftfugtighed i klimakammeret har formodentlig været medvirkende til overlevelsen i fylloplanet. Som nævnt tidligere var konidierne uspirede. Opsummering På baggrund den nuværende viden kan det konkluderes, at T. harzianum tilført jord/voksemedier ved iblanding eller udsprøjtning kan spredes til fyllosfæren, men at frekvensen generelt må anses for at være lav. Bejdsning Der findes ingen undersøgelser vedrørende eventuel spredning til fyllosfæren, såfremt T. harzianum er applikeret til jord via frøbejdsning. Muligheden for at introducere en stor population af antagonisten er dog ikke nær så stor som ved iblanding og udsprøjtning. Det skyldes, at det med bejdsning kun er muligt at applikere antagonisten en gang ved vækstsæsonens begyndelse i modsætning til eksempelvis sprøjte- applikering, og at den tilførte mængde per m2 er begrænset af antal cfu per frø og af antal planter per m2 (se evt. tabel 3.2). Ved bejdsning af spinat med industrielt udstyr var en dosering på 103 konidier af T. harzianum per frø tilstrækkelig til at bekæmpe af Pythium ultimum og Rhizoctonia solani ved fremspiring (Cliquet & Scheffer, 1996). Med 50 planter per m2 (optimalt) svarer dette til, at der introduceres ca. 1 x 105 cfu af T. harzianum per m2. Ved sammenligning med den estimerede, naturlige population af T. harzianum per m2 i pløjelagets dybde, der oftest vil være af størrelsesordenen 107- 109 cfu/m2 (se tabel 6.1), udgør T. harzianum introduceret med frø <1% af den naturlige population. I relation til den samlede naturlige microbiota, der er estimeret til 1013 til 1014 cfu per m2, er der tale om introduktion af en meget lille population til et økologisk system med en høj bufferkapacitet. 6.5.2 Spredning til rodfrugter efter frøbejdsningFor grønsager som radise, gulerod, persillerod etc., hvor roden udgør den spiselige del af planten, vil viden om MBO'ers eventuelle kolonisering af de høstbare rødder være af interesse. Resultater fra mange undersøgelser tyder på, at de fleste T.harzianum isolater formodentlig ikke er rhizosfærekompetente og derfor ikke i væsentlig grad kan kolonisere rødder efter applikation med frøet (se afsnit 6.2.2.). Det er derimod mere sandsynligt, at bejdsning med og for så vidt også iblanding og udsprøjtning med rhizosfærekompetente isolater til jord kan resultere i en forøget population af T. harzianum på rodfrugter. Dette er dog ikke undersøgt med eksperimentelle data i litteraturen. Ahmed & Baker (1987) viste, at der på rødder af 8 dage gamle radiseplanter kunne isoleres en forholdsvis stor population af T. harzianum fra de unge radiserødder efter bejdsning med det rhizosfærekompetent isolat (T95). En eventuel høj koloniseringsgrad af den spisemodne rod blev dog ikke undersøgt. 6.5.3 Spredning efter applikation til ovenjordiske plantedeleT. harzianum har klæbrige sporer, der ikke så typisk frigøres og spredes med vinden, specielt ikke ved sammenligning med arter indenfor f.eks Penicillium og Cladosporium, der karakteriseres som "støvende" svampe. Udsprøjtning I en række væksthusforsøg, hvor T. harzianum blev udsprøjtet på
agurkeplanter flere gange i løbet af vækstsæsonen, blev der etableret en høj
population på blade og frugter (ca. 103 cfu pr cm2). Samtidig blev
det konstateret at T. harzianum sekundært var blevet spredt til ubehandlede
agurkeplanter i væksthuset (Elad et al., 1993; Elad et al., 1996). I
forsøg udført under markforhold med jordbær, vin, agurk og ruscus, blev der i
forbindelser med gentagne sprøjtebehandlinger med T. harzianum
konidiesuspensioner fundet forholdsvis høje populationer af T. harzianum i
fyllosfæren af planter i de nærliggende ubehandlede kontrolparceller (Elad, 1994; Elad
& Kirshner, 1992; Tronsmo, 1986). Dette tyder på, at der under markforhold kan ske en
spredning til nærliggende ubehandlede planter især efter flere T. harzianum
sprøjebehandlinger indenfor samme vækstsæson. Det skal dog nævnes, at det i
forbindelse med disse undersøgelser ikke var muligt at skelne mellem introducerede
populationer T. harzianum og evt. naturligt forekommende populationer af T.
harzianum. |
|||