Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frøIndholdsfortegnelse1 Introduktion 2 Produktion og formulering af Gliocladium roseum præparater
3 Undersøgelse af formulerede Gliocladium roseum præparaters
shelf-life 4 Undersøgelse af formulerede Gliocladium roseum konidiers
spiringsaktivitet 5 Gliocladium roseum præparaters aktivitet i Fusarium
culmorum bioassay 6 Gliocladium roseum præparaters aktivitet i Bipolaris
sorokiniana bioassay 7 Gliocladium roseum præparaters bekæmpelsesaktivitet i Pythium
ultimum bioassay 8 Undersøgelse af Gliocladium roseum formuleret og lagret
på frø: shelf-life og bekæmpelse i bioassay 9 Undersøgelse af Gliocladium roseum's aktivitet i
markforsøg 10 Overlevelse af Gliocladium roseum under markforhold efter
udbringning med frø 11 Afledte aktiviteter ForordRapporten indeholder resultater af et projekt der har haft til formål at udvikle et biologisk bejdsemiddel til frø som alternativ til kemisk bejdsning af specielt korn. Undersøgelserne er udført af forskningsadjunkt, cand. agro. Ph.D. Birgit Jensen med kompetent assistance fra laborant Karin Olesen og med lektor Dan Funck Jensen og projektansvarlig forskningsadjunkt, Ph.D. Inge M.B. Knudsen som projektvejledere på Sektion for Plantepatologi, Institut for Plantebiologi, Den Kongelige Veterinær- og Landbohøjskole i perioden 01.10.94-30.5.97. Projektet er finansieret af Miljøstyrelsen som et renere teknologi-projekt. Projektet har været fulgt af en styringsgruppe med følgende medlemmer: Claus Frier, Miljøstyrelsen, Klima- og Bioteknologikontoret Holger Pedersen, Miljøstyrelsen, Klima- og Bioteknologikontoret Hans Kristensen, Landskontoret for Planteavl Niels Bohse Hendriksen, Danmarks Miljøundersøgelser, Roskilde Anders Jensen, Direktoratet for Arbejdstilsynet Dan Funck Jensen, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole Inge M.B. Knudsen, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole Birgit Jensen, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole SammendragBaggrund Baggrund og formål Frøbårne sygdomme forårsager på verdensplan store skader på kultur-planterne. Selvom kemisk bejdsning i vid udstrækning har givet en effektiv bekæmpelse af frøbårne sygdomme på korn, er der visse begrænsninger og miljømæssige ulemper forbundet med anvendelse af kemiske pesticider. Det har forstærket efterspørgslen efter alternativer til kemisk bejdsning, og frøbejdsning med antagonistiske mikroorganismer kan være et sådant alternativ. Lovende isolater er som oftest selekteret blandt flere hundrede isolater på baggrund af høj effektivitet under laboratorie og/eller markforhold. Da biologiske bekæmpelsesesmidler er baseret på levende organismer, har vanskeligheder omkring produktion, formulering og shelf-life eller manglende effektivitet ved applikering under markforhold dog ofte vist sig at komplicere kommercialiseringen af sådanne produkter. Formål Formålet med dette projekt er at udvikle et biologisk bejdsemiddel mod frøbårne patogener primært i korn som alternativ til kemisk bejdsning og derved opnå en miljømæssigt renere udsæd. I projektet fokuseres undersøgelserne på udvikling af produktions- og formulerings-metoder, der sikrer tilstrækkelig shelf-life (evne til at overleve lagring) og aktivitet af de udviklede præparater samt evaluering af disses effektivitet under markforhold. I projektet benyttes et lovende isolat af Gliocladium roseum (IK726), der er selekteret på baggrund af høj bekæmpelseseffektivitet under markforhold. Størstedelen af arbejdet er koncentreret om biologisk bekæmpelse af sygdomme forårsaget af de frøbårne patogener, Fusarium culmorum og Bipolaris sorokiniana. Produktion og formulering Udvikling af G. roseum isolat IK726 Et biologisk bekæmpelsesmiddel baseret på IK726 kan kun fremstå som et realistisk alternativ til de kemiske midler, såfremt aktive spirings-enheder af antagonisten kan masseproduceres og formuleres reproducer-bart og økonomisk rentabelt. Biomasse af IK726 ønskes desuden for-handlet i nedtørret form, primært for at mindske risikoen for kontamine-ring, men også for at få et mere anvendeligt og håndterbart produkt. G. roseum producerer to typer af spiringsenheder: hyfer og ukønnede sporer (konidier). Da hyferne ikke overlever hurtig nedtørring er alle undersø-gelser vedrørende IK726 baseret på konidier. IK726 producerer villigt konidier både ved fast (FaF) og ved flydende fermentering (FlF). Ved opformering på sphagnum/ klid (FaF) med en samlet produktionstid på 16-17 døgn er der opnået en reproducerbar produktion på 3-8 x 108 cfu per g præparat. Ved formulering af konidier fra FaF i molersprodukter er der med en samlet produktionstid på 15 døgn opnået 2.1-6 x 109 cfu/g præparat. Ved en tilsvarende formulering af konidier fra FlF i moler er der med en samlet produktionstid på 9 døgn opnået 2.0-6.5 x 109 cfu/g præparat. Indholdet af cfu/g i G. roseum præparaterne er således fuldt på højde med eller højere end indholdet af aktive enheder i allerede markedsførte præparater baseret på f.eks Trichoderma spp. FlF der er en veletableret teknik til opformering af mikroorganismer generelt, men også FaF, der allerede benyttes til produktion af en række af de kommercielle biologiske bekæmpelsesmidler baseret på svampe-antagonister, kan således med højt udbytte anvendes til opformering af IK726. Ved valg af produktionsmetode bør det indgå i overvejelserne, at flere undersøgelser tyder på, at IK726 konidier fra FaF er mere robuste med hensyn til nedtørringstolerance og shelf-life end konidier fra FlF. Shelf-life af præparater Shelf-life af biologiske bekæmpelsesmidler er en central faktor for et præparats kommercielle succes. Det anbefales derfor, at produkterne skal kunne lagres, helst uden køling, i minimum 1 år uden væsentlig tab af overlevelse. Talrige test af IK726´s overlevelse efter lagring ved tem-peraturer fra 4° til 10°C har vist, at lagring ved denne temperatur er uafhængig af produktions- og formuleringmetode, idet shelf-life for alle testede standard- og optimerede præparattyper har været stabil i mere end l år. Stabilisering af IK726´s shelf-life ud over 3-4 måneder ved 20°C er derimod langt vanskeligere, hvilket også er et erkendt problem for mange kommercielle præparater. Ved hjælp af optimerede produktions- og formuleringsmetoder er IK726´s evne til at overleve lagring ved 20°C dog blevet stærkt forbedret. Således kan overlevelsen i både sphagnum/ klid- og molerspræparater nu opretholdes på et stabilt højt niveau i op til et år ved denne temperatur. Med stabilt shelf-life i op til et år, synes mulighederne for kommerciel udnyttelse af G. roseum (IK726) således at være gode. Spiring af lagrede konidier Selvom nedtørring af IK726 konidier resulterer i en signifikant reduktion af spiringsprocenten og spiringshastighed ved sammenligning med friskhøstede konidier, så påbegynder både friske og tørrede konidier spiring indenfor 4 timer. Ved sammenligning med mange svampearter anvendt til biologisk bekæmpelse spirer konidier af IK726 relativt hurtigt. Det kan være en betydende faktor ved bekæmpelse af spirings-skadende patogener som Pythium spp, der påbegynder spiring 0-4 timer efter såning af frø. Biologisk bekæmpelsesaktivitet af lagrede konidier En høj og stabil bekæmpelseseffekt af lagrede præparater er en væsentlig forudsætning for, at biologiske bekæmpelsesmidler kan anvendes med succes i jordbrugserhvervet. Kvaliteten af IK726 præparater, målt som bekæmpelseseffektivitet overfor F. culmorum og B. sorokiniana, er derfor evalueret i en række kontrollerede klimakammerforsøg med byg- og hvedeplanter. Graden af bekæmpelse er relateret til præparaternes formulering, lagertemperatur og lagertid. For lagring ved 4°C har såvel standard som optimerede formuleringer af sphagnum/klid og molerspræparater udvist stabil og effektiv bekæmpelse af F. culmorum uafhængig af om præparaterne er lagret få uger eller i op til et år. For vellykket lagring ved 20°C er formuleringen af IK726 meget afgørende. Med standardformuleringer af sphagnum/klid og molerspræparater kan bekæmpelseseffektiviteten opretholdes på højt niveau i ca. 2 måneder efter lagring ved denne temperatur. Med optimeret formulering kan der derimod opretholdes en høj og stabil bekæmpelseseffektivitet over en testperiode på 10 måneder med lagring ved 20°C. Bejdsning med IK726 er endvidere kompatibel med en række klæbemidler, hvilket kan være værdifuldt ved integration af IK726 med eksisterende frøbehandlings-metoder. Dosis-respons Der er udarbejdet dosis-respons kurver for sammenhængen mellem antal spiredygtige IK726 konidier på frøene og den procentvise bekæmpelse af F. culmorum og B. sorokiniana. For konidier lagret ved 4°C er der en stærk lineær sammenhæng (r=0.73) mellem dosis (cfu/frø) og den procentvise bekæmpelse af F. culmorum. Det er estimeret, at ca. 5 x 103 cfu/frø er tilstrækkelig for en effektiv bekæmpelse (>80%). For frisk-høstede konidier er der ligeledes en stærk positiv lineær sammenhæng mellem dosis og bekæmpelse af F. culmorum (r=0.95), og den effektive dosis er af samme størrelsesorden. Det viser, at bekæmpelseseffekten er reproducerbar for begge konidietyper og at effektiviteten af lagrede konidier generelt er lige så høj som for friskhøstede konidier. Med hensyn til bekæmpelse af B. sorokiniana, har en dosering på 1 x 104 cfu/frø af såvel friske som lagrede konidier af IK726 generelt givet en effektiv bekæmpelse (>80%). En dosering på ³104 cfu/frø bør derfor være tilstrækkelig til at sikre en effektiv beskyttelse mod begge frøbårne patogener. Ved undersøgelser af direkte effekter af IK726 på plantevæksten, er der for doseringer fra 101 til 4 x 104 cfu/frø ikke fundet signifikante effekter på hverken plantefremspiring eller plantetørvægt. Det er således muligt at øge doseringen af IK726 på frø væsentligt, eksempelvis i forbindelse med bekæmpelse af andre patogener, uden at influere negativt på planteetableringen. Shelf-life og aktivitet af konidier lagret på frø En kommercialisering af biologisk frøbejdsning vil være et mere realistisk alternativ til de kemiske midler, hvis frø bejdset med G. roseum kan lagres. Ved en specifik anvendelse af IK726 til bejdsning af korn vil lagertemperaturen under nordiske forhold typisk ligge på 15-20°C. I praksis lagres udsæd af vårbyg maksimalt i 8 måneder, mens lagerkravet til vinterhvede maksimalt er 3 måneder. IK726 har med optimeret formulering overlevet stabilt på bejdsede frø lagret ved 20°C i en testperiode på 6 måneder. I en testperiode på 7½ måned har bekæmpel-sen af Bipolaris sorokiniana også været høj og stabil for bejdsede frø lagret ved denne temperatur. På baggrund af de praktiske krav til opbevaring af bejdset korn synes der derfor at være gode muligheder for at anvende IK726 til bejdsning i kommerciel skala. Markforsøg Manglende effektivitet og stabilitet i sygdomsbekæmpelsen, når biologisk bekæmpelse overføres fra laboratoriet til naturlige vækstforhold er ofte et problem. Der er i projektperioden udført 6 markforsøg, der entydigt viser, at bejdsning af både byg og hvede med G. roseum (IK726) giver en signifikant bekæmpelse af F. culmorum. IK726 har udvist antagonisme overfor F. culmorum ved lave jordtemperaturer, der er typiske for korndyrkning under danske forhold. Således er der i forsøgene målt jordtemperaturer fra 6.2°C og op til 12°C i etableringsfasen. Væksthusforsøg har desuden vist, at IK726 også bekæmper F. culmorum effektivt i temperaturområdet 10°- 20°C. Markforsøgene har endvidere bekræftet, at lagrede formuleringer af IK726 bekæmper F. culmorum lige så effektivt som friskhøstede konidier af antagonisten. Ud fra stabilitets- og effektivitetskrav synes anvendelse af IK726 til biologisk bejdsning af korn at være et realistisk alternativ til kemisk bejdsning, specielt med henblik på bekæmpelse af F. culmorum. IK726's potentiale overfor andre patogener. Indledende forsøg har vist, at IK726 også kan bekæmpe andre plantepatogener. Screeningsundersøgelser vedrørende bekæmpelse af stinkbrand (Tilletia caries) i hvede har vist, at bejdsning med IK726 resulterer i en reduktion af procent brandaks i både mark- og væksthusforsøg. I klimakammerforsøg har bejdsning af roefrø med G. roseum (IK726) desuden resulteret i en signifikant reduktion af rodbrand forårsaget af jordbårent inokulum af Pythium ultimum. Undersøgelser vedrørende reisolering af G. roseum fra byg- og hvederødder indikerer endvidere, at IK726 er rhizosfære kompetent (kan koloniserer rodnettet fra frø). Det forstærker IK726´s potentiale til bekæmpelse af jordbårne patogener yderligere, idet rhizosfære kompetance anses for en væsentlig parameter for effektiv bekæmpelse af sådanne patogener via frøbejdsning. Videnformidling Via efteruddannelese af konsulenter og landbrugslærere indenfor jordbrugssektoren, har projektet bidraget med videnopbygning indenfor praktisk anvendelse af biologiske bekæmpelsesmidler. En sådan viden er helt afgørende for succesfuld implementering af biologisk bekæmpelse i land- og havebrug. Desuden er væsentlige dele af projektet præsenteret i forbindelse med undervisning på KVL og i internationalt forum ved flere lejligheder ligesom udvalgte resultater er publiceret i proceedings. Videre udvikling af IK726 og firmainteresser Væsentlige dele af projektet, der omhandler produktion og formulering af IK726, forventes at have partenterbar nyhedsværdi, hvilket øger mulighederne for en kommerciel udnyttelse af IK726 (jvf. konklusion). En række samarbejdsrelationer og projekter skal sikre den fremtidige udvikling af IK726. Der er således indgået en samarbejds-og optionsaftale med frøfirmaet Dæhnfeldt a/s vedrørende udvikling og anvendelse af IK726 til bejdsning af grøntsags- og blomsterfrø. Et 3- årigt projekt er påbegyndt i 1998 med det formål at udvikle biologisk bekæmpelse til praktisk anvendelse overfor udsædsbårne og jordbårne sygdomme, specielt i korn. Her vil IK726´s effekt overfor flere frøbårne sygdomme bl.a. blive testet i markforsøg. I forbindelse med ovennævnte projekt er der ydermere indledt et samarbejde med Cillus a/s vedrørende biologisk bejdsning af korn. Cillus a/s importerer, formulerer og eksporterer plantebeskyttelsesmidler (kemiske og biologiske) med hovedvægt på frøbejdsning af korn og græsser. Desuden afprøver Danisco Seed i øjeblikket IK726 til bejdsning af sukkerroefrø, og et mere formaliseret samarbejde forventes i løbet af 1998/99. Konklusion I projektet "Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frø" er der opnået resultater, der kraftigt understreger, at der er gode muligheder for at udnytte G. roseum (IK726) til kommerciel frøbejdsning mod frøbårne sygdomme i korn. IK726 kan således produceres billigt og reproducer-bart og formulerede præparater har stabilt shelf-life i op til 1 år efter lagring ved temperaturer op til 20°C. Bekæmpelseseffektiviteten af lagrede IK726 præparater har i væksthusforsøg været høj og reproducerbar. Endvidere har en serie markforsøg vist, at bejdsning med IK726 giver høj og stabil bekæmpelseeffektivitet under varierende miljøforhold. Endelig kan IK726 lagres på frø i mere end ½ år ved 20°C uden tab af bekæmpelseseffektivitet. En nyhedsundersøgelse foretaget af Plougmann, Vingtoft & Partners fastslår, at der er gode muligheder for patentbeskyttelse af væsentlige dele af den teknologi, der er udviklet i forbindelse med projektet. Derudover peger projektet frem mod nye anvendelsesområder for IK726. SummaryBackground and objectives Background Seed borne disease of cultivated plants are of major importance world wide. While in general, chemical seed treatment effectively controls seed borne diseases of cereals, certain limitations and environmental disadvantages have been associated with the use of chemicals. This has increased the demand for alternatives to chemical control and coating seeds with antagonistic microorganisms may be such an alternative. Many isolates showing high efficacy under laboratory and/or field conditions have been selected as promising biological control agents (BCAs). However, difficulties with production, formulation and shelf-life or lack of efficacy when applied under field conditions have often complicated and limited the commercialization of such organisms. Objectives The aim of this project is to develop a BCA for seed treatment primarily in order to control seed borne diseases of cereals as an alternative to chemical treatment, thereby providing an environmentally safer product. The research focuses on the development of methods for production and formulation which ensure adequate shelf-life and activity as well as high biocontrol efficacy of the BCA under field conditions. The project utilizes a promising isolate of Gliocladium roseum (IK726), selected on the basis of high biocontrol efficacy in the field. The main targets of the investigations are the biocontrol of the seed borne pathogens, Fusarium culmorum and Bipolaris sorokiniana. Development of G. roseum isolate IK726 Production and formulation A BCA based on IK726 can only be an alternative to chemicals if active propagules can be mass produced and formulated in a reproducible and cost-effective way. Furthermore, IK726 must be marketed as a dried formulation in order to avoid contamination and to ease handling and delivery. G. roseum produces two types of propagules: hyphae and asexual spores (conidia). Since hyphae do not survive rapid drying, all investigations concerning IK726 use conidia. IK726 produces abundant conidia both in solid (SF) and in liquid fermentation (LF). A yield of 3-8 x 108 cfu/g preparation is repeatedly produced on sphagnum/peat (SF) with a total production time of 16-17 days (drying included). For conidia produced by SF followed by formulation in clay products, yields of 2.1-6 x 109 cfu/g preparation are obtained. By formulating conidia from LF with similar clay products, 2.0-6.5 x 109 cfu/g preparation are obtained with a production period of 9 days. The cfu content per g preparation of IK726 is actually as high or even higher than the content of active propagules in available commercial products based on for example, Trichoderma spp. Several experiments have shown that IK726 conidia produced by SF are more robust with regard to dessication tolerance and shelf-life than those produced by LF and this should be taken into account when deciding upon the production method. Product shelf-life An adequate shelf-life is a crucial factor for commercial success of a BCA. A minimum shelf-life of 1 year, with minimal losses in viability, preferably without refrigeration, is therefore recommended. Several viability tests of dried IK726 preparations stored at 4°C to 10°C have revealed that viability at this storage temperature is independent of production method and formulation, since shelf-life of both standard and optimized formulation have been stable for more than 1 year. However, the achievement of stable shelf-life of more than 3-4 months at 20°C is much more difficult. Significantly this problem has only partly been solved for many of the commercial products already on the market. With IK726, however, by optimization of production and formulation methods it is now possible to maintain viability at a high level for about 1 year at 20°C both for sphagnum/peat and for clay formulations. The stabilization of shelf-life at temperature ranging from 4° til 20° has thus improved the feasibility for commercial exploitation of IK726. Germination of conidia Although, drying conidia of IK726 results in significant reduction in germination rate and in germination speed compared to freshly harvested conidia, both fresh and dried conidia start to germinate within 4 hours. Compared to most fungi used for biocontrol, the conidia of IK726 germinate relatively quick and this can be a significant factor when control of pathogens that affect plant establishment such as Pythium spp.- which start to germinate 0-4 hours after sowing the seed - is required. Biological control activity A high and stable control efficacy of stored BCAs is a significant factor for successful application of such products in practical agriculture. The quality of IK726 preparations has been evaluated in controlled growth chamber experiments with wheat and barley by measuring the biocontrol efficacy against F. culmorum and B. sorokiniana. Control efficacy is related to formulation, storage temperature and storage time of preparations. For storage at 4°C both standard and optimized formulations of sphagnum/peat and clay preparations have shown stable and efficient biocontrol of F. culmorum independent of length of the storage period (from a few weeks and up to one year). For successful storage at 20°C, the method of formulation of IK726 is decisive for retainment of biocontrol efficacy. Thus, with standard formulation of sphagnum/peat or clay preparations, control efficacy is high and stable only for approximately 2 months. By optimized formulation, however, stable and high control efficacy was retained during a test period of 10 months with storage at 20°C. Moreover seed coating with IK726 is compatible with several stickers. This can be a valuable trait allowing the integration of IK726 with existing seed coating technologies. Dose-response relationship Dose-response curves for the relationship between dosage of germinable conidia of IK726 per seed and the percentage control of F. culmorum and B. sorokiniana have been established. For conidia stored at 4°C a strong linear relationship (r=0.73) exists between dosage (cfu/seed) and control efficacy against F. culmorum and it is estimated that about 5 x 103 cfu/seed is sufficient for effective control (>80%). For freshly harvested conidia a similarly strong relationship exists (r=0.95) and the effective dose is of the same magnitude. This proves that control efficacy is reproducible for both type of conidia and that stored conidia are as effective as freshly harvested conidia when tested in green house experiments. For control of B. sorokiniana a dosage of approximately 1 x 104 cfu/seed of both fresh and stored conidia of IK726 gives effective control (>80%). A dosage of ³104 cfu/seed should, therefore, be sufficient to ensure effective protection against both pathogens. Possible direct effects of IK726 on plant establishment have also been examined. Varying the doses from 101 to 4 x 104 cfu/seed had no significant effect on plant emergence or plant dry weight. Thus, it is possible to increase the dosage of IK726 on seeds, for example in order to control other pathogens, without any negative influence on plant establishment. Shelf-life and activity of conidia stored on seed Commercialization of biological seed treatment will be a more attractive alternative to chemicals if seed coated with IK726 can be stored. For cereal seed, in the Nordic countries, this means storage temperatures of about 15-20°C. In practice, seed of spring barley is maximumly stored for 8 months and seed of winter wheat is rarely stored for more than 3 months. Viability on seeds has been tested for about six months. In this period shelf-life has been stable on seeds stored at 20°C. Moreover the biocontrol efficacy against Bipolaris foot-rot has been high (>80%) and stable during a test period of 7½ months for coated seed stored at this temperature. Field experiments It is often seen that potentially useful BCAs are unable to ensure stable and effective biocontrol under natural growing conditions. During this project six field experiments have been conducted. The results from all these trials demonstrated that coating seed of wheat and barley with IK726 significantly controls disease caused by seedborne inoculum of F. culmorum. IK726 is active against the pathogen at soil temperatures that are typical for cereal cultivation in Denmark, since average temperatures varied between 6.2°C and 12 °C in the periods from sowing to plant emergence. Growth chamber experiments has further revealed that IK726 also controls F.culmorum effectively at temperatures from 10°C to 20°C. In addition the results from these field trials confirm that stored conidia are as effective in controlling F. culmorum as are freshly harvested conidia. In conclusion, the efficacy data from the field experiments demonstrate that seed coating with IK726 should be a realistic alternative to chemical control, especially for control of seed borne infections caused by F. culmorum. Potential of IK726 against other pathogens Preliminary experiments have revealed that IK726 also controls other plant pathogens. Screening experiments with control of common bunt (Tilletia caries) on wheat have shown that IK726 seed treatment can reduce the frequency of bunt both in the field and in growth chamber experiments. Coating seeds of sugar beet with IK726 has also significantly reduced damping-off caused by soil borne inoculum of P. ultimum in growth chamber experiments. Preliminary investigations with reisolation of G. roseum from barley and wheat roots indicate that IK726 is rhizosphere competent (able to colonize the root from the seed) on these crop plants. This further indicates the potential of IK726 to prevent attack from soil borne pathogens since rhizosphere competence is regarded as a significant factor for high control efficacy against such pathogens. Future development of IK726 It is expected that a significant part of the project dealing with producetion and formulation can be patented. This will improve the prospects for commercialization of IK726. Several agreements of collaboration and projects should help ensure the future development of IK726. An agreement on collaboration and options has been signed with the seed company, Dæhnfeldt a/s, in order develop and use IK726 for coating seeds of vegetables and flowers. A three year project was started in 1998 in order to develop biocontrol for practical application to control seed and soil borne pathogens mainly in cereals ad it is planned that the efficacy of IK726 against other seed borne diseases will be tested in field trials. In connection with the above, collaboration with Cillus a/s on biological seed treatment of cereals has just started. Moreover, Danisco Seed is at the moment testing IK726 for coating seed of sugar beet. A more formalized collaboration is expected during 1998/99 with this company. Conclusion The results of the project "Development of a biological control agent for seed treatment" underline the good possibilities for commercial use of G. roseum (IK726) for seed treatment in order to control seed borne diseases. IK726 can be produced cost-effectively and reproducibly. Formulated preparations have stable shelf-lives of about 1 year at storage temperatures of up to 20°C. The control efficacy of stored IK726 preparations is high and reproducible in green house tests. Furthermore, high and stable biocontrol efficacy has been demonstrated in a series of field trials under varying environmental conditions. In addition, IK726 can be stored on seeds for more than half a year without significant loss of control efficacy. An investigation on the novelty value made by Plougmann, Vingtoft & Partners established that it probably will be possible to protect considerable parts of the technology developed in the project with patents. Furthermore, the project points to new areas where IK726 can be utilized for disease control. 1 Introduktion1.1 Formål og målgruppeI Danmark bliver udsæd af korn rutinemæssigt bejdset med fungicider. Formålet med projektet er, at udvikle et biologisk bejdsemiddel som alternativ til kemisk bejdsning mod frøbårne patogener, med henblik på at opnå en renere teknologi. Et lovende isolat (IK726) af Gliocladium roseum danner grundlag for projektet, hvor undersøgelserne fokuseres på udvikling af produktions- og formuleringsmetoder, der sikrer tilstrækkeligt shelf-life af de biologiske præparater samt evaluering af disse effektivitet under væksthus- og markforhold. Landbruget og evt. gartnerier er den endelige målgruppe for et eller flere biologisk præparater baseret på IK726. Under projektetforløbet er der indgået en samarbejds- og optionsaftale med frøfirmaet Dæhnfeldt a/s, der forventes at være interesseret i at videreudvikle præparater og teknologier, der er udviklet i projektperioden. 1.2 Baggrund1.2.1 Frøbårne sygdomme på korn og deres bekæmpelseFrøbårne sygdomme Frøbårne sygdomme udgør globalt set en meget væsentlig del af det samlede sygdomsbillede for kulturplanterne. Der er for alle kornsorterne: byg, hvede, havre og rug problemer med frøbårne spiringsskadende svampe især tilhørende slægterne Fusarium og Drechslera sensu lato. Disse svampesygdomme ønskes bekæmpet dels for at undgå udbyttetab og dels for at hindre en akkumulering af smittetryk i marken. Anvendelse af sanitære foranstaltninger, planters resistens og senere især de meget effektive kemiske bejdsemidler er derfor blevet accepteret, som en fornuftig praksis. Ved anvendelse af bekæmpelsesmidler er der helt åbenlyse fordele ved at bekæmpe patogenerne allerede på frøet, da man her kan ramme målet med den mindste mængde aktiv stof pr hektar. Kemisk bejdsning De kemiske bejdsemidler har dog vist sig at have visse begrænsninger og miljømæssige ulemper. Efterspørgslen efter alternativer til kemisk bejdsning er blevet stærkere i takt med den øgede usikkerhed omkring sikkerhed og miljømæssige påvirkninger, men også fordi færre kemiske midler er tilgængelige på grund af tilbagetrækning fra markedet. Ydermere er behovet for udvikling af biologiske midler skærpet som følge af problemer med udvikling af fungicidresistens, mangel på effektive kemiske løsninger til specifikke sygdomsproblemer samt at pesticider generelt ikke er tilladte i økologisk jordbrug. 1.2.2 Forudsætninger for udvikling af biologiske midlerIsolat Den første forudsætning for succesfuld biologisk bekæmpelse er, at der isoleres og dernæst selekteres et virksomt isolat af en antagonistisk mikroorganisme. Selektion foregår som oftest ved screening for antagonisme i in vitro eller in vivo systemer. Der er dog mange eksempler på at lovende antagonister har været ude af stand til af sikre en stabil og effektiv bekæmpelse under naturlige vækstbetingelser (Renwick et al., 1991; Duczek, 1994; Knudsen et al., 1997). Det skyldes formodentlig komplekse vekselvirkninger med abiotiske jordbunds-faktorer som fugtighed, pH, temperatur og tekstur og biotiske faktorer som konkurrence og prædation fra den naturlige mikroflora i jordbunden (Shah-Smith & Burns, 1996). Produktion og formulering Når et effektivt isolat er udvalgt, forestår der imidlertid et stort udviklingsarbejde med at forarbejde antagonisten, så den kan anvendes i erhvervsmæssig skala. Da biologiske bekæmpelsesmidler er baseret på levende organismer, har vanskeligheder omkring produktion, formulering og shelf-life ofte vist sig at komplicere kommercialiseringen af sådanne produkter. Antagonisten skal kunne masseproduceres hurtigt og billigt, men må også kunne formuleres på en sådan måde, at effektivitet og stabilitet i bekæmpelsen kan bevares. Ydermere skal præparatet kunne lagres og distribueres uden tab af biologisk bekæmpelsesaktivitet (Lewis, 1991; McIntyre & Press, 1991). Registrering Endelig må man naturligvis holde sig for øje at registrering af biologiske bekæmpelsesmidler er lovpligtig og dermed en nødvendighed for kommercialisering af biologiske midler. Denne proces kan være både langvarig og kostbar. I den sammenhæng formodes det, at mikroorganis-mer der er naturligt forekommende i det miljø, hvori de skal virke, må være lettere at få godkendt end f.eks eksotiske organismer. Specifikke krav til et biologisk bejdsemiddel Når formålet er, at udvikle et biologisk produkt til frøbejdsning, skal det formulerede isolat opfylde en række specifikke betingelser: (1) De rette svampestrukturer skal kunne produceres hurtigt og reproducerbart i store mængder. (2) Disse strukturer skal være i stand til at overleve tørring og lagring. (3) De må aktiveres ved såning og være istand til at kolonisere frøet og gerne planterødderne for at hæmme patogenet. (4) Bekæmpelses-effektiviteten skal være høj og stabil under varierende miljøforhold. (5) Antagonisten må ikke skade eller hæmme frøets spiring og rodudvikling og (6) Kompatibilitet med eksisterende frøbehandlingsmetoder er ønskelig (Baker, 1991; Harman, 1991). 1.3 Anvendelse af Gliocladium roseum til frøbejdsningGliocladium roseum Gliocladium roseum er en almindeligt forekommende saprofytisk svamp, og er på verdensplan sammen med blandt andet Pencillium og Trichoderma blandt de almindeligste forekommende svampe i jord (Domsch et al., 1980). G. roseum isoleres hyppigt fra planterødder og rhizosfære, men forekommer også ofte i og på ovenjordiske plantedele (Barnett & Lilly, 1962; Dix, 1964; Stenton, 1958; Pugh & Dickinson, 1965; Mueller & Sinclair, 1986). G. roseum kan i lighed med ovennævnte svampe og en lang række andre almindeligt forekommende mikrorganismer producere adskillige metabolitter in vitro (Lübeck, 1994). Der er dog ikke i litteraturen rapporteret om detektion af G. roseum metabolitter under naturlige betingelser (Jensen, 1998, in press). 1.3.1 Forskningsmæssig baggrundUdvælgelse af IK726 Et fællesnordisk program: "Biologisk bekæmpelse af frøbårne sygdomme i korn" har haft til formål at tilvejebringe effektive antagonistiske mikroorganismer til biologisk bejdsning mod udsædsbårne sygdomme. G. roseum, isolat IK726, er udvalgt blandt 800 svampeisolater, der er indsamlet fra relevante substrater (frø, halm, jord m.v) fra forskellige danske agerjorde. IK726, der er isoleret fra rødder af F. culmorum inficerede bygplanter, har vist sig først i bioassay i væksthus og siden i markforsøg at være andre selekterede isolater overlegne med hensyn til bekæmpelse af spiringsfusariose forårsaget af F. culmorum (Knudsen et al., 1995). Forekomst af G. roseum i DK Ved de ovennævnte isoleringer, er der opnået flere isolater af G. roseum fra såvel planterødder som strå og jord, der alle resulterende i mere end 50% bekæmpelse af F. culmorum i screeningen. Senerer isoleringer fra agerjord fordelt i hele DK har vist en tilsvarende høj bekæmpelsesevne for alle testede G. roseum isolater (i alt 21) (Knudsen, ikke publiceret). Det må derfor anses for sandsynligt, at G. roseum (herunder isolater med højt antagonistisk potentiale som IK726) forekommer meget almindeligt i danske jorde, og at G. roseum under danske forhold indgår naturligt i den mikrobielle spermosfære- og rhizosfæreflora. 1.3.2 ProjektindholdForskningsindsatsen i det foreliggende projekt er opdelt i følgende hovedområder: Kapitel 2 omhandler udvikling af produktions- og formuleringsmetoder til hurtig, billig og reproducerbar opformering af G. roseum (IK726). Kapitel 3 og Kapitel 4 omhandler undersøgelser af henholdsvis shelf-life og spiringsaktivitet for udvalgte formulerede præparater som funktion af lagertid og lagertemperatur. Den biologiske bekæmpelsesaktivitet ved bejdsning med udvalgte præparater og formuleringer er evalueret i planteforsøg (bioassay) i væksthus med hensyn til bekæmpelse af spiringsfusariose forårsaget af udsædsbårent inokulum af Fusarium culmorum i byg (Kapitel 5), Bipolaris fodsyge forårsaget af udsædsbårent inokulum af Bipolaris sorokiniana i byg (Kapitel 6) og rodbrand forårsaget af jordbårent inokulum af Pythium ultimum i sukkerroe (Kapitel 7). For alle forsøg gælder at frøene er bejdset umiddelbart inden udsåning. I kapitel 8 er overlevelsen af IK726 konidier på frø samt deres aktivitet overfor udsædsbårne patogener evalueret som funktion af lagertempera-tur og lagertid. Kapitel 9 omhandler G. roseum's biologiske bekæmpelsesaktivitet under markforhold, hvor udvalgte præparater og formuleringer af IK726 er evalueret med hensyn til bekæmpelse af F. culmorum i byg og hvede. Kapitel 10 omhandler overlevelse af G. roseum under markforhold efter udbringning med frø. 2 Produktion og formulering af Glicladium roseum præparaterBiologiske bekæmpelsesmidler kan kun fremstå som et realistisk alternativ til de kemiske midler, såfremt lovende antagonister kan produceres og formuleres på en økonomisk rentabel måde. Antagonisten skal kunne produceres effektivt og billigt, men må også kunne formuleres på en sådan måde, at applikation er mulig i praksis, samtidig med at effektivitet og stabilitet i bekæmpelsen bevares. I rapporten er produktion og formulering opdelt i to underafsnit for at gøre emnet mere overskueligt. Der er dog ofte en klar indbyrdes sammenhæng mellem produktion og formulering, som det også vil fremgå af nedenstående afsnit. 2.1 ProduktionProduktionskrav En væsentlig forudsætning for en kommerciel udvikling af et biologisk bekæmpelsesmiddel er, at antagonisten kan masseproduceres hurtigt og billigt i industriel skala. Det betyder reelt, at der både kræves en høj kvantitativ produktion af de(n) strukturer af antagonisten, der er aktive i den biologiske bekæmpelse af patogener samtidig med at disse struktures kvalitet opretholdes på højeste niveau med hensyn til overlevelse og aktivitet (Harman et al., 1991; Lewis, 1991). Der stilles således flere specifikke krav til produktionen, der kan være mere eller mindre modstridende og vanskelige at opfylde. Substratet skal være billigt, samtidig med at en høj produktion skal opnåes på så kort tid som mulig, idet prisen ved fermentering pr dag er en væsentlig produktions-omkostning (Lewis, 1991; Stowell, 1991). Herefter skal antagonisten kunne overleve de forskellige forarbejdsningstrin i processen frem mod et brugbart produkt (såsom høst, nedtørring, formulering, lagring og applikation). Nedtørringstolerance Biomasse af svampeantagonister ønskes som oftest distribueret i nedtørret form primært for at mindske risikoen for kontaminering, men også for at få et mere håndterbart produkt. Dette indebærer, at de aktive strukturer nødvendigvis må have en høj nedtørringstolerance, dels for at sikre den optimale økonomi i produktionen, men også fordi død biomasse kan tjene som næring for plantepatogener ved applikationen af produktet, og dermed føre til forøget sygdomsangreb (Harman, et al., 1991; Nigam & Singh, 1994; Jin et al.,1996). Det er en generel erfaring med kun få undtagelser, at ukønnede sporer (konidier) og især klamydosporer (hvilesporer) tåler nedtørring langt bedre end myceliefragmenter (Harman, 1992; Boyette et al., 1991). På trods af svampesporers generelt højere nedtørringstolerance, er overlevelsen efter nedtørring et kardinalpunkt ved fremstilling af biologiske midler. Specielt når produktionen af sporer sker ved flydende fermentering er nedtørringstolerancen meget lav (Harman et al., 1991). Undersøgelser indenfor Trichoderma harzianum har dog vist, at det er muligt at øge tolerance ved at manipulere det osmotiske potentiale i vækstmediet (Harman et al., 1991; Jin et al., 1991; Jin et al., 1996). Kommerciel produktion Generelt arbejdes der med to overordnede metoder (principper) til produktion af mikrobiel biomasse af antagonister, nemlig flydende fermentering og fast fermentering. Erfaringerne med kommerciel produktion af antagonistiske svampe til biologiske bekæmpelse af plantepatogener er forholdsvis få, set på verdensplan. På nuværende tidspunkt markedsføres der kun omkring 17 produkter (internetaddresse: http.//www.barc.usda.gov/psi/bpdl/bioprod.htm). Der er dog en lang tradition for fermentering af svampe, der udnyttes i industrielle processer, såsom vin- og øldyrkning, kompostering, produktion af antibiotika og enzymer etc, hvor der således eksisterer en veletableret teknologi (Stowell, 1991; Nigam & Singh, 1994). Disse erfaringer kan ikke altid med held overføres til produktionen af biologiske midler, idet produktionen af disse adskiller sig fra mange af de konventionelle produktionssystemer ved at slutproduktet skal bestå af den levende biomasse af antagonisten og ikke af biprodukter fra fermenteringen (Stowell, 1991). Flydende fermentering Flydende fermentering (FlF) er her anvendt som dansk oversættelse af de engelske termer "liquid fermentation" og "submerged fermentation". FlF kan generelt defineres ved at produktionen foregår i fortyndede opløsninger eller "slurries". I laboratoriet sker fermenteringen typisk i glasflasker (100-1000 ml) i rystekultur, mens den kommercielle fermentering sker i store tanke (fermentorer) på flere tusind liter. Rhodes & Powell (1994) anfører, at de fleste antagonistiske bakterier med lethed produceres ved FlF, der således er standardmetode ved produktion af mikrobiel biomasse til mange industrielle formål i Europa og i Nordamerika, mens metoden synes vanskeligere at benytte til svampe. Fast fermentering Fast fermentering er en dansk oversættelse af de engelske termer "solid fermentation " og "semi-solid fermentation". Fast fermentering (FaF) kan generelt set defineres som vækst af mikroorganismer på fast substrat i en proces, der foregår uden (eller næsten uden) adgang til frit vand. Substratet skal dog indeholde nok absorberet vand i den faste matrix til at stimulere fermenteringsprocessen. Substrater anvendt til FaF er vanskeligt opløselige i vand og polymere af natur. De skal i form af carbonhydrater, vitaminer, mineraler, og andre næringsstoffer samt absorberet vand give byggesten til mikroorganismen og grundlag for den mikrobielle vækst. Endelig tjener substratet som forankring for mikroorganismen (Nigam & Singh, 1994). Syntetiske polymerer så som agar og gelatine kan også anvendes, og da de giver et homogent substrat er disse substrater meget velegnede til modelstudier af mikrobiel vækst på fast substrat. Den forholdsvise høje pris for syntetiske substrater gør dem dog sjældent anvendte i kommerciel skala (Nigam & Singh, 1994). I laboratoriet sker fermenteringen ofte i glasflasker eller polypropylenposer (25 g til 5 kg), i kommerciel skala anvendes bakker, trug og tromler med kapacitet fra 50 kg til flere tons. Teknologier til FaF er hovedsagelig udviklet i Japan (Nigam & Singh, 1994). Fast contra flydende fermentering Ved sammenligning af de to produktionsformer fremhæves flydende fermentering oftest som den mindst ressourcekrævende i forhold til udbyttet af det ønskede produkt (Stowell, 1991; Boyette et al., 1991). Produktionen af biomasse skal være ensartet fra gang til gang for at sikre en reproducerbar sammensætning af det færdige produkt og i den forbindelse fremhæves det ofte, at der ved FlF lettest opnåes en ensartet og sikker styring af produktionen (Boyette et al., 1991). Nogle svampe-slægter er dog uvillige til at danne sporer i flydende medier (Stowell, 1991). Grunden til, at FlF generelt fremhæves som den bedste fremente-ringsmetode, skal formodentlig også tilskrives, at der hidtil ikke er blevet forsket og investeret intensivt i FaF i hverken Europa eller USA. På grund af hemmeligholdelse af know-how vedrørende produktion af de markedsførte midler, er det ikke muligt at få oplyst hvilken fermenteringsmetode, der konkret anvendes. For et af midlerne nemlig Fusaclean (Fusarium oxysporum) er det dog i brugsvejledningen nævnt, at antagonisten er opformeret på fast substrat. G. roseum Erfaringerne omkring opformering af Gliocladium roseum til kommercielle formål er få. En gennemgang af litteraturen viser, at produktion af G. roseum udelukkende er sket ved fast fermentering og som oftest på det syntetiske substrat PDA (Knudsen et al.,1995; James & Sutton, 1996, Burgess et al, 1997). Adskillige faste organiske substrater er dog afprøvet herunder majsmel, hvede-og havreklid (Peng et al., 1992), hvedekerner (James & Sutton, 1996) samt en blanding af vermiculit og hvedeklid (Keinath et al., 1991). Ved nærværende projekts begyndelse blev konidier af G. roseum (IK726) produceret på kartoffeldextroseagar (PDA). Formål Det overordnede formål med nærværende forsøg er at undersøge metoder til produktion af G. roseum (IK726) med kommercielle udviklings-muligheder for øje, herunder specielt 1) at undersøge mulighederne for anvendelse af flydende fermentering, 2) at viderudvikle produktionen på fast medie til at omfatte billige og lettilgængelige substrater og 3) at manipulere dyrkningsforholdene for at øge konidiernes kvalitet, herunder nedtørringstolerance. 2.1.1 Materialer og metoderSåvel flydende som fast fermentering af G. roseum (IK726) er foretaget under sterile forhold og med steriliserede materialer, således at kontaminering undgåes. For at forhindre eventuelle forandringer af isolatet som følge af rekultivering, udføres alle produktionsforsøg med udgangspunkt i agarpropper fra en stamkultur af IK726 på PDA. Stamkulturer opbevares ved -80oC i cryorør med en 10% glycerol opløsning. Alle eksperimenter påbegyndes ved anvendelse af en ny agarprop fra frys, denne overpodes til PDA og inkuberes 1 uge. Herfra overpodes IK726 påny til PDA, inkuberes 1 uge, hvorefter substrater kan podes med agarpropper af denne kultur. Flydende fermentering Produktion af G. roseum konidier ved flydende fermentering blev undersøgt ved opformering af IK726 i rystekultur. Kolber (250 ml) med 100 ml Kartoffel Dextrose Broth (PDB) blev podet med en agarprop af IK726 og derefter inkuberet ved stuetemperatur på rystebord (130 rpm) . Osmotikum Indflydelsen af osmotika på biomasseproduktion og sporulering blev undersøgt ved tilsætning af glycerol, Polyethylene glycol (PEG) 8000 (60% w/v) og PEG 200 i forskellige koncentrationer. Osmotika blev tilsat efter 24 timers inkubering af IK726 på PDB, idet samtidig tilsætning af IK726 og osmotikum reducerede konidieproduktionen voldsomt. Biomasse og konidiekonc. Efter i alt 8 døgns inkubering blev biomassen og konidiekoncentration bestemt på følgende måde: Substratet homogeniseres 1 minut ved fuld hastighed, homogenatet centrifugeres (8000 rpm, 4°C, 10 min.), pellet resuspenderes i sterilt vand og filtreres gennem indvejede glasfiltre (porestørrelse 1.2 µm) ved hjælp af sugekolbe. Filtrene tørres 1 døgn ved 60°C, hvorefter biomassen bestemmes ved vejning. Konidieproduktionen pr. ml substrat bestemmes ved tælling i bakterietællerkammer, da konidierne er relativt små, nemlig 3-4 x 5-7 µm (Domsch et al., 1980). Fast fermentering Produktionen af IK726 ved fast fermentering er undersøgt for en række organiske substrater alene og i kombination. Indflydelsen af nær-UV lys, vandindhold og produktionstid på produktionens størrelse og konidiernes nedtørringstolerance som funktion af produktionsmetode er ligeledes undersøgt. "Starter" inokulum Som "starter" inokulum anvendes enten agarpropper, som beskrevet ovenfor eller konidiesuspensioner af IK726. Konidiesuspensioner fremstilles efter følgende procedure: Opformering sker i rystekultur på PDB+PEG200 (jfr. afsnit 2.2.1). I 250 ml kolber podes 94 ml kartoffeldextrose broth (PDB) med en agarprop af IK726. Der inkuberes ved stuetemperatur på rystebord (130 rpm). Efter 1 døgn tilsættes 6 ml PEG200. Efter yderligere 7 døgns inkubering høstes konidierne ved homogenisering af inokulum (blending i 1 minut), filtrering gennem 3 lag gaze, centrifugering (8000g, 4o, 10 min.) efterfulgt af resuspension af pellet i vand og indstilling af konidiekoncentrationen ved fortynding. Konidiekoncentrationen bestemmes ved hjælp af tællekanner. Substrater og metode Majs eller havregryn (20 g/250 ml kolbe) tilsat 100 ml konidiesuspension af IK726 (2 x 107 konidier/ml) inkuberes 5 døgn på rystebord (125 rpm) ved stuetemperatur. Substratet filtreres gennem 4 lag gaze, filtratet udbredes i et 0.5 cm lag, dækkes med plast og inkuberes i 5 eller 12 døgn. Klid (50 g/1 l pyrexflaske) tilsættes 50 ml vand, autoklaveres og tilføres efter afkøling 50 ml konidiesuspension af IK726 (1 x 107 konidier/ml), der inkuberes 3 døgn med løsnet skruelåg (omrystes dagligt). Inokulum udbredes i et 0.5 cm lag, dækkes med plast og inkuberes i henholdsvis 5 og 10 døgn. Ved produktion på majs, havregryn og klid er indflydelsen af nær-UV-belysning i inkubations-perioden endvidere undersøgt. Sphagnum blandes med ionbyttet vand i forholdet 2:3 (w/w). Sphagnum og klid blandes i forholdet 37,5: 62,5 og blandes herefter med ionbyttet vand svarende til 59% (w/w). Sphagnum, klid, majs og ionbyttet vand blandes i forholdet 17:22:7:54 (w/w). Substraterne (39g/250 ml kolbe) autoklaveres 2 x 67 minutter i to på hinanden følgende dage og inokuleres efter afkøling. Der inokuleres med 2 agarpropper (0.5 cm) per kolbe eller med 5 ml konidiesuspension af IK726. I eksperiment P1, P2 og P3 inokuleres kun med 1 ml suspension (se endvidere tabel 2.1) Vandindhold og produktionstid Til undersøgelser af vandindholdets indflydelse på opformeringen af IK726, holdes vægtforholdet mellem sphagnum og klid konstant og vandindholdet reguleres ved tilsætning af ionbyttet vand eller konidiesuspensioner af IK726. Vandindholdet beregnes således på basis af vægt af vand i forhold til vægten af tørt substrat. Undersøgelser vedrørende produktionstidens indflydelse på opformeringen af IK726 omfatter intervallet fra 8 til 28 dage og er hovedsagelig udført for sphagnum/klid substratet. Nedtørring For alle inokulumtyper er der benyttet en standardmetode til nedtørring. Substratet udbredes på sterilt filtrerpapir og tørres i 2 døgn ved stuetemperatur i sterilbænk. Herefter mortes eller blendes det tørrede inokulum. Til bestemmelse af produktionens størrelse og kvalitet anvendes den tørrede findelte biomasse. Endelig foretages pakning og lagring til senere bestemmelser af overlevelse (ase Kap. 3 og Kap.8) og biologisk bekæmpelsesaktivitet (se Kap. 4-9). Produktion (cfu/g) Produktionens størrelse bestemmes ved en fastlagt pladespredningspro- cedure. Der udtages inokulumprøver á ca. 0.05 g, der tilsættes 10 ml vand og whirlmixes 1 minut. En fortyndingsrække fremstilles og efter fastlæggelse af konidiekoncentrationen ved hjælp af tællekammer pladespredes 3 x 100 ml for hver af tre relevante fortyndinger på PDA. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur og aflæses 2, 3 og 4 dage efter inokulering. Antallet af kolonidannende enheder pr gram inokulum (cfu/g) bestemmes. Konidiespiring Suspensioner af inokulum (ca 1 x 106 konidier/ml) udsprøjtes på vandagar og inkuberes i mørke ved 20oC. Efter 24 timer bestemmes den procentvise spiring under mikroskop idet 3 x 100 konidier fra tilfældigt udvalgte synsfelter per behandling bedømmes for spiring/ikke spiring. I tabel 2.1 er der angivet en detaljeret beskrivelse for eksperimenter med fast fermentering med hensyn til substratvalg, inkubationstider, vandindhold, samt form og koncentration af "starter" inokulum 2.1.2 Resultater vedrørende produktionFlydende fermentering IK726 kan uden problemer opformeres på flydende substrat i rystekultur og IK726 danner villigt konidier i størrelsesordenen 5 x 107 konidier/ml (Tabel 2.2 og 2.3). Tilsætning af osmotikum efter 1 døgns inkubation influerer ikke signifikant på koncentrationen af konidier pr ml, men giver en højere koncentration af konidier pr. g biomassen: 2.5 x 1010 konidier/g biomasse ved tilsætning af PEG 200 mod 1.3 -1.7 x 1010 konidier/g uden tilsætning af PEG. Overlevelsen i nedtørret pellet, der hovedsagelig indeholder konidier og små myceliestykker, blev estimeret til 15-60%. Tabel 2.1. Detaljeret beskrivelse af produktionsforsøg med fast fermentering Substrat, starter inokulum, vandindhold og inkubationstid er angivet. Table 2.1. Detailed description of production experiments using solid fermentation. Substrates, starter inoculum, water content and period of incubation is shown.
1) Angiver konidiekoncentrationen i starter konidiesuspensionen. Osmotikum Tabel 2.2. Konidie- og biomasseproduktion af G. roseum (IK726) efter 8 døgns fermentering i rystekultur ved 20°C i PDB tilsat forskellige osmotika (Forsøg 1). Table 2.2. Production of conidia and biomass of G. roseum (IK726) after 8 days of incubation in liquid cultures with addition of osmotica (Experiment 1).
1) Den gennemsnitlige tørvægt af biomasse per 100 ml substrat Tabel 2.3. Konidie- og biomasseproduktion af G. roseum (IK726) efter 8 døgns fermentering i rystekultur ved 20°C i PDB tilsat forskellige osmotika (Forsøg 2). Table 2.3. Production of conidia and biomass of G. roseum (IK726) after 8 days of incubation in liquid cultures with addition of osmotica (Experiment 2).
1) Angiver gennemsnitlige log10- værdier for konidier per ml ± spredning
(SD) Fast fermentering Substrater Adskillige substrater er undersøgt med henblik på at optimere produktionen af IK726 ved fast fermentering. Ved sammenligning af de enkelte substrater fremgår det, at klid alene giver den højeste produktion af cfu per g tørt præparat (Tabel 2.4 og 2.5). Således er produktionen på klid ca 30 gange større end på eksempelvis sphagnum og havregryn. Imidlertid giver en blanding af sphagnum og klid en produktion, der er ca. 7 gange størrer end på klid alene (Tabel 2.4). Nær-UV lys Mange svampeslægter udviser forøget sporulering ved inkubation under nær-UV lys (Neergaard, 1977). For G. roseum synes nær-UV belysning ikke at fremme hverken den totale konidiemængde eller sporulerings-hastigheden (Tabel 2.6). Der synes heller ikke at være nogen vekselvirkning mellem substrat og nær-UV lys. Tabel 2.4. Produktion af G. roseum på faste substrater inkuberet ved stuetemperatur efterfulgt af 2 døgns nedtørrings. Table 2.4. Production of G. roseum on solid substrates incubated at room temperature followed by 48 hours of drying.
1) Angiver gennemsnitlige log10-værdier for cfu/g præparat ± standardafvigelsen (SD) Tabel 2.5. Produktion af G. roseum på faste substrater inkuberet 15 døgn ved stuetemperatur efterfulgt af 2 døgns tørring. Table 2.5. Production of G. roseum on solid substrates incubated for 15 days at room temperature followed by 48 hours of drying.
1) Angiver gennemsnitlige log10-værdier for cfu/g præparat ± standardafvigelsen (SD) Tabel 2.6. Effekten af nær-UV belysning på produktion af G. roseum som funktion af substrat og produktionstid. Table 2.6. The effect of near-UV light on the production of G. roseum in relation to substrate and incubation period.
Vandindhold Af tabel 2.7 fremgår det, hvorledes vandindholdet i sphagnum/klid substrater påvirker dels den totale produktion af G. roseum og dels konidienes nedtørringstolerance. Produktionen af cfu per g tørret inokulum synes upåvirket af et vandindhold i substratet, der spænder fra 40 % og op til 70%. Dog er der en tendens til at konidiernes nedtørringstolerance, det vil sige andelen af spiringsdygtige konidier efter nedtørring, er mest stabil ved et vandindhold under 60%. Produktionstid I figur 2.1 er produktionstidens indflydelse på produktionens størrelse i sphagnum/klid med 60% vandindhold afbilledet for eksperimenterne L5, P3 og P4. Ved at udstrække produktionstiden fra 14 og op til 28 døgn fåes ingen signifikant forøgelse af produktionen, tværtimod er der tendens til reduktion efter 26 døgn (P3). En reduktion af produktionstiden til 12 døgn påvirker ikke produktionen signifikant, dog er produktionen lavest ved 12 døgn (P4). Når man slår resultaterne sammen for de tre eksperimenter ses det, at der opnåes en stabil produktion på 6-8 x 108 cfu/g inokulum ved produktionstider mellem 14 og 20 døgn. Tabel 2.7. Effekten af vandindhold i sphagnum/klid substrat på produktionen af konidier G. roseum og på konidiernes spiringsevne efter nedtørring af præparaterne. Table 2.7. The effect of water content in peat/bran substrate on the production of Gliocladium roseum conidia and their ability to germinate following drying of the biomass.
1. Indenfor søjler er gennemsnitsværdier efterfulgt af samme bogstav ikke signifikant forskellige på 5%-niveauet (Duncan-test) Figur 2.1.(3 Kb) Figur 2.1. Produktionstidens indflydelse på opformeringen af kolonidannende enheder (cfu) af G.roseum (IK726) i sphagnum/klid inokulum efter 2 døgns nedtørring. L5, P3 og P4 refererer til produktionsforsøg jfr. tabel 2.1. Figure 2.1. The effect of incubation time on the production of colony forming units (cfu) of Gliocladium roseum (IK726) in peat/bran inoculum following 48 hours of drying. L5,P3, and P4 refers to production experiments se table 2.1. 2.2 FormuleringFormulering kan defineres som den forarbejdning af fermentorbiomasse i våd eller nedtørret form, der resulterer i et produkt, der er anvendeligt i praksis. Fermentorbiomassen betegner den blanding af vækstmedie og antagonist, der opnåes ved fast eller flydende fermentering som beskrevet i afsnit 2.1. Den simpleste form for formulering fåes ved direkte anvendelse af fermentormasse; i frisk eller nedtørret tilstand som eksempelvis nedtørret sphagnum/klid inokulum eller homogeniseret fermentorbiomasse fra flydende fermentering, som beskrevet i afsnit 2.1. En mere sofistikeret formulering er ofte påkrævet i bestræbelserne på at udvikle en antagonist til et kommercielt produkt. Formulering kan være nødvendig dels ud fra praktiske/tekniske grunde, og dels for at forbedre nedtørringstolerance, shelf-life (overlevelse under lagring) og den biologiske bekæmpelsesaktivitet. Generelt kræver FaF ikke yderligere formulering før brug, idet fermentorbiomassen tørres og formales (Lewis, 1991). Fra FlF skal biomassen separeres fra det flydende substrat ved eksempelvis filtrering eller centrifugering (Lewis, 1991). Herefter kan den våde biomasse indarbejdes i piller eller inerte bærestoffer, som eksempelvis lermineraler og vermiculit, efterfulgt af nedtørring. Alginatpiller Ved formulering i piller immobiliseres antagonisten i en fast matrix eksempelvis alginat (algeextract). Når piller tilføres til jorden, vil de afhængig af matrixens sammensætningen blive mere eller mindre hurtigt opløst som følge af vandoptagelse, og andre mikroorganismers nedbrydning (Fravel et al., 1985). Pillematrixen kan tilføres nærings-kilder, der kan stimulere antagonistens vækst, men som på grund af den rumlige adskillelse ikke umiddelbart kan udnyttes af patogenet. Derved gives antagonisten optimale forhold i de første timer efter udbringelse og dermed god mulighed for etablering i vækstmediet (Lumsden & Locke, 1989; Harman, 1991). Formulering af en alginat-hvedeklid pille af Gliocladium virens har resulteret i et registreret og markedsført produkt (Soilgard) med tilstrækkelig shelf-life, bekæmpelseseffektivitet og stabilitet (Walter & Lumsden, 1997). Delivery system Formulering af biologiske præparater vil være afhængig af hvilket "delivery system", der benyttes, dvs. hvorledes applikering af antagonisten skal foregå. Til frøbehandling (bejdsning) vil pulverformulering eller flydende formulering være at foretrække. (Biologisk formulering af frø er nærmere beskrevet i afsnit 5 og 8.1). Applikation til vækstmediet ved iblanding bliver derimod bedre og mere sikker at håndtere, hvis antagonisten er formuleret i piller eller diverse granulattyper. Specielle formuleringer kan også være nødvendige for at produktet kan tilpasses til de eksisterende udbringningssystemer, såsom industrielle bejdseanlæg, såmaskiner, gødningsspredere etc. Formål Formålet med nærværende undersøgelser er at undersøge hvilke typer af formulering, der er kompatible med IK726 herunder specielt (1) at afprøve og udvikle forskellige formuleringsmetoder med udgangspunkt i både fast og flydende fermentorbiomasse af IK726 og (2) at opkoncen-trere og stabilisere den aktive ingrediens (konidier) i tørre præparater. 2.2.1 Materialer og metoderAlginat piller Alginatpiller blev fremstillet med udgangspunkt i homogeniseret fermentorbiomasse fra flydende fermentering af G. roseum i PDB+PEG200 (se afsnit 2.1). Der fremstilles opløsninger af PEG8000 (480g/l) og Na-alginat medium viscosity (23g/l). Fermentormasse, PEG8000 og Na-alginat blendes sammen i 30 sek. Opløsningen omrøres konstant og dryppes ved hjælp af pipette ned i en 0.25 M CaCl2 opløsning. De dannede piller (ca 3 mm i diameter) henstår 10 min i CaCl2-opløsning, hvorefter de filtreres fra og tørres 1 døgn ved stuetemperatur. Frysetørring Novo Nordisk A/S fremstillede et pulverpræparat af IK726, ved at frysetørre fermentormasse fra FlF af isolatet på PDB i skummetmælks-pulver. Moler og Chemosorb Der er anvendt produkter af moler, der er den geologiske betegnelse på en naturblanding af diatomeer (kiselalger) og ler, der bla. findes på Fur. De anvendte produkter er venligst stillet til rådighed af Damolin, Dansk Moler Industri. GM-typer er ovntørret moler, dvs at vandet er fjernet, men moleret har bevaret sin struktur. KM-typer er kalcinerede, hvor en forbrændingsprocess har omdannet lerpartiklerne således at kemisk bundet vand er fjernet. Nedenfor er vigtige tekniske data angivet for anvendte typer. Chemosorb er et lermineral produkt, der er stillet til rådighed af Claude Alabouvette, INRA, Frankrig.
1) Angiver den procentdel der tilbageholdes ved sigtetesten Fast fermentering Konidier fra fast fermentering på sphagnum/klid (se afsnit 2.1.1) separeres ved filtrering og centrifugering. Hver kolbe tilsættes 200 ml vand omrystes kraftigt i 30 sek, blendes 1 minut i husholdningsblender ved fuld hastighed og filtreres gennem polyestervæv (38µm). Filtratet centrifugeres (8000g, 4°C, 10 min). Supernatanten hældes fra og den våde pellet, der overvejende indeholder konidier, vejes og blandes med molerprodukter og Chemosorb i forholdene 1:1 og !:2 (w/w). Blandingen udbredes i petriskåle i et lag på max. 0.5 cm og tørrer 18 timer i sterilbænk ved stuetemperatur. Flydende fermentering Konidier fra flydende fermentering af IK726 på PDB+PEG produceres som beskrevet i afsnit 2.1. Fermentorbiomassen blendes 1 minut ved fuld hastighed, filtreres gennem polyestervæv og centrifugeres. Formuleringen med moler foregår som beskrevet ovenfor. Filtrering Tørret sphagnum/klid inokulum filtreres under kraftig rystning, men uden brug af væske gennem et filter (polyestervæv, 38µm). Antallet af cfu/g i filtratet bestemmes. 2.2.2 Resultater vedrørende formuleringI tabel 2.8 ses den etablerede mængde cfu/g i forskellige formuleringer. Inkuberet på PDA vokser G. roseum velvilligt ud fra alginatpiller formuleret med klid eller PEG. Isolatet overlever også frysetørring i skummetmælkspulver. Begge metoder er dog ikke blevet optimeret yderligere. Filtrering En simpel filtrering af sphagnum/klid præparat har betydet en ca. femdobling af kolonidannende enheder pr. g i præparatet (3 x 109 cfu/g). Samtidig er der opnået en mere ensartet partikelsammensætning (< 38 µm) i forhold til det ufiltrerede præparat. I tabel 2.9 ses resultater for formulering af konidier fra henholdsvis fast og flydende fermentering med inerte lermineraler. Indholdet af cfu i de forskellige formuleringer svinger fra 1.6 x 109 cfu/g for chemosorb (L9) og op til 7.5 x 109 cfu/g konidier fra flydende fermentering i GM-2 (L15). Indenfor samme "batch", synes der ikke at være forskel på hvilket lermineral, der indgår i formuleringen, uanset om konidierne er produceret ved fast fermentering (L9) eller ved flydende fermentering (L16). Der er dog en tendens til et højere antal cfu/g ved formulering af pellet fra flydende fermentering end når pellet fra fast fermentering formuleres på tilsvarende vis (L13 og L15) Tabel 2.8. Kolonidannende enheder (cfu) i tre typer af formuleringer af G. roseum (IK726). Table 2.8. Colony forming units (cfu) of G. roseum in three types of formulation.
Tabel 2.9. Formulering af Gliocladium roseum (G.r.) konidier af isolatet IK726 produceret ved henholdsvis fast og flydende fermentering. Table 2.9. Formulation of conidia of Gliocladium roseum (G.r.), isolate IK726, produced by solid fermentation or liquid fermentation.
Forholdet mellem våd pellet af G. roseum og molersproduktet (w/w) 2.3 Diskussion og konklusionFlydende fermentering De indledende produktionsforsøg med flydende fermentering viser, at G. roseum (IK726) sporulerer velvilligt i flydende medie (Tabel 2.2 og 2.3). Stowell (1991) anfører, at når et produktionssystem først er udviklet ved hjælp af kolber i rystekultur, så kan metoden med få ændringer ofte opskaleres til kommerciel produktion i fermentorer. For IK726 gav 8 døgns opformering ved 20°C 1-2 x 1010 konidier/g biomasse. Efter nedtørring blev procentdelen af spiredygtige konidier estimeret til at være >15%. Harman et al. (1991) fandt til sammenligning ca 2 x 106 konidier/ml og 6 x 108 konidier per g biomasse (tørvægt) efter 4 døgns inkubation af T. harzianum på PDB ved 25°C, hvoraf kun knap 3% var spiredygtige efter nedtørring. Fast fermentering med direkte tørring Ved opformering af IK726 på sphagnum/klid med en samlet produktionstid på 16-17 døgn (inklusiv 2 døgns nedtørring) opnåes en reproducerbar produktion af IK726 på 3-8 x 108 cfu per g inokulum. En længere produktionstid giver ingen væsentlig forøgelse af udbyttet (Fig 2.1). Vækst og sporulering af IK726 i sphagnum/klid substrater er ikke særlig følsom overfor vandindholdet i substratet, idet samme produktionen af cfu per g tørret præparat opnåes med et vandindhold fra 30% til 70% (w/w). Dog er der en tendens til, at konidiernes nedtørringstolerance, det vil sig andelen af spiringsdygtige konidier efter tørring er mest stabil ved et vandindhold under eller omkring 60% (Tabel 2.7). Sammenlignes produktionen af IK726 ved fast fermentering med opnåede resultater fra andre undersøgelser af G. roseum's opformering på fast substrat ser det ud til, at der med isolatet IK726 hurtigt opnås en meget høj produktion. Opformering af isolatet PG-A-Fr-88-710 gav efter 18 døgns inkubation ved 20-23°C ca. 8.2 x 107 cfu/g på majsmel og 1.4 x 107 cfu/g på hvedeklid (Peng et al., 1992). Til sammenligning producerer IK726 3.6 x 107 cfu/g på majsmel ved 12 dage inkubation og 1 x 108 på klid inkuberet i 13 døgn. James & Sutton (1996) har opnået den største produktion ved fermentering af G. roseum (isolat 710) på opfugtede hvedekerner, nemlig 1-5 x 109 cfu/g. Processen varede dog ca. 35 døgn ved en temperatur på 20-23°C. Formulering Ved formulering af konidier fra fast fermentering i molersprodukter opnåes der med en samlet produktionstid på 15 døgn, 2.1-6 x 109 cfu/g præparat af IK726. Ved en tilsvarende formulering af konidier fra flydende fermentering i molersprodukter, opnåes der med en samlet produktionstid på 9 døgn 2.0-6.5 x 109 cfu/g præparat (Tabel 2.9). Ved formulering af G. roseum i lermineral (talkum) og majsmel opnåede Peng et al (1992) 5 x 108 cfu/g inokulum med en samlet produktionstid på 17-23 døgn. Det markedsførte Trichoderma harzianum produkt "Supresivit", der af producenten bla. anbefales til frøbejdsning har et garanteret indhold på 7 x 109 cfu/g produkt (pulverform). Det kan konkluderes, at der kan opnåes et lignende niveau for IK726 ved formulering i moler. Økonomiske betragtninger vedrørende produktion Ved økonomiske beregninger for flydende fermentering af biologiske herbicider kalkuleres der med, at der maksimalt må tilføres 2.5 l fermenterings broth per ha for at kommerciel produktion er profitabel. Ved simpel opformering af IK726 i rystekultur fåes stabilt 4 x 107 konidier/ml svarende til ca 1 x 1011/2.5 liter fermenterings broth (PDB). Når produktet anvendes til bejdsning af korn, kan man ud fra det nuværende kendskab til den effektive dosis på 1 x 104 cfu/frø (se afsnit 5.2.6) beregne, at der skal anvendes 3.6 x 1010 cfu per ha (1 x 104 cfu/frø x (160000 g udsæd per ha/0.045 g per kerne). Ved formulering i moler af biomasse fra flydende fermentering, blev der fra 2.5 l fermentorbiomasse opnået ca. 10 g molersformulering á 6 x 109 cfu/g dvs. i alt 6 x 1010 cfu per 2.5 ml PDB. Der produceres altså 2.8 gange så mange cfu på 2.5 l PDB, når disse ikke nedtørres; og 1.7 gange så mange cfu ved en tørret molersformulering, som der skal anvendes til bejdsning af udsæd til 1 ha. Med udgangspunkt i 1 kg sphagnum/klid substrat (60% vandindhold, w/w) opnåes ca 350 g sphagnum/klid inokulum svarende til ialt ca. 2.1 x 1011 cfu. Ved formulering af konidier fra fast fermentering af 1 kg sphagnum/klid substrat opnåes ca. 24 g molersformulering af IK726 svarende til 8 x 1010 cfu. Der produceres altså 5.8 gange så mange cfu i nedtørret form ud fra 1 kg sphagnum/klid substrat, og 2.2 gange så mange cfu ved en tørret molersformulering af konidier fra 1 kg sphagnum/klid substrat, som der skal anvendes til bejdsning af udsæd af 1 ha korn. Selv om sådanne simple beregninger ikke tager hensyn til tab af cfu ved en nedtørring eller under bejdseprocessen, viser de dog at flydende fermentering af IK726 er en potentielt anvendelig produktionsmetode. Konklusion G. roseum (IK726) kan produceres både ved fast og flydende fermentering. Ved formulering af konidier fra henholdsvis flydende og fast fermentering kan der opnåes 2-6 x 109 cfu per g præparat. 3 Undersøgelser af formulerede Gliocladium roseum præparaters shelf-lifeEt biologisk bekæmpelsesmiddel, der kan lagres i en lang periode uden reduktion i produktets levedygtighed, har helt afgørende en større chance for at blive kommercielt rentabelt end et produkt med kort levetid. Shelf-life Biologiske produkters evne til stabilt at overleve lagrings -og distributions perioder benævnes som oftest 'shelf-life'. Ifølge Powell (1993) er det ideelt, hvis biologiske bekæmpelsesmidler har et shelf life på 2 år i et temperaturinterval fra -5° til 30°C. Vigtigheden af stabilt shelf-life understreges af erfaringer med "Dagger", der er baseret på bakterien Pseudomonas fluorecens og udviklet til bekæmpelse af rodbrand i bomuld. Dette produkt måtte trækkes ud af markedet netop på grund af utilstrækkelig shelf-life (Powell & Jutsum, 1993). Levende organismer i form af svampe og bakterier, der udgør den aktive bestanddel i biologiske bekæmpelsesmidler, er meget følsomme overfor faktorer som temperatur og fugtighed; dels under produktions- og formuleringsprocessen og dels i lagrings - og distribueringsperioden (Connick et al., 1996; Moore et al., 1996). Svampe, herunder også G. roseum, kan i årevis overleve i kultur-samlinger (isolatsamlinger) ved brug af f.eks nedfrysningsteknikker og overpodninger, såfremt det blot drejer sig om at holde liv i et bestemt isolat (Stanburry et al., 1995). For et produkt, hvor eksempelvis sporer skal udgøre den aktive bestanddel, er det derimod afgørende at bevare såvel høj kvantitet som kvalitet af produktet. Det bør sikres ved, at sporenes spiring forbliver høj samtidig med at deres vitalitet i form af bekæmpelseseffekt overfor patogener er intakt. G. roseum Der findes ikke i litteraturen tilgængelige undersøgelser over den kvantitative overlevelse af formulerede sporer for G. roseum. Sutton et al. (1997) anfører dog i en oversigtsartikel omhandlende G. roseum, at de er i stand til at lagre konidier, produceret på hvedekerner, uden signifikant tab af overlevelse i mere end 1 år, ved 3-5°C, og i op til 3 måneder ved 20-23°C. Dette er i tråd med erfaringer fra andre svampe anvendt til biologisk bekæmpelse af skadegørere, hvor overlevelse i tørre formuleringer (pulver, piller og granulater) generelt er stabil flere måneder ved 4°C, mens overlevelsen ved 20-25°C ofte reduceres signifikant i løbet af ganske få uger eller måneder (Dandurand & Knudsen, 1993; Moore et al.,1995). Formål Formålet med nærværende undersøgelser er at evaluere overlevelsen af Gliocladium roseum (IK726) i tørrede præparater. Herunder specielt at teste effekten af faktorerne (1) lagertid, (2) lagertemperatur indenfor temperaturområdet 4°C til 20°C, (3) produktionsforhold og formulering - herunder specielt optimeret formulering type A-D samt (4) eventuelle vekselvirkninger mellem disse faktorer. 3.1 Materialer og metoderOverlevelsen af tørrede præparater af IK726 er undersøgt for lagerperioder, der løber over 45 uger (ca. 10 måneder) og op til 80 uger (ca. 20 måneder). Præparaterne er lagret ved en eller flere af følgende temperaturer: 4°, 10°, 15° og 20°C. Effekter af substratvalg og standard produktionsmetoder er undersøgt i en række lagerforsøg, hvor generelle forhold vedrørende produktion og formulering af præparater er detaljeret beskrevet i afsnit 2.1 (tabel 2.1) og afsnit 2.2. (tabel 2.9). Derudover er effekter af optimeret formulering undersøgt for en række præparater (Figur 3.6-3.10). Disse formuleringsmetoder er ikke beskrevet i rappor-ten, men blot angivet som optimeret formulering Type A, B, C og D. Optimering af produktionsmetoder (Figur 3.5, 3.7 og 3.8) er på samme måde angivet som Produktion 1, 2, 3 og 4. Det skyldes, at forhold vedrørende nyhedsværdi og patentering endnu ikke er afklaret, hvorfor metoder, der med stor sandsynlighed er patenterbare, beskyttes. Prøveudtagning og test af overlevelse For eksperimenter svarende til Figur 3.1-3.6 er der udtaget én prøver pr. behandling pr. testtidspunkt, mens der for eksperimenter svarende til Figur 3.7-3.10 er udtaget 2 prøver pr. testtidpunkt. Hver prøve består af ca. 0.05 g inokulum der udtages og afvejes sterilt. Prøven tilsættes 10 ml sterilt vand og whirlmixes 1 minut. Herefter fremstilles fortyndings-rækker og passende fortyndinger pladespredes på PDA. Metoden er beskrevet i detaljer i afsnit 2.1. Ud fra de aktuelle vejetal bestemmes antal cfu pr. g inokulum af IK726. 3.2 ResultaterI figurerne 3.1 til 3.10 ses en række overlevelseskurver for G. roseum (IK726), der illustrerer overlevelsen over tid som funktion af substrat, produktionsmetode, formulering og lagertemperatur. I alle figurer er overlevelsen angivet som logaritmen (log10 ) til bestemmelsen af cfu pr. g præparat af IK726. 3.2.1 Substrat og standardformuleringEn række lagringsforsøg er udført med henblik på at undersøge, hvordan valg af substrat til opformering af IK726 påvirker overlevelsen af tørrede præparater lagret ved 4°C. Substrater er testet dels enkeltvis og dels i specifikke kombinationer. Af overlevelseskurverne fremgår det, at overlevelsen er stabil i minimum 52 ugers ved 4°C og helt uafhængig af om substratet består af majsmel eller havregryn (Figur 3.1), sphagnum/klid (Figur 3.2-3.6), sphagnum/klid/majsmel (Figur 3.2) eller klid (Figur 3.3). Lagertemperaturer fra 4°C til 20°C I figurene 3.3 og 3.4 ses indflydelsen af stigende lagertemperatur på overlevelsen af IK726 i standardformuleringer af henholdsvis klid og sphagnum/klid inokulum. Ved en lagertemperatur på 10°C har overlevelsen som ved 4°C været stabil i over 1 år (Figur 3.4). Hæves temperaturen derimod til 15°C falder overlevelsen af IK726 typisk med en faktor 104 over en 52 ugers lagerperiode for såvel klid som sphagnum/klid inokulum (Figur 3.3 og 3.4) og ved en lagertemperatur på 20°C reduceres overlevelsen i sphagnum/klid præparater endnu hurtigere (Figur 3.4)
Figur 3.1. (3 Kb) Figur 3.2. (3 Kb) Figur 3.3. (3 Kb) Figur 3.4. (3 Kb) 3.2.2. Optimeret produktion og formuleringSom det fremgår af de foregående overlevelseskurver, er overlevelsen af IK726 ved 20°C ustabil og forholdsvis kortvarig når der anvendes standard produktions -og formuleringsmetoder. I det følgende beskrives resultater fra en række forsøg, hvor dels produktionsmetoden og dels formuleringen af antagonisten er optimeret. Procedurerne er ikke yderliger beskrevet og angives kun med typebetegnelse (Type A-D og Produktion 1-6) af hensyn til senere patenteringsmuligheder. Effekten af produktionsmetode (Produktion 1 og 2) på overlevelsen af IK726 i sphagnum/klid er undersøgt ved 4°, 15° og 20°C. Som det fremgår af figur 3.5 er det et langt svagere fald i overlevelses af IK726 fra Produktion 1 lagret ved 15° og 20°C end for Produktion 2 lagret under tilsvarende forhold. I figur 3.6 ses kurver for overlevelse i sphagnum/klid inokulum ved 4°C og 20°C. Som det fremgår af figuren, har optimeret formulering (Type A) over en periode på ca. 50 uger stabiliseret overlevelsesevnen af IK726 lagret ved 20°C på et niveau, der svarer til overlevelsen for lagring af præparat ved 4°C. For standardformuleringen af IK726 lagret ved 20°C, indtræffer der et fald i overlevelsen allerede efter ca.10 uger (Figur 3.6). Produktionsmetodens (Produktion 3-6) indflydelse på overlevelsen af G. roseum efter lagring ved 20°C er undersøgt for to typer af formulering, nemlig Type B (Figur 3.7) og Type C (Figur 3.8). For Type C formuleringen er overlevelsen af IK726 over en periode på 40 uger påvirket af produktionsmetoden. Således falder overlevelsen kun med faktor 10 for produktion 6, mens der ses et fald på ca. faktor 1000 over den samme periode for produktion 3 og 4 (Figur 3.8). Ved anvendelse af optimeret formulering (Type B) sker der en signifikant stabilisering af overlevelsesevnen efter lagring ved 20°C for alle fire produktions-metoder, dog mest udtalt for produktion 3 (Figur 3.7) Figur 3.5. (3 Kb) Figur 3.6. (4 Kb) Figur 3.7. (3 Kb) Figur 3.8. (3 Kb) Figur 3.9. (3 Kb) Molerspræparater Betydningen af optimeret formulering er også undersøgt for molerspræparater (Figur 3.9 og 3.10). Ved anvendelse af optimeret formulering (Type C) af Ik726, er overlevelsesevnen ved 20° C blevet kraftigt stabiliseret, idet overlevelsen kun er reduceret med en faktor 10 efter 45 ugers lagring (Figur 3.9). Overlevelsen af et molers-præparat fremstillet på samme tidspunkt, men med standardformulering er derimod faldet til 0 efter kun 30 ugers lagring ved 20°C. Kurverne i figur 3.10 viser resultaterne for overlevelse af IK726 i molerspræparater ved 20°C som funktion af produktionsmetoderne flydende og fast fermentering i kombination med tre formuleringstyper (standard, Type A og Type C). Optimeret formulering Type A resulterer i en meget stabil overlevelse for begge produktionsmetoder, idet 40-50% af konidierne er levende efter 11-12 måneders lagring ved 20°C. For Type C formuleringen er lagringsstabiliteten afhængig af produktions-metoden, idet overlevelsen i præparat produceret ved fast fermentering falder signifikant mindre (15% levende efter 11 måneder) end i præparatet produceret ved flydende fermentering (ca. 1% levende efter 11 måneder). I forsøget indgår desuden en standardformulering af IK726 opformeret ved fast fermentering. Denne behandling resulterer i det hurtigste og kraftigste fald i overlevelsesevnen ved sammenligning med de øvrige testede behandlinger (Figur 3.10). Figur 3.10. (5 Kb) 3.3 Diskussion og konklusionI denne del af projektet er shelf-life for udvalgte præparater evalueret. Herunder indflydelsen af metoder til produktion og formulering af Gliocladium roseum (IK726) for lagerperioder op til 80 uger og ved lagertemperaturer fra 4°C til 20°C. Lagring ved 4° og 10°C Lagring af præparater af IK726 ved 4°-10°C kan tilsyneladende ske uden særlige krav til præparatets produktion og formulering. Shelf-life af IK726 har således været stabil i minimum 1 år ved 4°C helt uafhængig af om substratet består af majsmel eller havregryn (Tabel 3.1), sphagnum/ klid (Tabel 3.2-3.6), sphagnum/klid/majsmel (Tabel 3.2) eller klid (Tabel 3.3). En lignende stabil overlevelsesevne er fundet for konidier af G. roseum opformeret på hvedekerner, der kan overleve stabilt i mere end et år ved en lagertemperatur på 4°C (Sutton et al.,1997). Derimod fandt Peng et al. (1992) at shelf-life af G. roseum i en talkum/majsmel formulering blev reduceret med en faktor 2 efter 8 ugers lagring og at andelen af levende konidier efter 20 uger var faldet med en faktor 10, selvom præparatet blev lagret ved 4°C. Lagring ved 20°C Overlevelsesevnen for IK726 lagret ved 20°C er ustabil og forholdsvis kortvarig ved anvendelse af de standard produktions- og formulerings-metoder, der er fuldt tilstrækkelige for opretholdelse af højt shelf-life ved 4°C. For denne type præparater falder overlevelsen generelt markant efter 12-20 uger lagring ved 20°C. Sutton et al. (1997) har fundet en lignende sammenhæng mellem overlevelsesevne og lagring ved høj temperatur, idet konidier af et selekteret G. roseum isolat produceret på hvedekerner maksimalt kunne lagres i op til 3 måneder ved 20-23°C uden signifikant reduktion i konidiernes overlevelse. Optimeret formulering I bestræbelserne på at stabilisere shelf-life ved 20°C er der i projektperioden udviklet flere typer af optimeret formulering (Type A-D), der i varierende grad signifikant forbedrer shelf-life. Eksempelvis er det med Type A formuleringen muligt ved lagertemperaturen 20°C, at stabilisere shelf-life i en 11-12 måneders periode (Fig 3.6 og 3.10). Produktionsmetode Produktionsmetoden har påvirket lagerstabiliteten ved 20°C for præparattyper med optimeret formulering, nemlig Type A-C (Fig 3.7, 3.8 og 3.10). Præparat formuleret ud fra konidier fra fast fermentering giver eksempelvis et svagere fald i shelf-life over en 40 ugers periode end præparat formuleret med konidier fra flydende fermentering (Figur 3.10). Connick et al. (1996) fandt at granulater af Colletotrichum truncatum formuleret med konidier fra flydende fermentering havde kortere shelf-life ved 25°C end granulater formuleret med konidier fra fast fermentering (Bacto Emerson Yp Ss agar). Moñoz et al. (1995) har vist, at T. harzianum konidier fra fast fermentering har bedre overlevelse efter lagring ved høje temperaturer end konidier fra flydende fermentering. Undersøgelser tyder således samstemmende på, at sporer fra fast fermentering generelt er mere robuste end sporer fra flydende fermentering, idet de bedre tåler lagring ved høje temperaturer. Konklusion Ud fra et kommercielt set realistisk krav om at biologiske bekæmpelsesmidler bør kunne opbevares i minimum et år ved stuetemperatur uden væsentlige tab af shelf-life synes mulighederne for praktisk anvendelse af G. roseum (IK726) at være gode. Lagring af præparater af IK726 ved 4°-10°C kan ske uden særlige krav til præparatets produktion og formulering, idet shelf-life for alle testede præparattyper har været stabil i mere end et år. Stabilisering af shelf-life ved 20°C er vanskeligere. Men ved hjælp af optimerede produktions- og formuleringsmetoder, kan overlevelsesevnen i IK726 præparater opretholdes på et stabilt højt niveau i op til et år ved 20°C. Mulighederne for kommerciel udnyttelse af IK726 er derfor gode. 4 Undersøgelse af formulerede Gliocladium roseum konidiers spiringsaktivitetEn væsentlig forudsætning for succesfuld anvendelse af biologiske bejdsemidler til effektiv bekæmpelse af patogener der angriber frøet er, at den aktive organisme i produktet aktiveres ved såning, og derefter er i stand til at kolonisere frøet. Generelt er de første 12-48 timer efter frøspiring meget kritisk for plantens videre udvikling. Infektionsmønstret for F. culmorum er således, at der dels kan ske angreb før frøet spirer og dels kan ske ret sent i spiringsprocessen, alt efter hvor patogenet er lokaliseret. For de ikke systemisk frøbårne patogener, der angriber extraembryonalt under spiringsprocessen, og for jordbårne patogener er især de tidligste fysiologiske ændringer induceret af frøets spiring, afgørende for om infektion af frøet lykkes eller mislykkes. Dette er specielt vigtigt for Pythium arter der forårsager "seed rotting" (Harman & Nelson, 1994). Propagules af Pythium spp. begynder at spire 0-4 timer efter såning og i løbet af 4-24 timer efter såning er frøkappen inficeret med Pythium (Taylor et al., 1991). Derimod begynder sporer eller mycelium af antagonistiske svampe generelt først at spire på frøets overflade 5-12 timer efter såning. Frøets kim er inficeret med Pythium spp. 24-40 timer efter såning. Det må dog understreges at spirings- og infektionshastigheder for patogene svampe arter varierer, og at Pythium spp. hører til de hurtigste. De repræsentative data, der er samlet af Harman & Nelson (1994) viser dog, at et frø er i farezonen umiddelbart efter såning og at antagonisten, der skal beskytte det, må reagere meget hurtigt for at "vinde slaget" mod patogenet. Formål Formålet med nærværende forsøg er at undersøge hvorledes produktion, nedtørring, formulering og lagring af G. roseum (IK726) influerer på konidiernes spiringsaktivitet in vitro og at sammenligne med Trichoderma harzianum, der er almindeligt anvendt til biologisk bekæmpelse. 4.1 Materialer og metoderDer fremstilles G. roseum konidiesuspensioner, dels af friske konidier høstet fra PDB+PEG200, og dels af lagrede konidier fra nedtørrede præparater, ved filtrering gennem polyestervæv, som beskrevet i afsnit 3.2.1. Sporesuspensioner af Trichoderma harzianum isolatet T3 (Wolffhechel, 1989) fremstilles ved høst fra PDA plader inkuberet 14 døgn ved stuetemperatur. Ved hjælp af en glasforstøver udsprøjtes konidiesuspensioner á 106 sporer/ml på vandagar (1,5%). Der fremstilles 3 plader pr behandling. Pladerne inkuberes i mørke ved 20°C. Forspiring Det undersøges om præinkubering i sterilt vand influerer på spiringsprocent og spiringshastighed af lagrede konidier (L4, lagret 8 mdr. ved 4°C). Konidiesuspensioner fremstilles og henstår derefter 0, 1 eller 2 timer i vandig suspension (forspiring), inden udsprøjtning på vandagar. Sucrose Det undersøges om tilsætning af en carbonhydratkilde kan inducere flere konidier til at spire eller influere på spiringshastigheden. Suspensioner af konidier fra sphagnum/klid inokulum lagret 6 måneder ved 20°C tilsættes sucrose i forholdet 0.1% (w/v) og 1% (w/v). Suspensionerne inklusive en kontrol (vand) henstår 1 time inden udsprøjtning på vandagar. Opgørelse af spiring Konidiespiring opgøres efter 2-24 timers inkubation ved hjælp af lysmikroskopi. Fra hver skål udvælges en agarblok tilfældigt, hvorpå 100 konidier fra tilfældigt udvalgte synsfelter bedømmes med hensyn til spiring. En konidie regnes som spiret hvis spirehyfen er ½ gange den korteste diameter af konidien. Spiring angives enten som procent spirede konidier på et givent tidspunkt eller ved spiringshastigheden (raten). Alle konidier, der er i stand til at spire på agar, formodes endvidere at være spiret efter 24 timer inkubation (slutspiring) se figur 7.1. Spiringsraten til et givent tidspunkt (t) = ((Antal spirede konidier til tidspunktet (t) / slutspiringen) x 100). 4.2 ResultaterDe viste resultater i figur 4.1 og tabel 4.1 og 4.2 omhandler udelukkende spiring af konidier fra standardformuleringer af IK726, mens der i tabel 4.3 indgår en behandling med optimeret formulering (Type A). Optimering beskrives ikke i detaljer af hensyn til igangværende nyheds- og patenteringsundersøgelser. Spiring i time- course I figur 4.1. ses resultater af time-course forsøg for spiring af friskhøstede konidier og konidier fra sphagnum/klid inokulum lagret henholdsvis 5 uger (Figur 4.1 a) og 7 uger (Figur 4.1 b) ved 4°og 20°C. Det ses at 70-90% af de friske konidier er spirede allerede efter 12 timer, og at der ikke spirer yderligere konidier efterfølgende. Endvidere er 20-50% af de friske konidier spiret allerede efter 4 timer. For konidier lagret ved 4°C er kun 50% af konidierne spiredygtige og for præparatet lagret ved 20°C er < 40% af konidierne i stand til at spire på vandagar indenfor 24 timer. Udover reduktion i spiredygtighed ved nedtørring og lagring ses også reduceret spiringshastighed. Et mål for hastigheden er den tid det tager for 50% af de spiredygtige konidier at spire. I eksperiment 1 (Figur 4.1 a) er det <3 t, 4½ og 5½ time for henholdsvis friske konidier, konidier lagret ved 4° og konidier lagret ved 20° C og i eksperiment 2 (Figur 4.1 b) er parametrene for spiringshastighed henholdsvis 6, 7½ og 9½ time for de ovennævnte konidietyper. Forspiring i vand Opgørelse af spiring efter 6 timers inkubation viser, at 1 til 2 timers præinkubering resulterer i en signifikant høje spiringsprocent i forhold til konidier uden forspiring (t=0) (Tabel 4.1). Præinkubering i vand influerer dog ikke signifikant på slutspiringen (24 t), idet 46-48% af konidiene er spiret uafhængig af forspiringsbehandling. Til sammenligning er 75% af de friske konidier spirede. Derimod er spiringsratent=6 for lagrede konidier med 1 eller 2 timers forspiring af samme størrelsesorden (61-70%) som for friske konidier (70%) Forspiring i sucrose Som det fremgår af tabel 4.2 har forspiring af lagrede konidier i sucrose ikke fremmet hverken spiringsrate eller slutspiring af konidier, der har været lagret 24 uger ved 20°C. Figur 4.1a og 4.1b. (5 Kb) Tabel 4.1. Effekten af forspiringtid (timer) i vand for lagrede konidier af G. roseum (IK726). Table 4.1. The effect of preincubation (hours) in water of stored conidia of G. roseum (IK726).
1) Spiringsraten= (spirede konidier til tidspunktet t=6 t/slutspiringen, t=24 t) x
100). Tabel 4.2. Spiring af G. roseum konidier lagret 24 uger ved 20°C. Konidierne er forspiret 1 time med stigende tilsætning af sucrose. Table 4.2. Germination of G. roseum conidia stored for 24 weeks at 20°C in relation to 1 hours preincubation with increasing concentration of sucrose
1) Værdier for behandlingsgennemsnit indenfor en kolonneefterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncans multiple range test. Formulering Da shelf-life af konidier lagret ved 20°C i i standardformuleringer er utilfredsstillende, er det undersøgt hvordan optimeret formulering af et sphagnum/klid præparat influerer på spiringsaktiviteten på vandagar. Som det fremgår af Tabel 4.3 er der ingen signifikant forskel i spiring efter 6 timer. Derimod er der efter 12 t signifikant forskel på spiring af konidier alt efter om disse er lagret ved 4° eller 20°C og med eller uden optimeret formulering. For lagring med optimeret formulering ved 20°C er ca. 27% af konidierne spiret, hvilket ikke er signifikant forskelligt fra spiring af konidier lagret ved 4°C, men derimod mere end dobbelt så høj som for konidier fra standardformuleringen lagret ved 20°C. Slutspiringen ved optimeret formulering er dog signifikant lavere end for konidier lagret ved 4°C, men spiringsraten (12 t) er på højde med raten for lagring ved 4°C. Ved en sammenligning af spiringsraterne for IK726 generelt og friske T.harzianum sporer ses det endvidere, at selv de dårligst spirende konidier af IK726 spirer langt hurtigere end Trichoderma sporene, idet <1% af disse er spiret i løbet af 12 timers inkubation ved 20°C. Tabel 4.3. Spiring på vandagar af G. roseum konidier lagret 18 uger og frisk høstede konidier af G. roseum og T. harzianum. Table 4.3. Germination of G. roseum conidia stored for 18 weeks and freshly harvested conidia of G. roseum and T. harzianum on water agar.
1) Standardformulering af sphagnum/klid præparat. 4.3 DiskussionSpiringsprocent Ved nedtørring af G. roseum (IK726) konidier sker der en signifikant reduktion af spiringsprocenten ved sammenligning med friske konidier, hvor mere end 90% af konidierne som oftest er spiredygtige. Konidiers manglende tolerance overfor nedtørring er ikke specielt knyttet til G. roseum, idet lav nedtørringstolerance forekommer hos mange svampe-arter, hvor konidier udgør den aktive ingrediens i mikrobiologiske be-kæmpelsesmidler, eksempelvis Trichoderma spp. (Harman et al., 1991). Ud fra undersøgelserne af IK726's konidiespiring på vandagar, er det ikke muligt at afgøre, om uspirede konidier er døde og/eller om de befinder sig i en hviletilstand. En række forspiringsbehandlinger i form af præ-inkubering i vand eller sucroseopløsninger blev afprøvet, for at undersøge om flere konidier kunne induceres til at spire. Ingen af de afprøvede behandlinger gav dog en forøget konidiespiring. Spirehastighed Nedtørring af G. roseum konidier resulterer i en signifikant reduktion i spiringshastigheden ved sammenligning med frisk høstede konidier, men både friske og tørrede konidier påbegynder spiring indenfor 4 timers inkubation på vandagar. Desuden reduceres spiringshastigheden af tørrede konidier med stigende lagertemperatur, men spiringshastigheden kan dog forøges signifikant ved hjælp af 1 times forspiring i vandig suspension. Spiringshastighederne for friske konidier af IK726 er af samme størrelsesorden som fundet for andre isolater af G. roseum. Sutton et al. (1997) fandt således en spiringsprocent på 70-90% for friske G. roseum konidier inkuberet 4-12 timer på bladstykker på agar ved høj luftfugtighed og 21-23°C. Optimering Reduktion i konidiernes levedygtighed og vitalitet som følge af lagring ved 20°C er en alvorlig hindring for at opnå et præparat, der kan markedsføres kommercielt. Det er dog muligt at stabilisere såvel spiringsprocent som spirehastighed af konidier lagret ved 20°C på et niveau, der nærmer sig niveauet for konidier lagret ved 4 °C (Tabel 4.3). Stabiliseringen er et resultat af optimeret formulering (Type A) af sphagnum/klid inokulum. Det faktum, at konidier af IK726 har evnen til hurtig spiring kan vise sig at være en vigtig faktor for anvendelse af IK726 til frøbejdsning. Konidier af IK726, inklusive de nedtørrede konidier, spirer langt hurtigere end eksempelvis friske konidier af T. harzianum (T3). At T. harzianum spirer forholdsvis langsomt understreges også af vandagar spiringsundersøgelser udført af Lifshitz et al. (1986). Ved 19°C var ingen konidier spiret efter 10 timer og efter 26 timer var kun 26% spiret. Ved 26°C var 14% derimod spiret efter 10 timer og alle spiredygtige konidier (98%) var spiret efter 18 timer. Sammenligningen med T. harzianum er interessant, fordi denne antagonist indgår i flere af de kommercielle produkter, der anbefales til biologisk bejdsning mod f.eks. patogenet Pythium, der som nævnt indledningsvis er et meget hurtigt spirende patogen. Den relativt hurtige spiring af G. roseum konidier i forhold til andre mikrosvampe anvendt til biologisk bekæmpelse understøttes endvidere af Sutton & Peng (1993), der har vist, at konidier af G. roseum spirer signifikant hurtigere på bladskiver inkuberet på agar ved 10°C-20°C end konidier af T. viride og Penicillium sp. 5 Gliocladium roseum præparaters aktivitet i Fusarium culmorum bioassayPatogenet Fusarium culmorum (W.G.SM.) Sacc. forårsager forskellige frøbårne og jordbårne sygdomme på kimplanter af byg og hvede herunder spiringsskader og fod- og rodråd (Mathre, 1982). Infektion som følge af udsædsbårent inokulum kan medføre at frøet ikke spirer eller at fremspirede planter dør eller hæmmes (Mathre, 1982). Patogenet er udbredt over det meste af verden og forekommer i alle områder hvor der dyrkes korn. Inokulum af F. culmorum i form af mycelium er lokaliseret i frøkappe og inderavner, hvilket gør patogenet sårbart overfor frøbejdsning med såvel kemiske som biologiske midler. Plante bioassay For biologiske præparater, der skal anvendes til bejdsning af korn, er der naturligvis ingen tvivl om, at en endelig evaluering af præparaternes effektivitet og stabilitet skal foretages under markforhold. Da markforsøg er både arbejdskrævende og forholdsvis dyre at udføre, og da der i Danmark kun kan anlægges forsøg med korn to gange årligt, er der behov for hurtige og billige laboratoriemetoder til udvikling, evaluering, optimering og justering af formuleringer af antagonisten. I den forbindelse er helplante assay (plante bioassay) at foretrække, idet man herved får mulighed for at undersøge vekselvirkning mellem plante, antagonist og patogen under kontrollerede miljøforhold, og derved også har mulighed for at studere betydningen af biotiske og abiotiske faktorer i systemet. Vækstfaktorer kan holdes konstante, således at en basal viden kan opnåes om antagonistens bekæmpelsespotentiale under påvirkningen af enkeltfaktorer som temperatur, vandindhold i vækstmediet, pH osv. Betydningen af faktorer som eksempelvis applikationsmetode, formulering og dosering af antagonisten med hensyn til bekæmpelse og plantevækst kan også undersøges. Værdien af bioassay er naturligvis helt afhængig af, hvor god overensstemmelse der er mellem resultater opnået i det kontrollerede væksthus, og resultater opnået under naturlige forhold i marken. Udvælgelse af IK726 G. roseum isolat IK726 er udvalgt på baggrund af screening af 340 isolater fra økologisk og konventionelt dyrket agerjord for antagonisme overfor F. culmorum og Bipolaris sorokiniana (Knudsen, 1994). Første screening udførtes i små potter med sand, hvor frø blev inokuleret med sporesuspensioner dels af patogenet og dels af den potentielle antagonist og derefter inkuberet ved 15°C i 19 dage. Isolater der udviste >50% bekæmpelse blev yderligere testet på frø naturligt inficeret med F. culmorum eller B. sorokiniana, først i sand og siden efterfulgt af screening i markjord. Efter denne hierarkisk procedure var adskillige lovende isolater tilbage, hvoraf 3 blev afprøvet i markforsøg. To isolater gav under markforhold god bekæmpelse af F. culmorum og B. sorokiniana, hvoraf det bedste isolat, G. roseum (IK726), var på højde med kemisk bejdsning. Dette isolat blev derfor udvalgt til videre undersøgelser (Knudsen et al., 1995). Den ovenstående succesfulde screeningsproces viser, at bioassay bygget op omkring kunstig frøsmitte efterfulgt af bejdsning med antagonisten giver et rimeligt udtryk for, hvad der kan forventes i marken, ihvertfald for isolater af G. roseum. Undersøgelser under dette projekt har siden samstemmende vist, at der er en overordentlig høj korrelation mellem resultater fra markforsøg og resultater fra plante- bioassay med hensyn til bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning med IK726 (se kap. 9, fig 9.1). Formål Formålet med nærværende forsøg er at undersøge bekæmpelsen af F. culmorum ved bejdsebehandlinger med G. roseum (IK726) i plante-bioassay herunder specielt at undersøge (1) bekæmpelse af F. culmorum i relation til produktion, formulering og lagring af IK726 præparater, (2) bekæmpelse af F. culmorum i relation til kombination af IK726 med klæbemidler, (3) sideeffekter på planteetablering ved bejdsning med IK726 og (4) at fastlægge dosis-respons kurver for bejdsning med IK726. 5.1. Materialer og metoderPatogen og smitteprocedure I de udførte bioassay er der primært benyttet frø af byg, der er inokuleret med sporer af F. culmorum, isolat No. 5. Effekten af IK726 overfor naturlig frøsmitte er undersøgt ved hjælp af et parti naturligt inficeret frø af bygsorten "Bamse". Infektion af "Bamse"med F. culmorum blev efter inkubation af kerner på fugtigt filtrerpapir under nær-UV lys (blottertest) opgjort til 30%, og det gennemsnitlige sygdomsindeks ved udsåning af frø i sandtest er opgjort til 1.2. Skalaen for opgørelse af sygdomsindekset er beskrevet nedenfor. F. culmorum inokulum Inokulum af F. culmorum til frøsmitte blev opformeret på PDA. Til hvert bioassay er der benyttet en stamkultur af No. 5, der opbevares på PDA i 10% glycerol ved -80°C. Stamisolatet inkuberes 1 uge på PDA og overpodes til PDA for yderligere 1 uges inkubation. Sporer høstes ved at tilføre plader 20 ml H2O, forsigtigt at skrabe mycelium inklusive sporer af agaren og derefter filtrere gennem 2 lag gaze. I det vandige filtrat indstilles sporekoncentrationen til 1.5 x 106 sporer/ml vand ved hjælp af tællekammer. Overfladesterilisering Inden frø af sorterne "Alis Abed" eller "Paloma" inokuleres med F. culmorum bliver de overfladesteriliset ved dypning i i 70% ethanol, 10 min. i NaOCl (2,5%) efterfulgt af 3 x 1 minuts skylning i sterilt vand (Knudsen, 1994). Frøene tørrer 12-18 timer ved stuetemperatur i sterilbænk før smitning med patogenet. Frø smittes ved omrystning (30 min, 150 rpm) i F. culmorum sporesuspensionen i forholdet 1:2 (w/v) og herefter tørrer frøene 24 t i sterilbænk. Smittede frø opbevares ved 4°C. Biologisk bejdsning Bejdsning af såvel smittede som usmittede frø foretages ved omrystning af frø i en sporesuspension af antagonisten (1:2 w/v). Kontrolbehandlinger er på tilsvarende vis behandlet med vand. Suspensioner af friskhøstede konidier af IK726 fremstilles ud fra opformering i rystekultur på PDB+PEG200 og konidierne separeres fra fermentorbiomassen som beskrevet i afsnit 2.1. Til fremstilling af suspensioner ud fra tørrede præparater anvendes to metoder. Præparatet afvejes i et rørglas tilsættes 10 ml H2O og rystes 1 minut på whirlmixer og (1) anvendes direkte efter indstilling til ønskede g præparat/ml (w/v) eller (2) filtreres gennem polyestervæv (38µm), der tilbageholder grove bærematerialer som sphagnum og klid, hvorefter sporekoncentrationen kan indstilles ved fortynding. Klæbemidler Tre klæbemidlers indflydelse på bekæmpelsen af F. culmorum er undersøgt. Teprosyn F2157 (Phosyn plc, York, UK), Pelgel® (The Nitragin Co., Milwaukee, WI, USA) og Sepiret® (SEPIRET Seed Film-coating, Seppic, Paris, Frankrig) er tilsat bejdsesuspensioner i koncentrationer fra 1% til 15% (w/v). Opsætning af bioassay Opsætning og udførelse af bioassay er modificeret efter Knudsen et al. (1995). Potter (4.5 x 4.5 cm) fyldes med sand opvædet med vand (3:1 v/v). Der udsåes 3 frø per potte. Hver gentagelse består af 6 sådanne potter med fælles underskål, og hver behandling har 4 gentagelser, der er randomiseret i 4 blokke (kasser). Hver kasse monteres med et trådnet- stativ og overtrækkes med en plastpose, hvilket sikrer høj luftfugtighed og god plads til planternes vækst. Standardbetingelserne for inkubering er 19 døgn ved 15°C og en lyscyklus på 12 t lys efterfulgt af 12 t mørke. Efter 13 døgns inkubation vandes hver gentagelse med 50 ml Hornum-gødningsblanding (5 ml/l). Ved undersøgelser af temperaturens indflydelse på antagonistens bekæmpelseseffekt blev planter endvidere dyrket ved: 10°C med en lyscyklus på 12 t lys og 12 t mørke over en periode på 24 døgn og i 14 døgn med følgende temperatur -og lyscyklus; 16 t lys ved 20°C efterfulgt af 8 t i mørke ved 15°C. Opgørelse af bioassay Planterne frigøres forsigtigt for sand, vaskes og klassificeres efter symptomer på koleoptile, rødder og frø. Bedømmelsesskalaen for angreb af F. culmorum går fra 0-4, hvor 0=raske planter med hvide rødder, 1= Svag brunfarvning i pletter på rødder eller koleoptile, 2= Kraftig brunfarvning rundt om stængel/koleoptile eller af rodsystemet, 3 = Meget kraftig brunfarvning af stængel/koleoptile og rødder (evt. svækket plante), og 4 = Frøet uspiret og rødfarvet eller planten død/døende efter fremspiring. For hver gentagelse (6 x 3 planter) udregnes et gennemsnit af karaktererne, der betegnes sygdomsindeks (SI). Uspirede frø uden symptomer medtages ikke i beregningen af SI. Fremspiring beregnes som procent spirede planter af alle såede frø. Tørvægt af ovenjordiske plantedele bestemmes i udvalgte plante-bioassay efter 2 døgns tørring ved 60°C og angives i mg/plante. Dosering af IK726 Antallet af levedygtige IK726 konidier pr. frø ved udsåning bestemmes efter afvaskning og pladespredning. Frø smittet med F. culmorum og bejdset med IK726 kan ikke anvendes til bestemmelsen, idet konidier fra begge svampe derved afvaskes og spirer på PDA, hvilket gør bestemmelse af cfu/frø usikker. I stedet anvendes overfladesteriliserede frø, der er bejdset med IK726 svarende til de behandlinger med Fusarium smittede frø, der indgår i de specifikke bioassay. Der udtages 20 bejdsede frø, der mixes med 20 glaskugler og 3 ml sterilt H2O og rystes på whirlmixer i 1 minut. På PDA pladespredes 3 x 100µl for hver af 3 relevante fortyndinger, der er estimeret ud fra sporetællinger i tællekammer. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur og aflæses efter 2,3 og 4 døgn. Herudfra estimeres antal cfu/frø. Statistik 'Variansanalyser er udført i SAS ved hjælp af procedurerne Proc Glm og Proc Corr. For balancerede blokforsøg med to eller tre klassevariable er forsøgene desuden analyseret for eventuelle vekselvirkninger. Behandlingsgennemsnit sammenlignes ved hjælp af Duncan's multiple range test eller LSD0.95-værdier. I nedenstående tekst og tabeller refereres der ofte til præparatnumre som eksempelvis L3 og P4. For standardformuleringer er yderliger detaljer vedrørende specifikke præparaters produktion og formulering beskrevet I kapitel 2 (tabel 2.1 & tabel 2.9). Optimeret formulering Derudover er effekter af optimeret formulering undersøgt for enkelte præparater (Tabel 5.7-5.9 og 5.13). Metoder til optimering af formuleringer er ikke beskrevet i rapporten, men blot angivet som optimeret formulering Type A, B, C. 5.2 Resultater5.2.1. Effekt af lagertid, lagertemperatur og formulering for sphagnum/klid præparaterI tabellerne 5.1 - 5.10 ses resultater fra en række række bioassay, der er udført med henblik på at undersøge hvordan lagertid og lagertemperatur samt formulering påvirker bekæmpelseseffektiviteten af G. roseum sphagnum/klid præparater. Der er bejdset med konidier, der er vasket ud af sphagnum/klid præparater undtagen for forsøget, der er refereret i tabel 5.3. I tabel 5-7-5.9 testes optimerede formuleringer, mens øvrige tabeller i afsnit 5.2.1 viser resultater fra tests af standardformuleringer. Langtidslagring ved 4°C I tabel 5.1 og 5.2 er bekæmpelseseffekten undersøgt ved bejdsning med konidier fra sphagnum/klid præparater lagret ved 4°C. De to præparater af IK726 (L4 og L5) er produceret ved fast fermentering efter samme procedure. Uanset præparatoprindelse har bekæmpelseseffekten været stabil og større end 80% efter lagringsperioder på henholdsvis 3 og 5 måneder (tabel 5.1) og 9 og 11 måneder (Tabel 5.2). Bejdsning med høj dosis af lagrede konidier har desuden givet en lige så effektiv bekæmpelse som tilsvarende bejdsning med friskhøstede konidier. Lagring ved 15° og 20°C Bekæmpelseseffekten af sphagnum/klid præparater med stigende lagringstid er også undersøgt for lagertemperaturer på 15° og 20°C og bekæmpelseseffektiviteten er sammenlignet med præparater lagret ved 4°C samt med effekten af friskhøstede konidier. Ved lagring af præparatet L3 i 4 uger ved 15°C var bekæmpelses-effekten ikke signifikant forskellig fra effekten af samme præparat lagret ved 4°C eller fra bejdsning med friske konidier af IK726 (Tabel 5.3). Tabel 5.1. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med konidier fra sphagnum/klid præparater af G. roseum (IK726). Præparaterne L4 og L5 er lagret henholdsvis 5 og 3 måneder ved 4°C. Table 5.1. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation of G. roseum (IK726). Preparations of L4 and L5 were stored, respectively, for 5 and 3 months at 4°C.
1) Bejdsningssuspensionen er indstillet til 1 x 106 sporer af IK726/ml Tabel 5.2. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med konidier fra sphagnum/klid præparater af G. roseum (IK726). Præparaterne L4 og L5 er lagret henholdsvis 11 og 9 måneder. Table 5.2. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation of G. roseum (IK726). Preparations of L4 and L5 were stored, respectively, for 5 and 3 months at 4°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 107
konidier/ml Tabel 5.3. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparatet (L3) af G. roseum (IK726) lagret 4 uger ved 4°og 15°C. Table 5.3. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L3) of G. roseum (IK726) stored 4 weeks at 4° and 15°C.
1) Bejdsningssuspensionen er indstillet til 1 x 107 konidier af IK726/ml Sphagnum/klid præparatet L4 er testet efter henholdsvis 2 ugers lagring (Tabel 5.4) og 8 ugers lagring (Tabel 5.5) ved 4°C og 20°C. Bekæmpelseseffektiviteten af konidier lagret ved 20°C ved anvendelse af 1 x 107 sporer/ml i bejdsesuspensionen har været fuldt på højde med effekten af både friske konidier og konidier lagret ved 4°C i samme koncentration. Derimod har bekæmpelseseffekten ved lav koncentration (1 x 106) været signifikant lavere, men det skal samtidigt bemærkes, at der blev estimeret et lavere antal cfu/frø. Tabel 5. 4. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med konidier fra G. roseum sphagnum/klid præparatet (L4) lagret 2 uger ved 4° og 20°C . Table 5.4. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L4) of G. roseum (IK726) stored for 2 weeks at 4° and 20°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 106
konidier/ml Tabel 5.5. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med to sphagnum/klid præparatet (L4) af G. roseum (IK726) lagret 8 uger ved 4° og 20°C. Table 5.5. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L4) of G. roseum (IK726) stored for 8 weeks at 4° and 20°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 106
konider/ml I tabel 5.6 ses resultater fra bioassay med konidier fra sphagnum/klid præparatet L12, der er fremstillet på samme måde som L4 og lagret ved 4° og 20°C. Efter 10 ugers lagring er bekæmpelseseffekten ved høj dosering signifikant dårligere for konidier lagret ved 20°C end for konidier fra samme batch lagret ved 4°C. Tabel 5.6. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning med sphagnum/klid formulering (L12) af G. roseum lagret 10 uger ved 4° og 20° C. Table 5.6. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L4) of G. roseum (IK726) stored for 10 weeks at 4° and 20°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 107
sporer/ml I tabel 5.7 ses det endvidere, at konidier fra standardformuleringer af sphagnum/klid lagret 29 uger ved 20°C yderligere har mistet bekæmpelsespotentiale i forhold til friske og 4°C lagrede konidier. Der er dog stadigvæk ved høj koncentration (1 x 107) en signifikant bekæmpelseeffekt (44% kontrol) i forhold til sygdomskontrollen. For de ovennævnte forsøg gælder det generelt set, at reduktion i F. culmorum bekæmpelse har været fulgt i af en reduktion i det estimerede antal cfu pr. frø. Det bemærkes endvidere, at plantefremspiringen i de udførte bioassay generelt ikke er påvirket signifikant af bejdsning med forskellige konidietyper (friske, tørrede, lagrede etc.) eller præparater. Optimeret formulering For at forbedre bekæmpelseseffektiviteten af præparater, der er langtidslagret ved 20°C, er der arbejdet med forskellige former for optimeret formulering. I det følgende er disse formuleringer ikke yderligere beskrevet, men benævnes type A, B og Caf hensyn til eventuel patentering. Af tabel 5.7 fremgår det, at en optimeret formuleringen (type A ) af sphagnum/klid præparatet L8 har influeret signifikant på bekæmpelsesaktiviteten. Konidier fra optimeret formulering lagret 29 uger ved 20°C har i modsætning til konidier, der er formuleret uden optimering, bekæmpet F. culmorum lige så effektivt som konidier lagret ved 4°C. Desuden viser estimaterne for antallet af cfu pr. frø, at samme dosering af lagrede konidier og friske konidier på frø giver samme grad af bekæmpelse. Tabel 5.7. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparater af G. roseum (IK726) formuleret med eller uden optimering (type A) og lagret 29 uger ved 4°C og 20°C. Table 5.7. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L8) of G. roseum (IK726) formulated with or without optimization (type A) and stored for 29 weeks at 4° and 20°C.
1) Bejdsningssuspensionen er indstillet til 1 x 107 konidier af IK726/ml I tabel 5.8 ses resultater fra bioassay, hvor konidier med optimeret formulering (type B) er testet. Efter 14 ugers lagring ved 20°C er bekæmpelsesgraden stabiliseret på samme niveau som for friske konidier og konidier lagret ved 4°C (tabel 5.8). Konidier fra ikke optimeret sphagnum/klid præparat lagret ved 20°C udviser derimod signifikant reduceret evne til at bekæmpe F. culmorum Tabel 5.8. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparater (P4) af G. roseum (IK726), der er formuleret med eller uden optimering (type B) og lagret 14 uger ved 4°C og 20°C. Table 5.8. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran preparation (P4) of G. roseum (IK726) formulated with or without optimization (type B) and stored for 14 weeks at 4°C and 20°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 107
sporer/ml Af tabel 5.9 fremgår det, at optimeret formulering (type B) ikke har kunnet opretholde en uændret bekæmpelseseffektivitet efter 30 ugers lagring ved 20°C. Den procentvise bekæmpelse af F. culmorum er på kun 51% på trods at et forholdsvis højt antal estimerede cfu per frø ved såning. Produktionstid Produktionstidens indflydelse på bekæmpelsesaktiviteten af konidier fra sphagnum/klid præparater er undersøgt efter 8 ugers lagring ved 20°C. Som det fremgår af tabel 5.10, er der ingen signifikant indflydelse på bekæmpelsen uanset om produktionstiden er 14 eller 20 dage. Bekæmpelsen har dog været markant dårligere end for friske sporer, men hertil skal bemærkes, at den estimerede koncentration af cfu/frø er betydeligt lavere for de lagrede konidier nemlig 3-4 x 103 cfu per frø mod 1.4 x 104 cfu per frø for friske konidier. Tabel 5.9. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparater (P4) af G. roseum (IK726), der er formuleret med eller uden optimering (type B) og lagret 30 uger ved 4°C og 20°C. Table 5.9. Biological control of F.culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran preparation (P4) of G. roseum (IK726) formulated with or without optimization (type B) and stored for 30 weeks at 4° and 20°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 107
sporer/ml Tabel 5.10. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparater (P4) af G. roseum (IK726) med en produktionstid på 14 eller 20 dage. Præparaterne er lagret 8 uger ved 20°C. Table 5.10. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from peat/bran formulations (P4) of G. roseum (IK726) with production time 14 days or 20 days and storage for 8 weeks at 20°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 107
sporer/ml 5.2.2 Effekt af lagertid, lagertemperatur og formulering for molerspræparaterI tabellerne 5.11- 5.15 ses resultater fra bioassay, der er udført med henblik på at undersøge hvordan lagertid, lagertemperatur og formulering påvirker bekæmpelseseffektiviteten af IK726 formuleret i moler. I modsætning til forsøgene med sphagnum/klid præparater, er konidierne ikke vasket ud af molerspræparaterne. Frøene er således i de nedennævnte assays bejdset med suspensioner af molerspræparat. I tabel 5.13 testes optimerede formuleringer, mens øvrige tabeller i afsnit 5.5.2 viser resultater fra test af standardformuleringer. Lagring ved 4° og 20° C I tabel 5.11 ses resultater for bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning med molerspræparatet (L13) lagret ved henholdsvis 4°C og 20°C. For molerspræparater i høj dosering, svarende til 9 x 103 cfu/frø, har bekæmpelsen været lige så effektiv som for friskhøstede konidier med 1 x 104 cfu/frø. Der er endvidere ingen signifikant forskel på bekæmpelses-effektiviteten uanset om molerspræparatet er lagret ved 4°C eller ved 20°C. Tabel 5.11. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med en molersformulering (L13) af G. roseum lagret 6 uger ved 4° og 20°C. Table 5.11. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with a clay formulation (L13) of G. roseum stored 6 weeks at 4°and 20°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 107
sporer/ml I table 5.12 ses bekæmpelseseffekten af bejdsning med samme molerspræparater (L13) efter 20 ugers lagring. For præparat lagret ved 4°C er bekæmpelsen stabilt større end 90% ved alle doseringer. Derimod er bekæmpelseseffektiviteten af præparat lagret ved 20°C reduceret signifikant. Der er således kun opnået > 90% bekæmpelse for den højeste dosering af præparatet lagret ved 20°C. Tabel 5.12. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med en molersformulering af G. roseum (IK726) lagret 20 uger ved 4° og 20° C. Table 5.12. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with a clay formulation (L13) of G. roseum stored 20 weeks at 4°and 20°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 107
sporer/ml Optimering Bekæmpelseseffektiviteten af molerspræparater efter langtidslagring ved 20°C er som for sphagnum/klid præparater søgt forbedret gennem optimeret formulering. To typer af optimeret formulering (type A og type C) evalueret efter 42 ugers lagring ved 20°C. Optimering ved type A har resulteret i en signifikant højere bekæmpelsesprocent end optimeret formulering type C (Tabel 5.13). Den bedste bejdsebehandling har resulteret i en bekæmpelse af F. culmorum på 77%. Det skal dog bemærkes, at sygdomsindeks i den F. culmorum smittede kontrol er meget højt (SI=3.46) samt at den usmittede kontrol har et forholdsvis højt niveau af naturlig infektion (SI=0.75). Molerstype Effekten af molerstype ved formuleringen af IK726 er undersøgt for ovntørret moler (Gm-2, pH=4.5 ) og kalcineret moler (Km-w, pH=5.5) (Tabel 5.14). De to testede molerspræparater indeholder begge 2 x 109 cfu per g. Der er ikke nogen signifikant forskel i de to formuleringer bekæmpelseseffektivitetet, når tilsvarende fortyndinger sammenlignes. Høj dosering af molerspræparat har endvidere givet samme procent bekæmpelse som standardbehandlingen med friskhøstede konidier. Det skal også bemærkes, at i dette forsøg har bejdsning med friske konidier kun resulteret i 74% bekæmpelse. Tabel 5.13. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med molerspræparatet (L15) af G. roseum (IK726) med optimeret formulerering type A eller type C, lagret 42 uger ved 20°C. Table 5.13. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with a clay preparation (L15) of G. roseum (IK726) with optimized formulation type A or type C and stored for 42 weeks at 20°C.
1) Formulering med molersproduktet Gm-2 af sporer af IK726 fra fast fermentering på
sphagnum/klid substrat. Tabel 5.14. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med to molersformuleringer af G. roseum (Gm-2 eller Km-w ) lagret 2 uger ved 4°C. Table 5.14. Control of F. culmorum by coating seeds of barley with two clay formulations of G. roseum (Gm-2 or Km-w) stored for 2 weeks at 4°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 107
sporer/ml Moler og sphagnum/klid I tabel 5.15 er bekæmpelseseffekten af et molerspræparat sammenlignet med effekten af konidier fra sphagnum/klid. Det ses, at der ikke er signifikant forskel på de to formuleringstyper med hensyn til bekæmpelse af F. culmorum. Tabel 5.15. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med præparater af G. roseum (IK726) formuleret med moler eller sphagnum/klid og lagret ved 4°C. Table 5.15. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with of G. roseum formulated with clay or peat/bran and stored at 4°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 107
sporer/ml 5.2.3 Effekt af klæbemidlerKlæbemidler er ofte en vigtig ingrediens ved såvel kemisk som biologisk frøbejdsning. For biologiske midler kan disse polymerer have to funktioner dels (1) fasthæftning af sporer og dels (2) levere næringsstoffer eller på anden måde forbedre forholdene for antagonisten og dermed medvirke til forbedret bekæmpelseseffektivitet. I den sammenhæng ønskes en selektiv virkning, da patogenet ikke må drage nytte af næring m.m. fra klæbemidlet. Middel og koncentration Tre klæbemidler Teprosyn, Sepiret og Pelgel er tilsat bejdsesuspensioner af friskhøstede IK726 konidier, der er produceret ud fra flydende fermentering på PDB eller på PDB+PEG200. Klæbemidlernes indflydelse på bekæmpelsen af F. culmorum er sammenlignet (Tabel 5.16). Teprosyn tilsat i koncentrationerne 10% og 15% (w/v) har influeret negativt på bekæmpelsen, således at bekæmpelsesprocenten med klæbemidlet kun er 40-50% mod 98% uden tilsætning af klæbemiddel. Sepiret i samme høje koncentrationer har derimod givet samme bekæmpelse som ved bejdsning med konidier i vandig suspension. Det samme er tilfældet for Pelgel (2% ,w/v). På grund af den negative effekt af Teprosyn, er der i de følgende undersøgelser kun fokuseret på Pelgel og Sepiret. I tabel 5.17 vises resultater for SI, plantefremspiring og tørvægt samt estimering af cfu af IK726 pr. frø for behandlinger med Pelgel og Sepiret i doseringer på 1% og 2½ %(w/v). Midlerne har ikke influeret signifikant på hverken SI eller planteetablering, men der er dog en tendens til at klæbemidlerne har øget tilhæftningen af konidier på frøene fra 2.5 x 103 cfu/frø til 3.1-5.5 x 103 cfu/frø afhængig af klæbemiddel doseringen. Tabel 5.16. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med friskhøstede konidier af G. roseum (IK726) i kombination med klæbemidlerne Teprosyn, Sepiret og Pelgel. Table 5.16. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726) in combination with the stickers Teprosyn, Sepiret and Pelgel.
1)G. roseum opformeret på PDB, Tabel 5.17. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med konidier af G. roseum (IK726) fra et lagret sphagnum/klid præparat i kombination med klæbemidlerne Pelgel og Sepiret. Table 5.17. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with conidia of G. roseum (IK726) from a stored peat/bran preparation in combination with the stickers Sepiret and Pelgel.
1) SI- værdier, spiringsprocenter og tørvægts-værdier efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test. Som følge af at klæbemidler i sig selv kan influere negativt på bekæmpelsen af F. culmorum, er der udført forsøg, der har til formål at afsløre eventuelle positive eller negative additive effekter af klæbemidler samt 2 og 3-faktor vekselvirkninger med F. culmorum (patogen) og G. roseum (antagonist). Klæbemidlerne (Pelgel og Sepiret (1%, w/w)), er undersøgt for variablerne SI, plantefremspiring og plantetørvægt. Pelgel Variansanalyserne for to forsøg med Pelgel (Tabel 5.18) viser som forventet stærkt signifikante hovedfaktorvirkninger af antagonist og patogen samt vekselvirkning mellem disse for både SI og plantetørvægt. I eksperiment 2, er der desuden signifikans på 5%-niveauet for tilsætning Pelgel, som følge af et gennemsnitlig højere sygdomsindeks for bejdsebehandlinger hvor Pelgel indgår (SI=1.28) end for behandlinger uden tilsætning af Pelgel (SI=1.15) (Tabel 5. 19). I begge forsøg er der desuden signifikant vekselvirkning mellem Pelgel og patogen for både SI og tørvægt. Det kommer til udtryk som henholdsvis stigende SI og faldende plantetørvægt når F. culmorum smittede frø bejdses med Pelgel, mens den modsatte tendens gør sig gældende når frø uden F. culmorum bejdses med Pelgel (Tabel 5.19). Tabel 5.18. P-værdier for variansanalyse af variablerne sygdomsindeks (SI) og tørvægt per plante for faktorerne patogen (F. culmorum), antagonist (G. roseum) og klæbemiddel (Pelgel) og deres vekselvirkninger. Table 5.18. P-values for analysis of variance of the variables disease index (SI) plant dry weight for the factors pathogen (F. culmorum), antagonist (G. roseum) and sticker (Pelgel) and their interactions in two experiments.
*** =signifikans på <0.1%-niveauet, Tabel 5.19. Effekten af frøbejdsning med G. roseum (IK726) og klæbe-midlet Pelgel på sygdomsindeks (SI) og plantetørvægt. Frøene er inokuleret med F. culmorum eller med vand (Exp. 2). Table 5.19. Effect of coating seeds of barley with G. roseum (IK726) and the sticker Pelgel on disease index (SI) and shoot dry weight. Seeds were either inoculated with F. culmorum or with water, (Exp. 2)
*** =signifikans på <0.1%-niveauet, Sepiret For Sepiret er der også udført to forsøg efter samme forsøgsplan som for Pelgel. Det vil blandt andet sige med anvendelse af samme præparat af IK726 (L15, opt. C, lagret ved 20°C) og samme frøparti ("Paloma") ± F. culmorum smitte. Der ses igen stærkt signifikante hovedeffekter af patogen og antagonist og generelt også vekselvirkning mellem patogen og antagonist for både SI og plantetørvægt (Tabel 5.20). Derimod er der ingen signifikant effekt af Sepiret-bejdsning hverken for SI eller plantetørvægt. I eksp. 3. er der dog konstateret signifikant vekselvirkning mellem patogen og klæbemiddel, der kan erkendes ved en stigning i plantetørvægten for behandlinger af F. culmorum smittede frø efter bejdsning med Sepiret, mens der for Sepiret bejdsning i usmittede behandlinger er tendens til et fald i plantetørvægten (Tabel 5.21). Spiring Variansanalyser af begge klæbemidlernes effekt på plantefremspiring (resultater ikke vist) har vist, at der ikke er signifikante additive effekter af hverken Pelgel eller Sepiret og at ingen af klæbemidlerne indgår i signifikante vekselvirkning med patogen og antagonist. Tabel 5.20. P-værdier for variansanalyse af variablerne sygdomsindeks (SI) og tørvægt per plante for faktorerne patogen (F. culmorum), antagonist (G. roseum) og klæbemiddel (Sepiret) og deres vekselvirkninger. Table 5.20. P-values for analysis of variance of the variables disease index (SI) plant dry weight for the factors pathogen (F. culmorum), antagonist (G. roseum) and sticker (Sepiret) and their interactions in two experiments.
*** =signifikans på <0.1%-niveauet, Tabel 5.21. Effekter af frøbejdsning med G. roseum (IK726) og klæbe-midlet Sepiret på sygdomsindeks (SI), plantetal og tørvægt pr plante. Frøene er inokuleret med F. culmorum eller med vand. Table 5.21. Effect of coating seeds of barley with G. roseum (IK726) and the sticker Sepiret on disease index (SI), seedling stand and shoot dry weight. Seeds were either inoculated with F. culmorum or with water.
*** =signifikans på <0.1%-niveauet, 5.2.4 Bioassay med naturligt inficerede frøI tabellerne 5.22 og 5.23 ses resultater fra bioassay, der er udført med henblik på at undersøge om naturlig frøbåren smitte med F. culmorum kan bekæmpes ved bejdsning med diverse formuleringer af IK726. For de bioassay der hidtil er omtalt, er undersøgelserne baseret på, at frøene er kunstigt smittet med patogenet. Det skyldes primært, at det er vanskeligt at fremskaffe store partier af byg, der har en høj grad af naturlig F. culmorum uden samtidig at være inficeret med andre patogener. Det er derfor vigtigt at undersøge, om der er overensstemmelse mellem sygdomsbekæmpelse opnået i testsystemet med kunstig frøsmitte og den bekæmpelseseffekt der opnåes ved anvendelse af naturlig inficeret frø. Bekæmpelsen af naturligt frøbårent inokulum af F. culmorum er undersøgt ved bejdsning med friske og lagrede konidier af IK726. Af tabel 5.22 fremgår det, at konidier fra sphagnum/klid inokulum lagret 4 uger ved 4°C bekæmper en kombination af naturligt frøbårent inokulum og kunstigt tilført inokulum meget effektivt (91% bekæmpelse) og at bekæmpelsen er fuldt på højde med effekten af friske konidier. I tabel 5.23 ses resultater for bygsorten "Bamse", der er naturligt inficeret med F. culmorum (30% i blottertest). Bejdsning med konidier fra et sphagnum/klid præparat af IK726 lagret 3 uger ved 15°C giver en effektiv bekæmpelse af den naturlige frøsmitte, der ikke er signifikant forskellig fra bekæmpelseseffekten opnået med friskhøstede konidier af IK726. Tabel 5.22. Bekæmpelse af en kombination af naturlig frøsmitte og inokulering med F. culmorum1) i bioassay ved bejdsning af byg med friskhøstede konidier af G. roseum (IK726) og konidier fra et sphagnum/klid præparat lagret 4 uger ved 4°C. Table 5.22. Effect of coating seeds naturally infected and inoculated with F. culmorum with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726) and conidia from a peat/bran formulation stored for 4 weeks at 4°C.
1) Frø af bygsorten "Alexis" naturligt inficeret med F. culmorum (30%
infektion) er yderligere inokuleret med en sporesuspension F. culmorum (se
afsnit.5.1) Tabel 5.23. Bekæmpelse af F. culmorum i naturligt inficerede frø af bygsorten "Bamse" ved bejdsning med konidier af G. roseum (IK726). Der er anvendt bejdsesuspensioner af friskhøstede konidier og konidier fra et sphagnum/klid præparat (L4) lagret 3 uger ved 15°C. Table 5.23. Effect of coating seeds naturally infected with F. culmorum with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726) and conidia from a peat/ bran formulation (L4) stored for 3 weeks at 15°C.
1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 106
konidier/ml 5.2.5 Betydning af væksttemperatur for sygdomsudvikling og bekæmpelseVækstbetingelserne for korndyrkning i praksis vil under markforhold være stærkt varierende såvel indenfor en bestemt vækstsæson som mellem vækstsæsoner. Eksempelvis har jordbundstemperaturen under fremspiring stor indflydelse på, hvor hurtigt og hvor godt planterne etableres efter såning. Ved anvendelse af IK726 som biologisk bejdsemiddel til landbrugsafgrøder, må IK726 derfor være i stand til at udvise antagonisme overfor målpatogenet indenfor det temperatur- område, hvor patogenet kan inficere og sygdomsudvikling finder sted. I figur 5.1 ses resultater fra tre bioassay, der er udført med henblik på at undersøge bekæmpelsen af F. culmorum ved bejdsning med G. roseum (IK726) ved stigende væksttemperatur. F. culmorum smittede frø er behandlet dels med vand og dels med konidier af IK726 Behandlede frø er herefter inkuberet i sand ved henholdsvis 10°C, 15°C og 20°C. Med stigende inkubationstemperatur udvikler Fusarium sig hurtigere og kraftigere og forårsager slutteligt et større sygdomsangreb. Således er sygdomsindekset kun 0.54 efter 28 døgn ved 10°C, men SI stiger kraftigt til 2.87 efter 19 døgn ved 15°C og til 2.99 efter 14 døgn ved 20°C. Bejdsning med IK726 har reduceret angrebet af F. culmorum signifikant ved alle temperaturer og bekæmpelseseffektiviteten er høj ved både lav og høj temperatur, idet bekæmpelsegraden er 83% ved 10°C , 95% ved 15° og 91% ved 20°C. Figur 5.1. (4 Kb) 5.2.6 Dosis-respons for sygdomsindeksUdarbejdelse af dosis-respons kurver, der sammenholder doseringen af G. roseum (IK726) konidier på frøene med bekæmpelsen af F. culmorum, er nødvendig (1) dels for kunne fastlægge den effektive dosering og dels (2) for at undersøge stabiliteten i bekæmpelsen fra forsøg til forsøg. Friske sporer I figur 5.2 ses en doseringskurve for bejdsning med friskhøstede konidier af IK726, der er produceret ved flydende fermentering på PDB+PEG200. Den procentvise bekæmpelse af F. culmorum er afbilledet som funktion af dosis af IK726 (cfu pr. frø). Data stammer fra 8 uafhængige bioassay der i figuren er afbilledet med forskellige signaturer. Det ses, at der er en signifikant (p<0.001) høj positiv korrelation mellem log10 cfu/frø og bekæmpelsesprocenten (R=0.95). Ud fra den estimerede rette linie med formlen: Bekæmpelse (%) = 21 x log10 (cfu/frø) + 9, kan det beregnes, at 80% bekæmpelse opnåes med 2.5 x 103 cfu/frø. Tørrede sporer I figur 5.3 ses en tilsvarende doseringskurve for bejdsning med standardformulerede konidier af IK726, der er produceret på sphagnum/klid og lagret ved 4°C. Data stammer fra 13 uafhængige bioassay, der i figuren er afbilledet med forskellige signaturer. Det ses, at der også for lagrede konidier er en signifikant (p<0.001) positiv korrelation mellem log10 cfu/frø og bekæmpelsesprocenten (R=0.73), dog ikke så høj som for friskhøstede konidier. Ud fra den estimerede rette linie med formlen: Bekæmpelse(%) = 27 x log10 (cfu/frø) -19, kan det beregnes, at 80% bekæmpelse opnåes med 4.6 x 103 cfu/frø. Figur 5.2. (3 Kb) Figur 5.3. (3 Kb) 5.2.7 Dosis-respons for planteetableringEn forudsætning for at IK726 med succes kan anvendes til frøbehandling er, at den effektive dosis ikke influerer negativt på plantespiring og -vækst. I tabel 5.24 og figur 5.4 ses resultater fra to bioassay, der er udført med henblik på at undersøge om stigende dosering af IK726 konidier på frø influerer på frøspiring og plantetørvægt. Bygfrø er inokuleret med vand eller med F. culmorum og både smittede og usmittede frø er bejdsede med stigende dosering af IK726 konidier (0, 104, 105, 107 og 108 konidier/ml). I eksperiment 1 er doseringen 108 estimeret til 4 x 104 cfu/frø og samme dosering er i eksperiment 2 estimeret til 1 x 104 cfu/frø. Frøsmitte med patogenet F. culmorum influerer signifikant på såvel spiring som tørvægt/plante (Tabel 5.24), idet spiring og især tørvægt reduceres når patogenet er tilstede (Fig. 5.4). Stigende dosis af IK726 konidier på frøene har ikke influeret signifikant på hverken spiring eller tørvægt /plante. Der er heller ikke fundet signifikant vekselvirkning mellem patogen og dosering af IK726 for de to testede variabler. Dog er der i begge eksperimenter tæt på at være signifikant vekselvirkning mellem antagonist og patogen på 5 %-niveaut for variablen tørvægt/plante (p=0.067). Det skyldes formodentlig, at tørvægten i F. culmorum inficerede behandlinger øges med stigende dosering af IK726, mens stigende doseringen af IK726 ikke påvirker tørvægten i usmittede behandlinger. Tabel 5.24. P-værdierne for variansanalyse af variablerne spiring og tørvægt for faktorene F. culmorum smitte (F) og dosis af G. roseum (D) samt deres vekselvirknng (Fx D). Table 5.24. P-values for analysis of variance of the variables seedling stand and seedling dry weight for the factors F. culmorum inokulation (F), dosage of G. roseum (D) and and their interaction (FxD).
1) Signifikans på : <0.1%-niveauet= *** , på 1%-niveauet=** , og på 5%-niveauet=*. Figur 5.4. (13 Kb) Figur 5.4. Effekten af en stigende koncentration af G. roseum (konidier/ml) ved bejdsning af bygfrø med hensyn til plantefremspiring (1a og 2a) og tørvægt per plante (1b og 2b) for henholdsvis usmittede frø (vand) og frø smittet med Fusarium culmorum. De to eksperimenter er udført i vækstkammer. Figure 5.4. Effect of coating seeds of barley with increased koncentration of Gliocladium roseum (conidia/ml) on seedling stand (1a & 2a) and seedling dry weight (1b & 2b),respectively, for seeds inoculated with Fusarium culmorum and for non-inoculated seeds (water) . 5.3. Opsummering og diskussionEn væsentlig forudsætning for at et biologiske bekæmpelsesmiddel kan anvendes med succes i jordbrugserhvervet er at den biologiske bekæmpelseseffekt er høj og reproducerbar når præparatet anvendes i praksis. Kvaliteten af IK726 præparater målt som bekæmpelseseffekti-vitet overfor F. culmorum og B. sorokiniana er derfor evalueret i en række kontrollerede klimakammerforsøg med bygplanter. Bekæmpelses-effekten er i forsøgene relateret til præparaternes formulering, lagertem-peratur og lagertid. Vigtige resultater er opsummeret og diskuteret nedenfor. Lagring og formulering For lagring ved 4°C har såvel standard som optimerede formuleringer af sphagnum/klid og molerspræparater udvist stabil og effektiv bekæmpelse af F. culmorum uanset om præparaterne er lagret få uger eller op til 11 måneder. For lagring ved 20°C er formuleringen af IK726 meget afgørende for opretholdelsen af en høj bekæmpelseseffekt. For standardformuleringer af sphagnum/klid er bekæmpelseseffektivitet stabil og høj de første 2 måneder efter lagring. Herefter falder effektiviteten signifikant med stigende lagertid. Der er dog stadigvæk efter 55 ugers lagring ved 20°C en lav men signifikant bekæmpelse i forhold til sygdomskontrollen. Optimeret formulering Med optimeret formulering er det derimod muligt at opretholde en høj og stabil bekæmpelseseffektivitet efter lagring ved 20°C i adskillige måneder. Det gælder både for sphagnum/klid og molerspræparater (Tabel 5.7, 5.8 og 5.13). Optimerede præparater af Type Alagret ved 20°C har således i en testperiode på 42 uger udvist høj bekæmpelses-effektivitet overfor F. culmorum. Optimeret præparat (Type A) lagret 29 uger ved 20°C har desuden udvist en bekæmpelseseffektivitet, der er helt på niveau med effekten af tilsvarende præparat lagret ved 4°C. Tre typer af optimeret formulering, nemlig Type A, B og C, er evalueret i bioassay. Efter langtidslagring af sådanne præparater ved 20°C har Type A formuleringen været mest effektiv i bekæmpelsen af F. culmorum. Naturligt inficeret frø I klimakammerforsøg med F. culmorum er der hovedsagelig benytte frø, der er kunstigt inokuleret med patogenet. Det skyldes primært, at der med denne metode reproducerbart opnåes et meget højt sygdomsangreb. Der er dog udført tests med frø naturligt inficeret med F. culmorum. Disse viser samstemmende, at effektiviteten af såvel friske som lagrede konidier af IK726 overfor naturlig frøsmitte er fuldt på højde med effektiviteten målt i assays med kunstig frøsmitte. Forsøg med bekæm-pelse af Bipolaris sorokiniana (se Kap. 6) har desuden yderligere bekræftet, at lagrede præparater af IK726 er i stand til at bekæmpe ino-kulum af patogener, der som F. culmorum og B. sorokiniana er lokalise-ret i frøets perikarp og inderavner. Den anvendte metoden med F. culmorum inokulering må derfor betragtes som værende velegnet til evaluering af IK726 præparaters bekæmpelseseffektivitet. Klæbemidler Klæbemidler er ofte en vigtig ingrediens ved såvel kemisk som biologisk frøbejdsning. For biologiske bejdsemidler kan disse polymerer have to hovedfunktioner: (1) forøge fasthæftningen af sporer og evt andet materiale der ønskes tilført og/eller (2) levere næringsstoffer, influere på pH eller på anden måde forbedre forholdene for antagonisten således at bekæmpelses-effektiviteten forøges og stabiliseres. I den sammenhæng ønskes en selektiv virkning, da patogenet ikke må drage nytte af næring mm. fra klæbemidlet (Harman et al., 1981; Nelson et al.,1988; Taylor & Harman, 1990; Wu, 1982). Ved tilsætning af Pelgel og Sepiret (1-2½% w/v) til konidiesuspensioner af IK726, er der en klar tendens til at antal cfu pr frø øges ved sammenligning med vandig suspension. I de udførte forsøg har klæbemidlerne dog ikke generelt resulteret i en bedre bekæmpelse af F. culmorum end opnået med IK726-bejdsning uden klæbemiddel. Ved bejdsning af mere glatte frøtyper som eksempelvis ært, vil tilsætning af klæbemidler til bejdsesuspensionen dog formodentlig have større betydning for, om konidierne tilhæftes og bliver siddende på frøene. Valg af klæbemiddel Valg af klæbemiddel kan være en afgørende faktor for bekæmpelses-effektiviteten som vist for bekæmpelse af Rhizotonia solani med Trichoderma harzianum (Wu, 1982). Det gælder også i nogen grad for IK726, idet tilsætning af klæbemidlet Teprosyn i doseringer på 10 og 15 % (w/v) gav en signifikant lavere bekæmpelse end ved tilsætning af Sepiret i samme doseringer (Tabel 5.16 ). I de udførte bioassay har bejdsning af F. culmorum smittede frø med Pelgel (± IK726) generelt giver lidt højere sygdomsindeks end når der alene er bejdset med vand (± IK726). Det kan skyldes, at patogenet udnytter Pelgel som nærings-kilde. Knudsen (1994) har da også vist, at Pelgel stimulerer vækst af både G. roseum og F. culmorum in vitro. Under markforhold har bejdsning med Pelgel dog ikke influeret signifikant på sygdomsniveauet af F. culmorum (se Kap 9, tabel 9.2). Pelgel er da også generelt et meget anvendt klæbemiddel til biologisk bejdsning (Taylor et al., 1991). Sepiret har ikke påvirket sygdomsudviklingen af F. culmorum hverken i bioassays (Tabel 5.21) eller i markforsøg (se Kap. 9, tabel 9.3). Ved sammen-ligning af Sepiret og Pelgel i markforsøg har der ikke været forskel på de to klæbemidler bekæmpelseseffektivitet overfor F. culmorum og begge midler synes således at være velegnede til biologisk bejdsning af korn med IK726. Kompatibilitet med klæbemidler kan vise sig at være en vigtig egenskab, såfremt IK726 integreres med nye eller eksisterende frøbehandlingsmetoder. Dosis-respons for F.culmorum bekæmpelse Ved praktisk anvendelse af IK726 til frøbejdsning er det nødvendigt at have nøje kendskab til den dosis af antagonisten, der resulterer i en effektiv bekæmpelse af patogenet. Der er således udarbejdet dosis-respons kurver for sammenhængen mellem antal spiredygtige IK726 konidier på frøene og den procentvise bekæmpelse af F. culmorum. For konidier lagret ved 4°C er der en stærk lineær sammenhæng (r=0.73) mellem dosis (cfu/frø) og bekæmpelseseffektiviteten overfor F. culmorum, og det er estimeret, at ca. 5 x 103 cfu/frø er tilstrækkelig for en effektiv bekæmpelse (>80%). For friskhøstede konidier er der ligeledes en stærk positiv lineær sammenhæng mellem dosis og bekæmpelse af F. culmorum (r=0.95) og den effektive dosis er af samme størrelsesorden. Det viser at bekæmpelseseffekten er reproducerbar for begge konidietyper og at effektiviteten af lagrede konidier generelt er lige så høj som for friskhøstede konidier ved tests i bioassays. Med hensyn til biologisk bekæmpelse af B. sorokiniana, har en dosering på 1 x 104 cfu/frø af såvel friske som lagrede konidier af IK726 generelt givet en effektiv bekæmpelse (>80%). En dosering på ³104 cfu/frø bør derfor være tilstrækkelig til at sikre en effektive beskyttelse mod begge frøbårne patogener. Dosis-respons for planteetablering Ved undersøgelser af direkte effekter af IK726 på plantevæksten, er der for doseringer fra 101 til 4 x 104 cfu/frø ikke fundet signifikante effekter på hverken plantefremspiring eller plantetørvægt. Det er således muligt at øge doseringen af IK726 på frø væsentligt, eksempelvis i forbindelse med bekæmpelse af andre patogener, uden at influere negativt på plante-etableringen. 6 Gliocladium roseum præparaters bekæmpelsesaktivitet i Bipolaris sorokiniana bioassayBipolaris fodsyge forårsages af patogenet Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker. Ud over byg og hvede er adskillige andre græsser vært for patogenet. B. sorokiniana forekommer i de fleste af verdens bygdyrkningsområder, hvor den kan forårsage stor skade (Mathre, 1982). Når smittede bygkerner spirer kan svampen inficere rødder og kimstængel via coleorhiza og coleoptilen. Infektion med svampen forårsaget af frøbåret inokulum medfører brunfarvede coleoptiler og undertiden ses også reduceret vækst af kimplanten. Samtidig kan der forekommer brunfarvning af rødderne, og der kan opstå en slags fodsyge, der minder meget om goldfodsyge (Gaumanomyces graminis) Biologisk bekæmpelse En række kilder opsummeret af Domsch et al. (1980) indikerer, at B. sorokiniana er meget følsom overfor antagonisme fra bakterier og svampe. I såvel klimakammerforsøg som markforsøg med vårbyg er det vist, at frøbejdsning med frisk høstede konidier af Gliocladium roseum signifikant kan reducere sygdomsniveauet af B. sorokiniana (Tyner & McKinnon, 1964; Knudsen et al., 1995) Formål Formålet med nærværende forsøg er at undersøge bekæmpelsen af udsædsbårent inokulum af B. sorokiniana ved bejdsning med tørrede og lagrede konidier af G. roseum (IK726). Herunder specielt at undersøge bekæmpelse i relation til produktion, formulering, lagringsforhold og dosering af IK726. 6.1 Materialer og metoderTil undersøgelse af effekten af bejdsning med G. roseum (IK726) på bekæmpelsen af B. sorokiniana, er der udelukkende benyttet frøpartier, der er naturligt inficeret med patogenet. Metoder til opsætning og opgørelse af plantebioassay (sandtest) er generelt de samme som beskrevet for F. culmorum (se afsnit 5.1). Undtagelser herfra er beskrevet nedenfor. Frøparti Der er anvendt et parti af bygsorten "Alis Abed" høstet 1992. Infektions-graden er ved blottertest er bestemt til 76% (Knudsen et al., 1995). Dosering For ikke at influere på frøsmitten, blev frøene ikke overfladesteriliseret. Bestemmelse af antal cfu pr frø blev derfor udført ved at bejdse overfladesteriliserede frø af et usmittet frøparti med samme frøvægt, svarende til de i bioassayet indgående behandlinger. Metoden er beskrevet i detaljer under F. culmorum bioassay (afsnit 5.1). Sygdomsindeks Til bedømmelse af sygdomsindeks blev der anvendt samme skala som for F. culmorum. Det skal dog bemærkes, at der typisk er en overvægt af rodsymptomer og at symptomerne er mere mørkbrune end det ses for Fusarium. Desuden er syge/døde frø sortfarvede. 6.2 ResultaterEffekten af lagrede IK726 præparater er evalueret i en række plante- bioassay, hvor effekten af standardformuleringer, lagertemperatur og dosering er undersøgt, dels med hensyn til bekæmpelsen af B. sorokiniana, og dels med hensyn til planternes fremspiring. Tabel 6.1. Bekæmpelse af B. sorokiniana i byg ved frøbejdsning med friskhøstede konidier af G. roseum (IK726) og med konidier lagret 2 måneder i en sphagnum/klid formulering (L10) ved 4°C. Table 6.1. Control of B. sorokiniana in barley by coating seeds with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726) and conidia stored in sphagnum/peat (L10) at 4°C for 2 months.
*) Angiver koncentrationen af G. roseum (sporer/ml) i bejdsningssuspension **) SI- værdier efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test. Tabel 6.2. Bekæmpelse af B. sorokiniana i byg ved frøbejdsning med friskhøstede konidier af G. roseum (IK726) og med konidier lagret 10 måneder i en sphagnum/klid formulering (L6) ved 4°C. Table 6.2. Control of B. sorokiniana in barley by coating seeds with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726) and conidia stored in sphagnum/peat (L6) at 4°C for 10 months.
*) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 105 konidier/ml **) SI- værdier efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test. Lagring ved 4°C Konidier fra sphagnum/klid lagret ved 4°C er anvendt til bejdsning af byg naturligt inficeret med B. sorokiniana. Bekæmpelseseffekten af konidier lagret 2 måneder er ikke signifikant forskellig fra effekten af friskhøstede konidier (Tabel 6.1). Konidier fra sphagnum/klid lagret 10 måneder ved 4°C har endvidere udvist samme effektive bekæmpelse (97% bekæmpelse) som friske konidier (Tabel 6.2). Temperatur og formulering Lagertemperaturens indflydelsen på bekæmpelseseffekten af sphagnum/klid præparater lagret 6 uger ved henholdsvis 4°C og 20° C er undersøgt. Som det fremgår af tabel 6.3, er bekæmpelseseffekten af konidier lagret ved 20°C ikke signifikant forskellig fra effekten af konidier lagret ved 4°C. I samme assay er bekæmpelse med en molersformulering (L11, KM-w) lagret ved 4°C ligeledes undersøgt. Effektiviteten er lige så høj som for sphagnum/klid konidier lagret under lignende forhold (tabel 6.3). Tabel 6.3. Bekæmpelse af B. sorokiniana i byg ved frøbejdsning med friskhøstede konidier af G. roseum (IK726), konidier lagret 6 uger i en sphagnum/klid formulering (L10) ved 4°C eller 20°C og en molers-formulering af IK726 (L11) lagret ved 4°C. Table 6.3. Control of B. sorokiniana in barley by coating seeds with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726), conidia stored for 6 weeks in sphagnum/peat (L6) at 4°C or 20°C and a clay formulation of IK726 (L11) stored at 4°C.
*) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 105 konidier/ml **) SI- værdier efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test. Effekten af lagring ved 20°C er også undersøgt for molerspræparater. Af tabel 6.4 fremgår det, at 7 ugers af IK726 ved 20°C har resulteret i en lige så høj bekæmpelsesprocent som opnået med friske konidier af IK726 eller med molersformulerede konidier lagret ved 4°C. Dosering Sammenhængen mellem doseringen af IK726 konidier på frø og bekæmpelsen af B. sorokiniana er vist i figur 6.1 for henholdsvis friskhøstede og tørrede standardformulerede konidier af IK726. En reproducerbar bekæmpelseseffekt (>80%) er opnået med en dosering svarende til ca. 1 x 104 konidier pr. frø. Tabel 6.4. Bekæmpelse af B. sorokiniana i bioassay ved frø-bejdsning med friskhøstede konidier af G. roseum (IK726) og med en molersformulering af IK726 (L13) lagret 7 uger ved 4°C eller 20°C. Table 6.4. Control of B. sorokiniana in barley by coating seeds with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726) and with a clay formulation of IK726 (L13) stored 7 weeks at 4°C or 20°C.
*) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 105
konidier/ml Figur 6.1. (2 Kb Plantefremspiring For de ovennævnte bioassay gælder det endvidere, at plantespiringen ikke er signifikant påvirket af bejdsning med forskellige konidietyper eller formuleringer af IK726. Doseringer fra 1 x 102 cfu pr. frø og op til 4 x 104 cfu pr. frø har således ikke influeret på plante-etableringen. 6.3 DiskussionBejdsning af bygfrø med konidier af G. roseum (IK726) har i fire forsøg signifikant reduceret sygdomsangrebet af Bipolaris fodsyge forårsaget af udsædsbårent inokulum af patogenet. Bekæmpelsen har ved høje doseringer af IK726 ligget på 70-100%. Thirup (1996) fandt i tilsvarende bioassay med B. sorokiniana en gennemsnitlig bekæmpelsesprocent på 86% efter bejdsning med friskhøstede konidier af IK726 opformet på sphagnum/klid. Knudsen et al. (1995) opnåede kun en bekæmpelse på ca. 50% i sandtest, hvilket formodentlig skyldes, at der anvendtes en mindre effektiv bejdseteknik, hvor sporesuspensioner blev pådryppet frøene. Denne teknik har sandsynligvis givet en mindre mængde konidier/frø samt en dårligere fordeling af konidier på frøene. Formulering og lagring Forsøgene viser endvidere, at tørrede og lagrede konidier formuleret enten i sphagnum/klid eller i moler kan reducere angrebet af B. sorokiniana signifikant. De lagerbare præparaters bekæmpelses-effektivitet øger sandsynligheden for, at IK726 kan anvendes i kommerciel skala til bejdsning af korn, der ønskes beskyttet mod frøbårent inokulum af B. sorokiniana. Der er dog i forsøgene en tendens til at lagrede konidier af IK726 har en lavere bekæmpelseseffektivitet sammenlignet med friskhøstede konidier. Dosis En dosering på 1 x 104 cfu/frø for såvel friske som lagrede konidier af IK726 giver generelt en effektiv bekæmpelse (>80%) af B. sorokiniana. Dosis for bekæmpelse af frøbårnet inokulum af B. sorokiniana er dermed af samme størrelsesorden som den dosering der giver en effektiv bekæmpelse af frøbårent inokulum af F. culmorum (se afsnit 5.2.). 7 Gliocladium roseum præparaters bekæmpelsesaktivtet i Pythium ultimum bioassayDen plantepatogene svamp Pythium ultimum er udbredt over det meste af verden. Svampen findes mest i dyrkede jorde, hvor den lever saprofytisk på planterester eller nær planterødder i de øverste jordlag. Patogenet angriber en lang række plantearter, heriblandt en vigtig landbrugsafgrøde som bederoer og økonomisk vigtige væksthusafgrøder som eksempelvis agurk og salat. Desuden volder patogenet ofte alvorlige problemer i produktionen af potteplanter (Domsch et al., 1980). De største skader forekommer på frø og fremspirede planter og erkendes ved dårlig fremspiring og/eller kimplanter der dør (rodbrand). Ældre planter er generelt mindre følsomme overfor angreb, men da fysiologisk unge roddele på ældre planter er modtagelige, kan Pythium anrette store skader i eksempelvis etablerede potteplante-kulturer. I litteraturen findes adskillige eksempler på bekæmpelse af P. ultimum ved bejdsning af frø med antagonister. Herunder bekæmpelse af rodbrand i agurk med T. harzianum (Taylor et al., 1991; Cliquet & Scheffer, 1996) og bekæmpelse af rodbrand på karse og bederoe med mykoparasitten P. oligandrum (McQuilken et al., 1990). Der er derimod ikke i litteraturen fundet eksempler på bekæmpelse af P. ultimum ved bejdsning med G. roseum. Der er derfor igangsat indledende undersøgelser af IK726's biologiske bekæmpelsespotentiale overfor Pythium Formål Formålet med nærværende forsøg er at undersøge om bejdsning af sukkerroefrø med G. roseum (IK726) kan bekæmpe jordbårent inokulum af P. ultimum under kontrollerede betingelser i klimakammerforsøg. 7.1 Materialer og metoderTil undersøgelse af effekten af G. roseum bejdsning på Pythium angreb på kimplanter af sukkerroe (Beta vulgaris ssp. vulgaris) benyttes et bioassay, hvor inokulum af patogenet iblandes vækstmediet. Assayet er modificeret efter Larsen (1996). Bejdsning af frø Roesorten "Magnat" (Danisco Seed) anvendes i alle forsøgene. Frøene overflade desinficeres i 0.5% NaOCl (10 min.) efterfulgt af 3 x 1 minuts skylning i sterilt vand. Herefter tørrer frøene minimum 2 timer i sterilbænk før bejdsning med antagonisten. Konidiesuspensioner til bejdsning fremstilles som beskrevet afsnit 2.1. TiI alle forsøg anvendes et sphagnum/klid præparat lagret 20 uger ved 4°C i koncentrationen 1 x 108 og 1 x 109 sporer/ml. Patogenet Isolatet HB2 af P. ultimum, der opbevares ved 4°C på inficerede græsblade, anvendes til fremstilling af oospore inokulum. Oosporerne produceres på sphagnum som beskrevet af Green (1996). Koncentra-tionen af oosporer pr. g tørret inokulum bestemmes ved lysmikroskopi i tællekammer. Opsætning af bioassay Plastpotter 5 x 5 cm med underskåle tilsættes 100 ml vermiculit (grad II), vandes med 50 ml næringsopløsning (Hornum, 5ml/l), hvorefter der såes 12 frø per potte. Frøene dækkes med 30 ml vermiculit hvori, der om- hyggeligt er iblandet oosporeinokulum svarende til 15000 oosporer/potte. I usmittede kontrolbehandlinger udelades tilsætning af oosporer. Potterne eftervandes med 20 ml næringsopløsning. De tilsåede potter placeres på bakker i plastposer monteret med trådnetstativer for at opretholde en høj luftfugtighed. Dyrkningen sker i klimakammer ved 15°C, 12 timers lys. Hver behandling består af 6 gentagelser, der randomiseres i to blokke med 3 gentagelser per blok (bakker). Opgørelse Fremspiring bestemmes som antal planter, der har gennembrudt vækst-mediets overflade. Sygdomsindekset bedømmes på rødder og kimstængel af vaskede planter efter følgende skala: 0=helt rask plante, 1=brunlig plet på rødder eller kimstængel, 2=brunfarvning af rødder eller brun ringdannelse på kimstænglen, 3=planten væltet eller død. Endvidere tildeles uspirede frø sygdomsgraden 3. Det gennemsnitlige indeks per potte og behandling beregnes. 7.2 Resultater for Pythium ultimumDer er udført kontrollerede forsøg i klimakammer for at belyse om bejdsning med G. roseum har bekæmpelseseffekt overfor jordbårent oospore inokulum af P. ultimum. Bejdsning har i forsøg med højt sygdomsniveau reduceret Pythium angrebet signifikant (Tabel 7.1 og 7.2). Endvidere medfører bejdsning en plantefremspiring, der er ca. dobbelt så høj som i sygdomskontrollen. Ved det meget lave Pythium sygdomsniveau (Tabel 7.3), er der desuden en klar tendens til at bejdsning har reduceret sygdomsangrebet. Tabel 7.1. Biologisk bekæmpelse P. ultimum ved bejdsning af sukkerroefrø med lagrede konidier af G. roseum. 7.1. Biological control of P. ultimum by coating seeds of sugar beet with stored conidia of G. roseum.
1) Der er sået 12 frø per potte. Tabel 7.2. Biologisk bekæmpelse af P. ultimum ved bejdsning af sukkerroefrø med lagrede konidier af G. roseum. 7.2. Biological control of Pythium ultimum by coating seeds of sugar beet with stored conidia of Gliocladium roseum.
1) Der er sået 12 frø per potte. Tabel 7.3. Biologisk bekæmpelse af P. ultimum ved bejdsning af sukkerroefrø med lagrede konidier af G. roseum. 7.3. Biological control of P. ultimum by coating seeds of sugar beet with stored conidia of G. roseum.
1) Der er sået 12 frø per potte. 7.3 DiskussionKlimakammerforsøgene har vist, at bejdsning af roefrø med G. roseum (IK726) reducerer angrebet af P. ultimum forårsaget af jordbårent inokulum af patogenet. Som det fremgår af Tabel 7.2, hvor alle planter i Pythium kontrollen er døde, er bekæmpelse er også mulig, selvom angrebet er meget voldsomt. Tilsvarende undersøgelser udført af Hansen (1997) bekræfter, at frøbejdsning med IK726 kan bekæmpe P. ultimum i sukkerroe ved højt sygdomstryk. Megen forskning omkring biologisk bejdsning af frø har været rettet mod beskyttelse af frø- og kimplanter mod jordbårne plantesygdomme herunder også rodbrand forårsaget af P. ultimum. I mange tilfælde har isolater, der har vist sig effektive under laboratoriebetingelser været ineffektive under naturlige forhold. Det skyldes formodentlig blandt andet, at P. ultimum kan spire og inficere udsåede frø i løbet af 4-24 timer (se introduktionen i kapitel 4). Da patogenet spirer hurtigere end de fleste svampeantagonister stiller bekæmpelse af rodbrand ved bejdsning store krav til formuleringen af antagonisten. I den forbindelse kan fyldstoffer og klæbemidler spille en vigtig rolle. Harman & Taylor (1988) viste, at ved formulering af T. harzianum med fyldstoffet agrolic (pH 4.1) kunne bekæmpelsen af P. ultimum forøges signifikant ved sammenligning med formulering med et mere basiske fyldstof (pH=6.5). Det skyldes formodentlig, at det sure miljø der lokalt skabes i spermosfæren fremmer væksten af antagonisten mere end det fremmer væksten af patogenet. Miljøet for antagonisten kan også optimeres ved at skabe en fysisk barrierer mellem antagonist og patogen. Med film-coatings teknik kan frø tilføres et tyndt ubrudt lag (<0.1 mm) bestående af antagonist, fyldstof og klæbemiddel. Taylor et al. (1991) viste, at den fysiske barriere, skabt ved en sådan coatning, giver antagonisten mulighed for at udnytte exudater fra frøet i de primære spiringsstadier før patogenet, og dermed får antagonisten en konkurrencemæssig fordel til at etablere sig på frøet. Samtidig forlænger den fysiske barriere Pythiums infektion af frøet med 5-6 timer (Taylor et al., 1991). En gennemgang af litteraturen viser desuden, at den bedste bekæmpelse af Pythium generelt er opnået ved bejdsning med rhizosphere kompetente antagonistiske isolater (se afsnit 10.3). IK726 har i de udførteforsøg reduceret sygdomsniveauet af Pythium rodbrand selvom konidier er tilført frøene i en simpel vandig suspension. Det skyldes formodentlig at IK726 spirer relativt hurtigt (se afs. 4) og at IK726 ifølge foreløbige undersøgelser udviser en god rodkoloniseringsevne, i hvertfald på kornplanter (se kapitel 10). Det er dog muligt at bejdsningmetode og formulering skal optimeres for at opnå effektiv bekæmpelse under markforhold. IK726 i markforsøg IK726's potentiale med henblik på kommerciel biologisk bejdsning af sukkerroefrø undersøges i øjeblikket af frøfirmaet Danisco Seed. Antagonisten tilføres frøene ved hjælp af en specialudviklet film-coatnings teknik, som firmaet generelt anvender til frøbejdsning. Herved undersøges det, om IK726 umiddelbart kan indpasses i den eksisterende frøbejdsningsteknik. Dernæst udsåes bejdsede frø i markforsøg for at undersøge antagonistens effekt under naturlige forhold overfor jordbårne patogener som Pythium, Rhizoctonia, Aphanomyces, Fusarium etc. (resultater foreligger endnu ikke). 8 Undersøgelser af Gliocladium roseum formuleret og lagret på frø: shelf-life og bekæmpelse i bioassayEn kommercialisering af biologisk frøbejdsning vil være et mere realistisk alternativ til de kemiske midler, såfremt frø bejdset med G. roseum kan lagres i flere måneder. I den forbindelse må det overvejes hvilket temperaturområde, der er realistisk for lagring af biologisk bejdsede frø af en specik planteart. Cliquet & Scheffer (1996) har vist at overlevelsen af Trichoderma harzianum sporer på radisefrø påført ved film-coating, er stærkt afhængig af såvel temperatur som svampeisolat. For de to bedste isolater, observerede de en reduktion i overlevelsen på en faktor 10 efter 3 måneders lagring ved 15°C og et tilsvarende fald i overlevelsen efter 5 måneders lagring ved 4°C (Cliquet & Scheffer, 1996). Overlevelsen på frø evalueres som oftest ved in vitro tests, hvor sporer vaskes af frøene og pladespredes på agar. Herudfra kan antallet af spiredygtige sporer pr. frø estimeres. Ud over at den aktive ingrediens i et biologisk præparat (som oftest sporer) skal kunne overleve i en spiredygtig form, er det naturligvis også vigtigt at undersøge, om de overlevende sporer har bevaret deres evne til at bekæmpe patogener. Det er en test, der som minimum må fortages i plantebioassay (jfr. introduktionen i kapitel 5). Formål Formålet med nærværende forsøg er at undersøge, hvordan lagring af bygfrø bejdsede med G. roseum (IK726) konidier influerer på antagonistens overlevelse og biologisk bekæmpelsesaktivitet. Herunder (1) effekter af lagertid og lagertemperatur, (2) effekt af anvendt formuleringsmetode, og (3) bekæmpelseseffektivitet overfor udsædsbårent inokulum af Fusarium culmorum og Biplaris sorokiniana. 8.1 Materialer og metoderUndersøgelserne af overlevelse og bekæmpelseseffekt efter lagring af bejdsede frø er udført som parallelforsøg. Overfladesteriliserede frø, bejdset med de forskellige behandlinger, er anvendt til in vitro bestemmelse af overlevende antal cfu pr. frø ved afvaskning og pladespredning på PDA. Frø af sorten "Alis Abed" naturligt inficeret med B. sorokiniana, eller frø af "Alis Abed" smittet med F. culmorum er bejdset med tilsvarende behandlinger til bedømmelse af bekæmpelses-effektivitet i plantebioassay. Metoder til bejdsning og bestemmelse af cfu/frø samt metoder til opsætning og bedømmelse af bioassay er beskrevet i detaljer i afsnit 5.1 (bedømmelse af B. sorokiniana er beskrevet i afsnit 6.1). Der blev anvendt overflade-steriliserede frø af "Etna Abed" til B. sorokiniana parallelforsøgene og frø af "Alis Abed" til F. culmorum til parallelforsøget. Klæbemidler Effekten af klæbemidler på overlevelsen af IK726 blev undersøgt ved enkeltvis tilsætning af midlerne til bejdsesuspensionerne; Pelgel og carboxymethylcellulose (CMC) ( 2%, w/v) samt Teprosyn og Sepiret (10%, w/v). Klæbemidlerne er nærmere specificeret i afsnit 5.1. Optimeret formulering I afsnit 8.2 beskrives resultater vedrørende overlevelse og bekæmpelses-effekt for bejdsning med optimerede formuleringer af IK726. Metoderne er ikke yderligere beskrevet i rapporten, men blot angivet som optimeret formulering Type B og Type D. Det skyldes, at forhold vedrørende nyhedsværdi og patentering endnu ikke er afklaret, hvorfor forhold, der med stor sandsynlighed er patenterbare, beskyttes. 8.2 ResultaterResultater vist i figur 8.1-8.2 samt i tabel 8.1 omhandler udelukkende standardformuleringer af G. roseum (IK726). I figur 8.3- 8.4 samt i figur 8.5-8.6 indgår der derimod optimerede formuleringstyper, henholdsvis Type D og Type B. Klæbemidler I figur 8.1 og 8.2 ses overlevelseskurver for IK726 applikeret til overfladesteriliserede bygfrø, der er lagret ved henholdsvis ved 4°C og ved 20°C. Frøene er bejdset med vandig suspension af konidier eller med konidiesuspensioner tilsat et af klæbemidlerne Sepiret, CMC, Teprosyn eller Pelgel. Som det fremgår af figur 8.1 og 8.2 reduceres konidiernes overlevelse på bejdsede frø med en faktor 5-10 i løbet af de 24 timer, hvor de bejdsede frø tørres tilbage inden de lægges til lagring. Reduceret overlevelse som følge af nedtørring sker desuden uafhængigt af om konidierne er applikeret med klæbemiddel eller med vand. Ved lagring af bejdsede frø ved 4°C er der for alle behandlinger et lineært fald i overlevelsen set over en 52 ugers lagerperiode (Figur 8.1). Overlevelse ved formulering med Pelgel reduceres kun med faktor 10 over de 52 uger mod en reduktion med en faktor 1000 for Teprosyn, mens overlevelsen for konidier applikeret uden klæbemiddel reduceres med en faktor 100 i løbet af 52 uger (Figur 8.1). I figur 8.2 er overlevelsen af IK726 vist for bejdsede frø lagret ved 20°C. Antagonisten overlever kun få uger ved denne temperatur og allerede efter 3 uger er der generelt mindre end 100 cfu pr. frø. Applikation af IK726 i kombination med klæbemidler har ingen positiv effekt på overlevelsen ved 20°C. Figur 8.1. (3 Kb) Figur 8.2. (3 Kb) For at undersøge bekæmpelseseffekten overfor F. culmorum efter lagring af bejdsede frø, blev F. culmorum smittede frø bejdset med IK726 konidier med og uden Pelgel og lagret ved 4°C. Til hvert testtidspunkt (0, 4, 7 g 14 uger) blev F. culmorum smittede frø desuden bejdset med friskhøstede konidier af IK726, som en yderligere kontrol af, om lagring af bejdsede frø resulterer i tab af bekæmpelsesaktivitet. Som det fremgår af tabel 8.2 har bekæmpelseseffektiviteten af konidier lagret på frø ved 4°C været stabil i op til 14 uger og lige så effektiv som bejdsning med friske konidier. Desuden har tilsætning af Pelgel ved bejdsningen ikke influeret på bekæmpelseseffekten i bioassay. Tabel 8.2. Bekæmpelse af frøbårent inokulum af F. culmorum ved bejdsning med konidier af G. roseum (G.r.) efter lagring af bejdsede frø i 0, 4, 7 og 14 uger ved 4°C. Table 8.2. Biological control of seedborne inoculum of F. culmorum after coating seeds of barley with conidia of G. roseum (G.r.) after storage of coated seeds for 0, 4, 7 and 14 weeks at 4°C.
1) Indenfor kolonner er SI-værdier efterfulgt af forskellige bogstaver signifikant i følge Duncan's multiple range test. Produktionsmetode I figur 8.3 og 8.4 ses resultater fra forsøg med IK726 bejdsede og lagrede frø, der er udført med henblik på at undersøge produktionsmetodens indflydelse på IK726´s overlevelse (Figur 8.3) og bekæmpelseaktivitet overfor B. sorokiniana (Figur 8.4). IK726 er opformeret ved henholdsvis flydende og fast fermentering i kombination med optimeret formulering Type D. Bejdsede frø er lagret ved 4° og 20°C. For bejdsede frø lagret ved 4°C er overlevelsen stabil i ca. ½ år uanset produktions-metode (Figur 8.3). Derimod viser lagring af bejdsede frø ved 20°C, at konidier fra fast fermentering overlever bedre end konidier fra flydende fermentering, idet overlevelsen kun reduceres med en faktor 10 efter 12 uger lagring, mens overlevelsen af konidier fra flydende fermentering er reduceret med en faktor 10 allerede efter 6 ugers lagring ved 20°C. Desuden er alle konidier fra flydende fermentering døde efter 14 ugers lagring, mens der stadig efter 20 ugers lagring er et lavt niveau af levedygtige fast fermenterede konidier på frøene (Fig.8.3). Frø naturligt inficeret med B. sorokiniana blev som ovenfor bejdset med konidier af IK726 fra fast og flydende fermentering og lagret ved 4°C og 20°C. I Figur 8.4 ses kurver for bekæmpelseseffektivitet som funktion af lagertid for de fire behandlinger. Generelt har kurverne for bekæmpelse samme forløb som de tilsvarende kurveforløb for overlevelse (Figur 8.3). Bekæmpelseseffektiviteten efter lagring ved 4°C har stabilt ligget på 80-90% efter 32 ugers lagring, uanset om der er bejdset med konidier fra fast eller flydende fermentering (Figur 8.4). For lagring ved 20°C er bekæmpelsen for fast fermenterede konidier opretholdt på ca. 80% i 8 uger for derefter at falde lineært til ca. 40% efter ca. 20 uger lagring. For konidier fra flydende fermentering reduceres bekæmpelseseffekten derimod til ca. 40% i løbet af 10 ugers lagring (Figur 8.4). Figur 8.3. (3 Kb) Figur 8.4. (4 Kb) Produktionstid og optimeret formulering I figur 8.5 ses resultater for overlevelsen ved 20°C af G. roseum (IK726) konidier på overfladesteriliserede bygfrø. Effekten af to produktionstider (12 og 20 døgn) i kombination med enten standardformulering eller optimeret formulering (Type B) er undersøgt. Med optimeret formulering (type B) er overlevelsen uændret efter 10 ugers lagring, hvorefter der sker en reduktion med ca. en faktor 10 efter ialt 25 ugers lagring. Optimeret formulering har således medvirket til en stabilisering af overlevelsen af IK726 på frø lagret ved 20°C, idet overlevelsen ved ikke optimeret formulering kun er stabil i 4 uger for derefter at falde lineært til 0 (ingen overlevende konidier) efter 25 ugers lagring. Det ses endvidere, at effekten af optimeret formulering er uafhængig af konidiernes produktionstid (Fig. 8.5). Figur 8.5. (4 Kb) I figur 8.6 ses kurver for den procentvise bekæmpelse (i forhold til sygdomskontrollen) af udsædsbårent inokulum af Bipolaris sorokiniana over en periode på 34 uger, hvor bejdsede frø har været lagret ved 20°C. Der er som ovenfor bejdset med konidier af IK726 opformeret ved fast fermentering i henholdsvis 12 og 20 døgn og formuleret med eller uden optimeret formulering (type B) Kurveforløbene for bekæmpelseseffekten af de fire behandlinger svarer generelt til kurverne for overlevelse vist i figur 8.5. Ved optimeret formulering (type B) har bekæmpelseseffekten været >80% i op til 30 uger. Uden optimering har bekæmpelsen været >80% i op til 15 uger for konidier med en produktionstid på 20 døgn og på et lidt lavere niveau (>70%) i samme periode for konidier med en produktionstid på 12 døgn. Herefter reduceres bekæmpelseeffektiviteten markant til mindre end 50% bekæmpelse af Bipolaris sorokiniana. Figur 8.6. (5 Kb) 8.3 Diskussion og konklusionI denne del af projektet er effekten af produktionsmetoder og formulering ved bejdsning af frø med G. roseum (IK726) undersøgt med henblik på at teste, dels konidiernes overlevelse på frø, og dels deres bekæmpelses-effektivitet overfor sygdomme fremkaldt af udsædbårent inokulum af B. sorokiniana og F. culmorum. Bejdsede frø er lagret i op til 52 uger. Lagring ved 4°C For lagring af coatede frø ved 4°C er overlevelsen af IK726 i nogen grad afhængig af formuleringen. For frø bejdset med standardformulering ± klæbemiddel er overlevelsesevnen ved 4°C stabil i 3 til 4 måneder, herefter reduceres cfu/frø lineært (Figur 8.1). Bekæmpelseseffekten målt i F. culmorum bioassay har været stabil i en lignende periode (14 ugers lagring ved 4°C) og ligeså effektiv som bekæmpelse opnået ved bejdsning med frisk høstede konidier af IK726 (Tabel 8.2). En yderligere stabilisering af IK726´s overlevelse på frø ved 4°C er opnået ved anvendelse af optimeret formulering (Type D), idet overlevelsen har været stabil i ca ½ år for denne formuleringstype (fig. 8.3). Den biologiske bekæmpelsesaktivitet af de på frø lagrede konidier er desuden opretholdt i ca. 8 måneder, idet der kontinuert i denne perioder har været mere end 80% bekæmpelse af Bipolaris fodsyge fremkaldt af udsæds-bårent inokulum af B. sorokiniana. Lagring ved 20°C Overlevelsen af IK726 konidier på bygfrø er meget følsom overfor en stigning i lagertemperatur fra 4°C til 20°C. Når frø bejdses med standardformuleringer af IK726 falder overlevelsen til nul i løbet af 7-8 uger og tilsætning af klæbemidler synes ikke at influere positivt på overlevelsen ved 20°C (Fig. 8.2). Optimeret formulering Type D eller Type B har en stærkt stabiliserende effekt på konidiernes overlevelses-evne og bekæmpelseseffektivitet. Ved optimeret formulering Type D ses en meget svagere reduktion i overlevelsen over tid, og selv efter 15 ugers lagring ved 20°C er der stadig en del levende konidier på de frø, der er bejdset med konidier fra fast fermenting (Fig. 8.3). Tendensen til at konidier fra fast fermentering er mere robuste og tåler lagring ved 20°C bedre end eksempelvis konidier fra flydende fermenteret underbygges også af resultaterne fra bekæmpelsesassays (Fig. 8.4), hvor den højeste og mest stabile bekæmpelse forekommer efter bejdsning med konidier fra fast fermentering. En yderligere bekræftelse på, at fast fermenterede konidier af IK726 er mest robuste understreges af, at de også overlever bedst i molersformuleringer lagret ved 20°C (se Figur 3.10). En lignende sammenhæng er også fundet for andre svampeantagonister. Cliquet & Scheffer (1997) har eksempelvis vist, at konidier af Trichoderma harzianum produceret ved fast fermentering overlever bedre på frø af radise end konidier fra flydende fermentering. Optimeret formulering Med optimeret formulering Type B er der opnået en yderligere forbedring af overlevelsen ved 20°C sammenlignet med Type D formuleringen. Konidiernes levedygtighed er stabiliseret i op til 10 uger og set over 25 ugers lagring falder overlevelsen kun med en faktor 10 (Fig 8.3). Lige så positivt er det, at bekæmpelsesprocenten bedømt i B. sorokiniana bioassay har været stabilt >80% i op til 30 uger (7½ måned) for Type B formuleringen. Generelt ses en meget nær sammenhæng mellem konidiernes overlevelseevne og deres bekæmpelseseffektivitet. Det indikerer, at såfremt konidierne er levedygtige på frøet, så har de også bevaret et højt niveau af potentiel biologiske bekæmpelsesaktivitet. Det er dog klart at frøpartier lagret under disse forhold også må evalueres under markforhold, på trods af, at der er fundet en overordentlig god korrelation mellem resultater opnået i bioassay og resultater opnået under markforhold (se afsnit 9.2, fig 9.1). Vitalitet af konidier lagret på frø Kurveforløbet for den procentvise bekæmpelse af B. sorokiniana er i store træk identisk med kurveforløbet for overlevelsen af IK726 på frø (cfu/frø) når de to kurver sammenlignes for specifikke bejdsebehandlin-ger. Generelt har bekæmpelsen været >80%, når det samtidig er estimeret, at der er >2-5 x 103 cfu per frø. Når overlevelsen falder under 103 cfu/frø, indtræffer der nogenlunde samtidigt et markant fald i bekæmpelses-aktiviteten. Dette er i overensstemmelse med resultater fra en række bioassay med B. sorokiniana (Kapitel 6), hvor frøene er bejdset umiddelbart før udsåning. For konidier, der således ikke er lagret på frø er det estimeret at >80 bekæmpelse i langt de fleste tilfælde opnåes, når der er mere end 1 x 103 cfu/frø, samt at bekæmpelsen tilsvarende falder lineært, når dosis gradvist reduceres. Der er således ikke noget der tyder på, at konidier der er levedygtige efter flere måneders lagring på frø har mistet vitalitet af signifikant betydning for deres bekæmpelsesaktivitet. Kommercielle krav Ved en specifik anvendelse af IK726 til bejdsning af korn, vil en realistisk lagertemperatur for udsæd af kornarterne under nordiske forhold typisk være på 15°C. For vårbyg er det desuden realistisk at påregne, at de bejdsede frø skal kunne lagres i op til 8 måneder, hvilket svarer til den tidsperiode, der maksimalt går fra høst af sædekorn og til såning i marken. Vinterhvede udsåes derimod kort efter høst (september-oktober), hvorfor kravet til lagring af bejdsede frø af hvede realistisk set kan sættes til maksimalt 3 måneder. Under de givne forudsætninger bør biologisk bejdset udsæd af korn således kunne lagres i op til 8 måneder ved 15-20°C for at kunne fremstå som et realistisk alternativ til eksempelvis kemisk bejdsning. Opbevaring af frø ved 4°C kan dog være praktisk mulig for frø af højværdi afgrøder med lav frøvægt som eksempelvis visse grøntsager. Konklusion På baggrund af de formodede realistiske krav til opbevaring af biologisk bejdset korn, nemlig 8 måneder for byg og 3 måneder for hvede ved højst 20°C, synes mulighederne for praktisk anvendelse af G. roseum (IK726) at være gode. IK726 kan overleve stabilt på bejdsede frø i mindst et halvt år ved 20°C og har over en 7½ måneds lagerperiode ved 20°C udvist en stabil bekæmpelse af udsædsbårent inokulum af B. sorokiniana. Der synes derfor at være meget gode muligheder for at anvende IK726 til biologisk bejdsning af korn i praksis, specielt når det gælder hvede, der ofte kun lagres få uger efter at bejdsningen er udført. 9 Undersøgelse af Gliocladium roseum´s aktivitet i markforsøgEt generelt problem indenfor biologisk bekæmpelse af plantesygdomme er, at såvel effektivitet som stabilitet i sygdomsbekæmpelsen ofte svigter, når biologisk bekæmpelse skal overføres fra laboratoriet til naturlige vækstforhold. Dette må i høj grad formodes at bero på det komplekse samspil mellem biotiske og abiotiske miljøfaktorer og interaktioner mellem plante, patogen og antagonist under naturlige forhold. Endvidere har mange lovende antagonister været udvalgt efter in vitro screeninger, der i en lang række tilfælde har vist sig at korrelere dårligt til resultater fra markafprøvninger (Merriman & Russell,1990; Knudsen et al., 1997). En anden men ikke uvæsentlig faktor knytter sig til produktion og formulering af antagonisten. For at biologisk bekæmpelse skal være et realistisk alternativ til kemisk bekæmpelse må det biologiske midler kunne produceres billigt i en formulering, der fremmer antagonisten mest muligt og samtidig kunne lagres uden tab af overlevelse og effektivitet (Harman, 1991; Rhodes & Powell, 1994). En endelig evaluering af et biologisk middels succes må derfor foretages under de forhold, der er naturlige for den pågældende afgrøde og ved brug af en praktisk anvendelig formulering af antagonisten. For bejdsemidler til korn må midlerne nødvendigvis testes under markforhold under anvendelse af en realistisk dyrkningspraksis. I to tidligere markforsøg har Knudsen et al. (1995) vist, at bejdsning af byg og hvede udsæd med frisk høstede konidier af G. roseum (IK726) signifikant reducerer angrebet af spiringsfusariose forårsaget af frøbårent inokulum af Fusarium culmorum. Formål Formålet med nærværende undersøgelser er at undersøge bekæmpelsen af F. culmorum ved bejdsning med G. roseum (IK726), herunder at undersøge: (1) stabiliteten af den sygdomsbekæmpende effekt ved bejdsning med IK726, specielt som funktion af såtidspunktet (2) bekæmpelseseffektiviteten ved bejdsning med lagrede IK726 præparater i forskellige formuleringer, og (3) korrelationen mellem bekæmpelse opnået i bioassay og bekæmpelse opnået i markforsøg. 9.1 Materialer og metoderMarkforsøgene er udført på Landbohøjskolens forsøgsgårde i Tåstrup. Alle forsøg blev anlagt som fuldstændig randomiserede blokforsøg med 4-5 gentagelser. I 1994 blev der udført 4 ensartede rækkeforsøg med vårbygsorten "Alis Abed" kunstigt inokuleret med F. culmorum. Det primære formål var en undersøgelse af såtidspunktets indflydelse på sygdomsudvikling og biologisk bekæmpelse, specielt med henblik på jordbundstemperaturen. Denne blev målt dagligt fra første såtidspunkt og 5 uger frem (Fig. 9.1). I 1995 blev effekten af formulering og dosering af lagrede G. roseum præparater undersøgt i byg og hvede. For både byg ("Alexis") og hvede ("Sleipner" ) blev der anvendt udsæd naturlig inficeret med F. culmorum, der dog blev suppleret yderligere ved inokulation med en sporesuspension af F. culmorum. F. culmorum smitte For at få partier af byg og hvede med et højt niveau af naturlig infektion med F. culmorum, blev der i 1994 udført 2 forsøg med marksmitte af korn. Ved planternes skridningtidspunkt, hvor chancen for infektion er størst, blev der udsprøjtet sporesuspensioner af Fusarium culmorum (isolat No 5) på arealer af byg (Alexis) og hvede (Sleipner). Efter høst blev infektionen med Fusarium opgjort dels ved inkubation af kerner på fugtigt filtrerpapir under nær-UV lys (blottertest) og dels ved bestemmelse af gennemsnitlige sygdomsindeks ved udsåning af frø i sandtest (se tabel 9.1). Da der ønskes en høj infektionsgrad ved biologisk bekæmpelsesforsøg, blev alle frø desuden kunstigt inokuleret med F. culmorum (Isolat no 5). Sporer af patogenet blev høstet fra 8 dage gamle PDB rystekulturer (125 rpm) efter blendning og filtrering gennem 2 lag gaze og suspensionen blev indstillet til 1.5 x 106 sporer/ml. Frøene blev omrystet 1 time i sporesuspensionen (1:1 w/v), væsken dekanteret og frøene blev herefter lufttørret 16 timer ved stuetemperatur. Frøene opbevaredes ved 4°C i køleskab indtil anvendelse. G. roseum bejdsning Friske konidier af IK726 blev opformeret i rystekultur på PDB + PEG200 og høstet som beskrevet i afsnit 5.1. Klæbemidlerne Sepiret og Pelgel blev tilsat spore- og præparatsuspensioner på basis af vægtprocent. Formuleret sphagnum/klid præparat af G. roseum lagret ved 4°C blev anvendt til bejdsning i 1995. I vårbygforsøget blev der både anvendt en vandig suspension af sporer udvasket fra sphagnum/klid præparat (metoden beskrevet i afsnit 5.1) og en vandig suspension af sphagnum/klid præparatet. Som usmittet kontrol i forsøgene anvendtes frø overfladesteriliseret i NaOCl. I 1994 blev frøene bejdset ved omrystning i sporesuspensioner af IK726 (1:2 w/v). I 1995 blev bejdsning med IK726 og Sibutol udført ved hjælp af en forsøgsbejdsemaskine (Hege no. 11) med kapacitet til frøpartier fra 40g til 800g frø. Bejdsningen foregår ved pådrypning af væske på en roterende plade, hvorved meget små dråber slynges ud på de ligeledes roterende frø, således at væsken i princippet fordeles jævnt til hele partiet. I alle forsøg blev kontroller behandlet på tilsvarende vis med sterilt vand. Efter bejdsning blev alle frø tørret 3-4 timer ved stuetemperatur inden udsåning med forsøgssåmaskine. I 1995 blev de behandlede frø desuden udsået i sandtest (bioassay) udført som beskrevet i afsnit 5.1. I tabel 9.1 er yderligere detaljer angående behandlinger og forsøgsdesign opsummeret. Opgørelse Plantefremspiring i marken blev bedømt 3-4 uger efter såning ved optælling af planter på 3 x 1 m række pr. parcel. Sygdomsindekset blev bedømt på 3 x 20 opgravede og vaskede planter pr. parcel. En skala fra 0= rask til 4= død plante som beskrevet i afsnit 5.1 blev anvendt. Til tørvægtsbestemmelsen blev rødderne klippet af bedømte planter og de grønne skud tørret 2 døgn ved 60°C før vejning. Forsøgene blev høstet med forsøgsmejetærsker. Kerneudbyttet blev bestemt som hkg/ha ved 15% vandindhold. Tusindkornsvægten blev bestemt ved tælling af 3 x 500 kerner pr parcel. Bioassay blev opgjort 19 dage såning og sygdomsindeks, plantefremspiring og plantetørvægt blev bedømt som beskrevet ovenfor. Design og statistik For alle variable er gennemsnitsværdien pr. parcel eller potte anvendt i de videre analyser. Resultaterne er analyseret ved hjælp af de statistiske procedeurer proc glm og proc corr i programmet SAS (SAS Institut). Gennemsnitsværdier er sammenlignet ved hjælp af Duncan´s multiple range test. Tabel 9.1. Detaljeret beskrivelse af materialer og metoder for markforsøg. Table 9.1. Materials and methods for the field experiments.
1) Hegebejdse anvendt ved bejdsningen af frø Den Kgl. Veternær- og Landbohøjskole 9.2 ResultaterFrisk G. roseum/såtid Resultaterne for bygforsøget i 1994, hvor der udelukkende er anvendt friske konidier af IK726 til bejdsningen, ses i tabel 9.2. For hvert af de fire såtidspunkter er der en signifikant bekæmpelse af F. culmorum varierende mellem 40% og 73% kontrol af patogenet. Tilsætning af klæbemidlet Pelgel influerer ikke signifikant på G. roseums bekæmpelseseffektiviteten. For såtidspunkterne 13. og 20. april har de usmittede kontroller _ G. roseum et SI, der er signifikant mindre end for de G. roseum bejdsede og F. culmorum smittede behandlinger. Derimod er der ingen signifikant forskel i sygdomsniveauet den 27. april og 3. maj for usmittede kontroller og de G. roseum bejdsede, men F. culmorum smittede parceller. Det gennemsnitlige sygdomsindeks i Fusarium kontrollerne variere fra 0.79 til 1.36, men der er ikke signifikant effekt af såtidspunkt (P=0.11) med hensyn til sygdomsindekset i kontrollerne. Der er således ikke nogen effekt af, at den gennemsnitlige jordtemperatur i perioden fra såning og 7 døgn frem stiger fra ca 6°C ved første såtid og op 9°- 10°C ved såning 3-4 uger senere (Fig.9.1, Tabel 9.2). Tabel 9.2 Effekten af bejdsning med friskhøstede konidier af G. roseum (IK726) på bekæmpelsen af F. culmorum ved fire såtidspunkter for vårbyg under markforhold i 1994. Table 9.2. The effect of coating seeds of barley with freshly harvested conidia of G. roseum on the control of F. culmorum at four sowing times under field conditions in 1994.
Figur 9.1. (3 Kb)
1) Klæbemidler Pelgel (2%w/v) Lagret G. roseum/byg I tabel 9.3 ses resultater fra vårbygforsøget i 1995. Alle behandlinger med G. roseum gav en signifikant reduktion af sygdomsindekset, mens der ingen effekt var på plantefremspiring. Effekten af friske og lagrede konidier kunne desuden ikke adskilles på 5% niveauet, og der var ingen signifikant forskel på bekæmpelsen ved sammenligning af præparater lagret henholdsvis 8 og 32 uger. Sygdomsbekæmpelsen var desuden uafhængig af om der anvendtes udvaskede lagrede konidier eller konidier inklusive sphagnum/klid. Endvidere ses det, at anvendelsen af klæbemidlet Sepiret hverken påvirker sygdomsudvikling eller plantefremspiring. Tabel 9.3. Markforsøg i vårbyg 1995 (Forsøg 5) med biologisk bekæmpelse af F. culmorum. Kernerne er bejdset med G. roseum (G.r.), henholdsvis friskhøstede konidier og konidier eller præparat af sphagnum/klid formuleringer lagret 8 eller 32 uger ved 4°C. Table 9.3. Field experiment with biological seed treatment of barley for control of F. culmorum in 1995. Seeds are coated with G. roseum IK726 (G.r.) freshly harvested conidia, conidia from a peat/bran preparation stored for 8 weeks at 4°C and preparations stored respectively for 8 and 32 weeks at 4°C .
1) Klæbemidlet Sepiret (S), 1% (w/v) I tabel 9.4 ses resultater af bioassay svarende til markforsøget i tabel 9.3. I bioassayet er der også signifikant reduktion af sygdomsindekset ved bejdsning med IK726. Både for F. culmorum smittede frø og for frø i den usmittede kontrol er sygdomsniveauet desuden betydeligt højere i bioassayet (Tabel 9.4) end i markforsøget (Tabel 9.3) Tabel 9.4. Bioassay for biologisk bekæmpelse af F. culmorum med G. roseum IK726 (G.r.) bejdsebehandlinger som for markforsøg i vårbyg 1995 (Tabel 9.3). Table 9.4. Bioassay with biological control of F. culmorum with G. roseum IK726 (G.r.) for biological seed treatments similar to the barley field experiment in 1995.
1) Klæbemidlet Sepiret (S), 1% (w/v), Lagret G. roseum/hvede I 1995/1996 blev der udført markforsøg i vinterhvede, hvori der indgik biologisk bejdsning med et lagret præparat af IK726 (L6) i kombination med klæbemidlerne Sepiret og Pelgel og bejdsning med det kemiske middel Sibutol i den til hvede anbefalede dosering. Data for sygdomsindeks og plantefremspiring er vist i tabel 9.5. Alle bejdsebehandlinger af F. culmorum smittede frø medførte signifikant reduktion af SI. Høj dosering af G. roseum formuleret i sphagnum/klid gav op til 68% bekæmpelse, hvilket er fuldt på højde med effekten af bejdsning med friske konidier. Sibutol bejdsning gav den signifikant bedste sygdomskontrol (95%). Antallet af fremspirede planter pr meter række blev også signifikant forøget ved biologisk bejdsning med tendens til højere plantetal ved høj dosering af G. roseum, mens Sibutol og bejdsning med frisk G. roseum gav den signifikant bedste fremspiring. Af tabel 9.6 fremgår det, at plantetørvægten målt 4 uger efter såning forøges signifikant ved biologisk bejdsning, og at tørvægten for høj dosis af det lagrede præparat af IK726 (L6+Pelgel) ikke er signifikant forskellig fra Sibutol behandlingen (Tabel 9.6). To udbyttekomponenter, hkg kerner pr ha og tusindkornsvægt (TKV), blev målt ved høst. Alle bejdsebehandlinger har forøget udbyttet signifikant i forhold til Fusarium kontrollen fra 3.6 hkg/ha ved lav dosis af L6+Pelgel og op til 8,8 hkg/ha for Sibutol. For behandlingen L6 høj+pelgel var udbyttet på 77.2 hkg/ha ikke signifikant forskelligt fra den kemiske behandling. TKV følger det samme mønster som udbyttemålingen, med højest TKV efter Sibutol behandling (Tabel 9.6). I hvedeforsøget indgik både en usmittet kontrol og en usmittet kontrol bejdset med IK726 (L6 høj + Sepiret) for at undersøge eventuelle positive/negative effekter på plantevæksten som følge af den biologiske bejdsning. Resultater fra tabel 9.5 og 9.6 tyder ikke på, at IK726 i sig selv under markforhold påvirker hverken planteetablering eller udbytte ved høst, idet der ikke var signifikant forskel på usmittet kontrol og usmittet + IK726 med hensyn til disse variable. I tabel 9.7 ses resultater af bioassay svarende til markforsøget i tabel 9.5-9.6. I bioassayet er der også signifikant reduktion af sygdomsindekset ved bejdsning med IK726, men ingen effekt på fremspiringen. Både for F. culmorum smittede frø og for frø i den usmittede kontrol er sygdomsniveauet desuden betydeligt højere i bioassayet (Tabel 9.7) end i markforsøget (Tabel 9.5) Korrelation Sammenhængen mellem sygdomsindeks målt i markforsøg og bioassay (sandtest) er vist i figur 9.2. En korrelationsanalyse for byg og hvede af gennemsnits SI-værdier viser, at der er en signifikant (p<0.0001) og høj positiv korrelation (r=0.96) mellem resultater opnået i markforsøg og resultater opnået i bioassay. Der er dog en tendens til en afvigelse fra linien ved lave SI-værdier. Tabel 9.5. Markforsøg i vinterhvede 1995/96 (Forsøg 6) med biologisk af F. culmorum. Sygdomsbekæmpelse og plantefremspiring efter bejdsning med G. roseum IK726 (G.r.), henholdsvis friskhøstede konidier og et sphagnum/ klid præparatet lagret 30 uger (L6) ved 4°C. Table 9.5. Field experiment with biological seed treatment of wheat for control of F. culmorum in 1995/1996. Disease control and plant emergence after coating seeds with freshly harvested conidia of G. roseum IK726 (G.r.) and with a peat/bran preparation stored for 30 weeks at 4°C (L6).
1) Klæbemidlet Sepiret, 1% (w/v), 2) Klæbemidlet Pelgel, 2% (w/v) Tabel 9.6. Markforsøg i vinterhvede 1995/96 (Forsøg 6) med biologisk bekæmpelse af F. culmorum. Plantetørvægt, kerneudbytte og tusindkorns- vægt efter bejdsning med G. roseum IK726 (G.r.), henholdsvis friskhøstede konidier og et sphagnum/klid præparatet lagret 30 uger (L6) ved 4°C. Table 9.6. Field experiment with biological seed treatment of wheat for control of F. culmorum in 1995/1996. Plant dryweight, grain yield and thousand grain weight after coating seeds with freshly harvested conidia of G. roseum IK726 (G.r.) and with a peat/bran preparation stored for 30 weeks at 4°C (L6)
1) Klæbemidlet Sepiret tilsat bejdsesuspensionen, 1% (w/v) Tabel 9.7. Bioassay for biologisk bekæmpelse af F. culmorum med G. roseum IK726 (G.r.) bejdsebehandlinger som for markforsøg i vinterhvede 1995/96 (Tabel 9.5). Table 9.7. Bioassay with biological control of F. culmorum with G. roseum IK726 (G.r.) for biological seed treatments similar to the winter wheat field experiment in 1995/96 (Tabel 9.5).
1) Klæbemidlet Sepiret tilsat bejdsesuspensionen, 1% (w/v) Figur 9.2. (3 Kb) Figur 9.2. Fusarium culmorum sygdomsindeks (SI) for markforsøg med byg (forsøg 5) og hvede (forsøg 6) i relation til sygdomsindeks målt for tilsvarende behandlinger i bioassay. Figure 9.2. Fusarium culmorum disease index (SI) for field experiments with barley in 1995 and wheat in 1995/96 in relation to the disease index measured in corresponding bioassay. 9.3 Diskussion og konklusionI projektperioden er der udført seks markforsøg med biologisk bejdsning af korn med antagonisten G. roseum (IK726). Det primære formål har været at undersøge den biologiske bejdsnings bekæmpelseseffektivitet overfor spiringsfusariose fremkaldt af udsædsbårent inokulum af F. culmorum, samt at belyse eventuelle sideeffekter af den biologiske bejdsning på plantevæksten generelt. Reproducerbar effekt Et primært krav for at få godkendt et biologisk bekæmpelsesmiddel er, at der kan fremlægges en række effektivitetsdata fra forsøg der er udført under klimatiske og jordbundsmæssige forhold, der er sammenlignelige med danske forhold. Herunder også en dokumenteret virkning af midlet i forhold til en ubehandlet kontrol (Miljøstyrelsen, 1993). Resultater af nærværende forsøg viser, at bejdsning med IK726 i seks markforsøg udført i 1994 og 1995 signifikant og stabilt har reduceret angrebet af F. culmorum under de varierende klimatiske forhold i marken. Dertil kommer to markforsøg udført i 1992 og 1993 af Knudsen et al. (1995), hvor bejdsning med IK726 også signifikant har reduceret angrebet af F. culmorum i henholdsvis vårbyg og vinterhvede. Jordbundstemperatur Ifølge Malalasekera et al. (1973) sker spiring af frøet og infektion med F. culmorum formodentlig i løbet af den første uge efter såning. Den gennemsnitlige jordbundstemperatur i denne periode må derfor være afgørende for såvel infektionsniveauet som for antagonistens aktivitet. Minimumstemperaturen for vækst af F. culmorum angives til 0°C og for G. roseum til 4-8°C (Domsch et al., 1980). Den gennemsnitlige jordbundstemperatur i den kritiske perioden (fra såning og 7 dage frem) varierede i markforsøgene fra 6.2°C og op til 12°C. IK726 har således udvist antagonisme overfor F. culmorum ved de relativt lave jordtemperaturer, der er typiske for korndyrkning under danske forhold. Sutton et al. (1997) konstaterede en klart dårligere antagonistisk aktivitet af G. roseum isolater overfor Botrytis cinerea ved 10°-15°C end ved 20°-25°C. Ved afprøvning af isolatet IK726 i F. culmorum bioassay, er det derimod vist, at bekæmpelseseffekten ved 10°C (83%) er på højde med bekæmpelsen ved 15° (93%) og 20° C (90%) (se Kap. 5, afsnit 5.2.5). De foreliggende resultater tyder derfor på, at isolatet IK726 har høj antagonistisk aktivitet både ved høj og lav temperatur, ihvertfald overfor F. culmorum. Lagrede konidier af IK726 I to markforsøg blev der anvendt sphagnum/klid formuleringer af IK726 lagret i op til 6 måneder ved 4°C. De lagerede formuleringer viste sig lige så effektive ved bejdsning af byg og hvede som frisk høstede konidier. Det er således muligt at producere effektive strukturer (primært konidier) af IK726, der kan lagres uden tab af bekæmpelseseffektivitet. Det er et forhold, der yderligere er med til at understrege, at IK726 må anses som en lovende antagonist til bejdsning af korn. Som det fremgår af fig. 9.2., er der en høj korrelation mellem behandlingseffekter for sygdomsbekæmpelse opnået i markforsøg og i plantebioassay. Udvikling og optimering af IK726 præparater med hensyn til produktion, formulering og effektivitet overfor Fusarium kan således med stor sikkerhed testes i bioassay, der kun involverer 72 planter/behandling og kun varer 19 dage. Lynch & Pryn (1987) rapporterede om nedsat spiring af byg som følge af bejdsning med G. roseum. Der er dog ikke i hverken markforsøg eller bioassay med byg og hvede fundet skadelige effekter på spiring eller plantevækst (tørvægt) som følge af bejdsning med G. roseum (IK726). Se endvidere afsnit 5.2.7. Hvedeforsøget (Tabel 9.5) viste en lavere bekæmpelseseffektivitet ved bejdsning med IK726 end ved kemisk bejdsning med Sibutol. Det kan helt eller delvist skyldes forhold, der omfatter såvel dosering som bejdseteknik. Eksempelvis har resultater fra bioassay vist, at den effektive dosis af lagrede sporer ( >80% bekæmpelse) er ca. 5 x 103 cfu/frø, men i markforsøget var den estimerede dosis betydeligt lavere. Desuden er fordelingen af IK726 konidier på frøene efter bejdsning med Hege-bejdsen ikke undersøgt. Andre frøbårne sygdomme kan også bekæmpes ved bejdsning med G. roseum isolatet IK726. Således har bejdsning med IK726 under markforhold reduceret angreb af Gerlachia nivale på korn (Inge M.B. Knudsen, ikke publiseret) og udsædsbårent inokulum af Bipolaris sorokiniana i byg (Knudsen et al., 1995). I indledende forsøg med bekæmpelse af stinkbrand (Tilletia caries) i hvede har bejdsning med IK726 i markforsøg givet en reduktion i procent brandaks (Anders Borgen, Pers. kom.). Andre isolater af G. roseum har også vist effekt overfor frøbårne sygdomme. I markforsøg med majs har bejdsning med G. roseum kunnet reducere angrebet af Fusarium moniliforme (Vakiili, 1992). Frøbårent inokulum af Botrytis cinerea på kikært (Cicer arietinum L.) er også i såvel væksthus som markforsøg bekæmpet ved bejdsning med G. roseum (Burgess et al., 1997; Burgess & Keene, 1997). I den sammenhæng er det i øvrigt også interessant, at G. roseum har vist sig være en stærk antagonist overfor angreb af B. cinerea på blomster og frugter af jordbær ved udsprøjtning af antagonisten på overjordiske plantedele (Sutton et al., 1997). Jordbårne patogener Udover et stort potentiale ved bekæmpelse af frøbårne plantesygdomme, tyder flere undersøgelser på, at G. roseum også er stærkt antagonistisk overfor adskillige jordbårne patogener. Væksthusforsøg med biologisk bejdsning af sukkerroer har vist, at frø bejdsede med G. roseum (IK726) reducerede angrebet af Pythium ultimum på roekimplanter (Hansen, 1997; Kapitel 7). Angreb af Fusarium oxysporum f.sp dianthi er reduceret ved tilførsel af G. roseum til rodnettet af nelliker (Lynch & Ebben, 1986) og desuden fandt Castejón-Muñoz & Oyazun (1995), at angrebet af rodråd på ært (Fusarium solani f.sp. pisi) kunne reduceres signifikant ved iblanding af G. roseum inokulum (105 cfu/g tør jord) til voksemediet. Applikation af antagonister ved frøbejdsning må dog for landbrugsafgrøder anses for den mest sandsynlige løsning, idet iblanding af biologiske midler til landbrugsjord vil kræve udbringning store mængder produkt pr. ha. Konklusion De markforsøg, der er udført i dette projekt har for det første entydigt vist, at bejdsning af både byg og hvede med G. roseum (IK726) giver en reproducerbar bekæmpelse af frøbårent inokulum af Fusarium culmorum. Dernæst har forsøgene vist, at lagrede formuleringer af IK726 er lige så effektive som friskhøstede konidier af antagonisten. Kommercialisering af G. roseum (IK726) til biologisk bejdsning af korn synes derfor at være et realistisk alternativ til kemisk bejdsning, når det gælder bekæmpelse af spiringsfusariose forårsaget af det frøbårne patogen F. culmorum. 10 Overlevelse af Gliocladium roseum under markforhold efter udbringning med frøAntagonisters evne til at kolonisere rodoverfladen og rhizosfæren af en kulturplante er en vigtig egenskab for effektiv biologisk bekæmpelse af jordbårne plantepatogener. I forbindelse med biologisk frøbejdsning anvendes ofte betegnelsen rhizosfære kompetence, der kan defineres som mikroorganismes evne til at kolonisere rodzonen efter applikation med frøet (Baker, 1991). For bekæmpelse af jordbårne patogener ved biologisk frøbejdsning synes rhizosfære kompetence også at være en meget betydende faktor. Eksempelvis er det for frøbejdsning med Trichoderma harzianum vist, at rhizosfære kompetente stammer af antagonisten fremkommet ved genetisk manipulation bekæmper jordbårne patogener som Pythium spp langt mere effektivt end ikke rhizosfære kompetente vildtype stammer (Harman et al., 1989; Baker 1991). Formål Formålet med nærværende eksperimenter er at undersøge om udsættelse af G. roseum (IK726) i marken ved frøbejdsning af byg og hvede influerer på den mængden G. roseum spiringsenheder (cfu pr. g rod), der kan reisoleres fra rhizosfære 5-8 måneder senere. 10.1 Materialer og metoderUdsæd af byg ("Alis Abed") og hvede ("Sleipner") overfladesteriliseres og bejdses med G. roseum (IK726) efter standardprocedurerne beskrevet i kapitel 5.1. Kontrolbehandlinger behandles med vand. I bygforsøget udgøres parcellerne af 1 meters rækker med 4 gentagelser pr behandling. Hvedeforsøget udsås i parceller på 1 x 1 m med 8 gentagelser pr behandling. Fra vårbyg blev der indsamlet planter 5 måneder efter såning og fra hvede 8 måneder efter såning. Der blev opgravet 20 planter pr gentagelse svarende til i alt 80 planter/behandling for byg og 160 planter/behandling for hvede. Rodvask Kvantificering af IK726 ved hjælp af rodvask blev udført på følgende måde. Efter 1 døgns let tørring af planterne ved stuetemperatur børstes jorden af rødderne, der herefter afklippes og vejes. For hver gentagelse udtages 5 g rødder, der tilsættes 100 ml sterilt H2O og omrystes 1 time ved 150 rpm. Vaskevandet fortyndes op til 2 x 10-4 og herefter pladespredes 3 x 100 ml pr. fortynding på Trichoderma selektivt medium (TSM) (Elad & Chet, 1981). Pladerne inkuberes i mørke ved stuetemperatur og aflæses efter 14-20 dage. I tvivlstilfælde podes kolonier på PDA for identifikation. 10.2 ResultaterAf figur 10.1 fremgår det, at IK726 formodentlig er i stand til at overleve i rhizosfæren af byg og hvede i henholdsvis 5 og 8 måneder. Således blev der isoleret ca. 5 gange så mange cfu af G. roseum pr. g rod fra bygrødder og ca. 8 gange så mange cfu pr. g rod fra hvederødder fra de IK726 bejdsede forsøgsparceller ved sammenligning med isolering foretaget fra kontrol parceller (frø bejdset med vand). Figur 10.1. (3 Kb) Figur 10.1. Isolering af Gliocladium roseum på selektivt medium efter rodvask af byg og hvederødder henholdsvis 5 og 8 måneder efter såning af frø bejdset med G. roseum (IK726) eller vand. Figure 10.1. Isolation of Glicladium roseum on selective medium after washing of roots of barley and wheat, respectively, 5 and 8 month after sowing seeds coated with G. roseum (IK726) or water. 10.3 DiskussionDet kan konkluderes, at der genfindes en højere rodpopulation af G. roseum (cfu/g rod) i IK726 bejdsede parceller end i ubehandlede parceller af henholdsvis byg og hvede. Det indikerer alt andet lige, at isolatet er i stand til at kolonisere rødder af både byg og hvede. Det er ikke muligt ud fra forsøgene at fastslå om kolonisering er sket i hele rodnettets udstrækning. For andre kendte antagonister som eksempelvis T. harzianum kan isolater applikeret ved bejdsning oftest kun genfindes 1-2 cm under frøet, mens den resterende del af roden ikke koloniseres. For isolater af T. harzianum, der er rhizosfære kompetente, følger populationsdensiteten som oftest en C-formet kurve svarende til den højeste populationstæthed lige under frøet og mod rodspidsen (Ahmad & Baker, 1987). Knudsen (1994) undersøgte i klimakammer G. roseum isolatet IK726´s evne til at kolonisere bygrødder i sand og viste at, IK726 er i stand til at vokse fra frøet og kolonisere den nederste del af rodnettet. Forsøgene viste dog en koloniseringsgrad (cfu per g rod) der var ca 25x højere på den øvre del af rodnettet (0.5 cm under frøet) end på den nedre del af rodnettet (0.5 cm fra rodspidsen). På KVL arbejdes der i øjeblikket med at transformere IK726 med gfp genet, der gør at svampen bliver fluorescerende. Derved muliggøres en mere præcis monitering af isolatets aktivitet, kolonisering og overlevelse i rodzonen i laboratorieforsøg. Ved pladespredning af rhizosfærejord på selektivt substrat, er det ikke muligt at skelne IK726 fra naturligt forekommende isolater af G. roseum. På KVL er en PCR-metode til specifik genkendelse af IK726 under udvikling. Repræsentanter for G. roseum isolater fundet ved rodvask af byg -og hvederødder og opbevaret på PDA i 10% glycerol ved -80·C er undersøgt ved hjælp to konstruerede primere, der med stor sandsynlighed specifikt kan identificere isolatet IK726. De foreløbige resultater tyder på, at IK726 har overlevet i rodzonen på byg, idet alle undersøgte isolater fra behandlede planter blev bestemt til at være IK726, mens et isolat fra kontrolparcellen ikke kunne identificeres som værende IK726. Generelt synes antagonistiske svampeisolaters rhizosfære kompetance at være stærkt afhængig af plantearten, ligesom der kan være udtalte sortsforskelle (Sivan & Harman, 1991; Kortemaa et al.,1994). Der er ikke i litteraturen fundet yderligere undersøgelser, der understøtter at G. roseum er rhizosfære kompetent på korn eller andre kulturplanter. Ældre undersøgelser viser dog, at G. roseum under markforhold er en naturlig kolonisator af rodzonen af vigtige kulturplanter som ært, bønne og soyabønne (Buxton, 1957; Stenton, 1958; Dix, 1964; Mueller & Sinclair, 1986) samt planter tilhørende salturtfamilien (Pugh & Dickinson, 1965). Det er således sandsynligt, at IK726 er rhizosfære kompetent på andre kulturplanter end byg og hvede. 11 Afledte aktiviteter11.1 PublikationerJensen, B., Knudsen, I.M.B., Jensen, D. Funck & Hockenhull, J. (1995). Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til korn baseret på antagonistiske svampe. 12. Danske Planteværnskonference, sygdomme og skadedyr: 47- 56. Jensen, B., Knudsen, I.M.B., Jensen, D. Funck & Hockenhull, J. (1995). Development of a formulation of Gliocladium roseum for biological seed treatment to control foot rot in cereals caused by Fusarium culmorum. Fifth International Trichoderma/Gliocladium Workshop, Beltsville, USA, 18- 20/4 1995. (Abstract) Jensen, B., Knudsen, I.M.B., Jensen, D. Funck & Hockenhull, J. (1995). Development of a formulation of Gliocladium roseum for biological seed treatment to control foot rot in cereals caused by Fusarium culmorum. Poster at ISTA Pre-Congress Seminar on Seed Pathology. Copenhagen, Denmark, 6/6 1995. (Abstract) Knudsen, I.M.B., Jensen, B., Jensen, D. Funck & Hockenhull, J. (1996). Colonization of Gliocladium roseum on barley roots from sand and field soil. In: "Monitoring antagonistic fungi deliberately released into the environment". (D. Funck Jensen, H-B. Jansson & A Tronsmo eds.). Kluwer Academic Publishers. 33-37. Jensen, B., Knudsen, I.M.B., Jensen, D. Funck & Hockenhull, J. (1996). Development of a formulation of Gliocladium roseum for biological seed treatment. In Biological and Integrated Control of Root Diseases in Soilless Cultures (C. Alabouvette ed.). IOBC/wprs Bulletin 19(6) 164-169. Jensen, B., Knudsen, I.M.B, Jensen, D.F. & Hockenhull, J. (1996). Application of antagonistic microorganisms to seeds to control fungal plant pathogens. Combined Proceedings of IPPS 1996, 256-262. 11.2 Møder og rejseaktivitetBirgit Jensen deltog 8. marts 1995 i den 12. Danske Planteværnsconference med indlæget "Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til korn baseret på antagonistiske svampe" Birgit Jensen deltog i april 1995 5th International Trichoderma /Gliocladium Workshop i Beltsville, USA med indlæget "Development of a formulation of Gliocladium roseum for biological seed treatment to control foot rot in cereals caused by Fusarium culmorum". Birgit Jensen og Dan Funck Jensen besøgte i 1995 to grupper i USA der arbejder med biologisk bekæmpelse: Washington State University (Linda Thomashow, David Weller m.fl) og Geneva, New York (Gary E. Harman m.fl) Birgit Jensen og Inge Knudsen deltog 6.juni 1995 i ISTA Pre-Congress Seminar on Seed Pathology, med poster "Development of a formulation of Gliocladium roseum for biological seed treatment to control foot rot in cereals caused by Fusarium culmorum" Birgit Jensen deltog november 1995 i Frøsymposiet "Priming and Vigour Tests in seeds" Tune, Danmark. Birgit Jensen deltog 12-13 september 1996 i IPPS 5. Danmarks Konference 1996, Beder, DK. Med indlæget " Anvendelse af antagonistiske mikro svampe på frø mod svampesygdomme". Birgit Jensen og Dan Funck Jensen deltog 17. April 1997 i Seed Biology Symposium, Tune, DK med indlæget "Biological control of seed borne diseases by seed treatments with fungal antagonists" 11.3 Opgaver udført i tilknytning til projektetHenriette Hossy 1996. Bekæmpelse af spiringsfusarioser i byg ved kombina- tion af antagonister. Institut for Plantebiologi, Sektion for Plantepatologi, KVL, M.Sc. opgave, 101 sider. Christian Thirup, 1996. Et biologisk bejdsemiddel til byg baseret på Gliocladium roseum. Institut for Plantebiologi, Sektion for Plantepatologi,KVL, B. Sc. opgave, 52 sider Vibeke Ærø Hansen 1997. Biologisk frøbejdsning med Gliocladium roseum Institut for Plantebiologi, Sektion for Plantepatologi, KVL, B. Sc. opgave, 62 sider 12 LitteraturlisteAhmad, J.S. & Baker, R. (1987). Rhizosphere competence of Trichoderma harzianum. Phytopathology 77, 182-189. Baker, R.(1991). Induction of rhizosphere competence in the biocontrol fungus Trichoderma. In: The Rhizosphere and Plant Growth. Eds. D.L. Keister & P.B. Cregan. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 212-221. Barnett, H.L. & Lilly, V.G.(1962). A destructive mycoparasite, Gliocladium roseum. Mycologia 54, 72-77. Boyette, C.D., Quimby, Jr., P.C., Connick, Jr., W.J., Daigle, D.J. & Fulgham, F.E. (1991). Progress in the production, formulation, and application of mycoherbicides. In: Microbial Control of Weeds. Ed. D.O. TeBrest. Chapman and Hall, New York. Side 209-222. Burgess, D.R. & Hepworth, G. (1996). Biocontrol of sclerotinia stem rot (Sclerotinia minor) in sunflower by seed treatment with Gliocladium virens. Plant Pathology 45, 583-592. Burgess, D.R., Bretag, T. & Keane, P.J. (1997). Biocontrol of seedborne Botrytis cinerea in chickpea with Gliocladium roseum. Plant Pathology 46, 298-305. Burgess, D.R. & Keane, P.J. (1997). Biological control of Botrytis cinerea on chickpea seed with Trichoderma spp. and Gliocladium roseum: indigenous versus non-indigenous isolates. Plant Pathology 46, 910-918. Buxton, E.W.(1957). Differential rhizosphere effects of three pea cultivars on physiological races of Fusarium oxysporum f. pisi. Trans. Br. mycol. Soc., 40, 305-317. Castejón-Muñoz & Oyazun, P.J. (1995). Soil receptivity to Fusarium solani f.sp. pisi and biological control of root rot of pea. European Journal of Plant Pathology, 101, 35-49. Cliquet, S. & Scheffer, R.J. (1996). Biological control of damping-off caused by Pythium ultimum and Rhizoctonia solani using Trichoderma spp. applied as industrial film coatings on seeds. European Journal of Plant Pathology 102, 247-255. Cliquet, S. & Scheffer, R.J. (1997). Influence of culture conditions on growth and survival of conidia of Trichoderma spp. coated on seeds.Biological Science and Technology 7, 171-181. Connick,W.J.,Jr, Daigle, D.J., Boyette, C.D., Williams, K.S., Vinyard, B.T., Quimby, P.C., Jr. (1996). Water activity and other factors that affect viability of Colletotrichum truncatum conidia in wheat flour-kaolin granules (´Pesta´). Biocontrol Science and Technology 6, 277-284. Dandurand, L.M. & Knudsen, G.R. (1993). Influence of Pseudomonas fluorescens on hyphal growth and biocontrol activity of Trichoderma harzianum in the spermosphere and rhizosphere of pea. Phytopathology, 83, 265-270. Dix, N.J. (1964). Colonization and decay of bean roots. Trans. Br. mycol. Soc. 47, 285-292. Domsch, K.H., Gams, W. & Anderson, T.H. (1980). Compendium of soil fungi. Vol 1-2. Academic Press, London. Duczek, L.J. (1994). Relationship between a greenhouse and field assay for control of common root of spring wheat and barley. Canadian Plant Disease survey 74, 135-140. Elad, Y., Chet, I & Henis, Y. (1981). A selective medium for improving quantitative isolation of Trichoderma spp. from soil. Phytoparasitica 9, 59-67. Fravel, D.R., Marois, J.J., Lumsden, R.D. & Connick, Jr. W.J. (1985). Encapsulation of potential biocontrol agents in an alginate-clay matrix. Phytopathology, 75, 774-777. Green, H. (1996). Ecology of Trichoderma spp. in relation to biocontrol of plant diseases caused by Pythium ultimum. Ph.D. thesis. Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole. Hansen, V.Æ. (1997). Biologisk frøbejdsning med Gliocladium roseum. Institut for Plantebiologi, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole. Bacheloropgave i plantepatolgi 55 sider. Harman, G.E. (1991). Seed treatments for biological control of plant disease. Crop protection, 10, 166-171. Harman, G.E. (1992). Development and benefits of rhizosphere competent fungi for biological control of plant pathogens. Journal of Plant Nutrition 15, 835-843. Harman, G.E., Chet, I. & Baker, R. (1981). Factors affecting Trichoderma hamatum applied to seeds as a biocontrol agent. Phytopathology 71, 569-572. Harman, G.E. & Nelson, E.B. (1994). Mechanisms of protection of seeds and seedlings by biological seed treatments: implications for practical disease control. In: Seed Treatment, Progress and Prospects. Ed. R. Maude. British Crop Protection Council. p.383-392. Harman, G.E. & Taylor, A.G. (1988). Improved seedling performance by integration of biological control agents at favorable pH levels with solid matrix priming. Phytopathology 78, 520-525. Harman, G.E., Taylor, A.G. & Stasz, T.E. (1989). Combining effective strains of Trichoderma harzianum and solid matrix priming to improve biological seed treatments. Plant Disease 73, 631-637. Harman, G.E., Jin, X., Stasz, T.E., Peruzzotti, G., Leopold, A.C. & Taylor, A.G. (1991). Production of conidial biomass of Trichoderma harzianum for biological control. Biological control, 1, 23-28. James, T.D.W & Sutton, J.C. (1996). Biological control of botrytis leaf blight of onion by Gliocladium roseum applied as sprays and with fabric applicators. European Journal of Plant Pathology 102, 265-275. Jensen, B (1998). Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler og toksiske metabolitter. Miljø- og Energiministeriet Miljøstyrelsen. Miljøprojekt nr. 436. (In Press) Jin, X., Harman, G.E. & Taylor, A.G. (1991). Conidial biomass and disiccation tolerance of Trichoderma harzianum produced at different medium water potentials. Biological control 1, 237-243. Jin, X., Taylor, A.G. & Harman, G.E. (1996). Development of media and automated liquid fermentation methods to produce desiccation-tolerant propagules of Trichoderma harzianum. Biological Control 7, 267-274. Keinath, A.P., Fravel, D.R. & Papavizas, G.C. (1991). Potential of Glio- cladium roseum for biocontrol of Verticillium dahliae. Phytopathology 81, 644-648. Knudsen, I.M.B. (1994). Biological control of seedborne diseases in cereals. Den Kgl. & Veterinær- og Landbohøjskole. Ph.D. Thesis, 131 sider. Knudsen, I.M.B., Hockenhull, J. & Jensen, D.F. (1995). Biocontrol of seedling diseases of barley and wheat caused by Fusarium culmorum and Bipolaris sorokiniana: effects of selected fungal antagonists on growth and yield components. Plant Pathology 44, 467-477. Knudsen, I.M.B., Hockenhull, J., Jensen D.F., Gerhardson, B., Hökeberg, M., Tahvonen, R., Teperi, E., Sundheim, L. & Henriksen, B. (1997). Selection of biological control agents for controlling soil and seed-borne diseases in the field. European Journal of Plant Pathology 103, 775-784. Kortemaa, H., Rita, H., Haahtela, K. & Smolander, A. (1994). Root-colonization ability of antagonistic Streptomyces griseoviridis. Plant and Soil 163, 77-83. Larsen, K.M. (1996). Screening af markjorder for hæmning af Pythium-rodbrand. Institut for Plantebiologi, Sektion for Plantepatolgi, KVL, DK. M.Sc. opgave, 78 sider Lewis, J.A. (1991). Formulation and delivery systems of biocontrol agents with emphasis on fungi. In The rhizosphere and plant growth. Eds. D.L. Keister & P.B. Cregan. pp 297-287. Kluwer Academic Publishers, Netherlands. Lifshitz, R., Windham, M.T. & Baker, R., 1986. Mechanism of biological control of preemergence damping-off of pea by seed treatment with Trichoderma spp. Phytopathology 76, 720-725. Lumsden, R.D. & Locke, J.C., 1989. Biological control of damping-off caused by Pythium ultimum and Rhizoctonia solani with Gliocladium virens in soilless mix. Phytopathology 79, 361-366. Lübeck, M. (1994). Toksiske metabolitter fra udvalgte mikroorganismer. Miljøministeriet, Miljøstyrelsen. Arbejdsrapport fra Miljøstyrelsen. Nr. 18, 108 sider. Lynch, J.M. & Ebben, M.H. (1986) The use of microorganisms to control plant disease, Journal of applied Bacteriology Symposium Supplement 1986, 115S-126S. Lynch, J.M. & Pryn, S.J. (1987). Interaction between a soil fungus and barley seed. Journal of general Microbiology, 103, 193-196. Malalasekera, R.A.P., Sanderson, F.R. & Colhoun, (1973). Fusarium diseases of cereals. IX. Penetration and invasion of wheat seedlings by Fusarium culmorum and F. nivale. Trans. Br. Myco,. Soc. 60, 453-462. Mathre, D.E. (1982). Compendium of Barley Diseases. The American Phytopathological Society, Montana US. McIntyre, J.L. & Press, L.S. (1991). Formulation, delivery systems and marketing of biocontrol agents and plant growth promoting rhizobacteria. In:The rhizosphere and plant growth. Eds. Keister, D.L. & P.B. Cregan, Klüwer Academic Publishers, Netherlands. 289-295. McQuilken, M.P., Whipps, J.M. & Cooke, R.C. (1990). Control of damping-off in cress and sugar-beet by commercial seed-coating with Pythium oligandrum. Plant Pathology 39, 452-462. Merriman, P. & Russell, K. (1990). Screening strategies for biological control. In: Biological Control of Soilborne Plant Pathogens (D. Hornby, ed). CAB International, Wallingford. 171-190. Miljøstyrelsen (1993). Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Miljøministeriet Miljøstyrelsen. Vejledning fra Miljøstyrelsen Nr. 8 1993. 50 sider. Moore, D., Bateman, R.P., Carey, M. & Prior, C. (1995). Long-term storage of Metathizium flavoviride conidia in oil formulations for control of locusts and grashoppers. Biocontrol Science and Technology 5, 193-199. Moore, D., Douro-Kpindou, O.K., Jenkins, N.E. & Lomer, C.J. (1996). Effects of moisture and temperature on storage of Metathizium flavoviride conidia. Biocontrol Science and Technology 5, 193-199. Mueller, J.D. & Sinclair, J.B. (1986). Occurrence and role of Gliocladium roseum in field-grown soybeans in Illinois. Trans. Br. mycol. Soc., 86, 677-680. Muñoz, G.A., Cotoras, M., San Martin, R. & Volpe, M.D. (1995). Comparison of aerial and submerged spore properties for Trichoderma harzianum. FEMS Microbiology Letters 125, 63-70. Neergaard, P. (1977). Response of pathogen to test conditions. In: Seed Pathology Volume I. The MacMillan Press Ltd., p. 759-763. Nelson, E.B., Harman, G.E. & Nash, G.T. (1988). Enhancement of Trichoderma-induced biological control of Pythium seed rot and pre-emergence damping-off of peas. Soil Biology and Biochemistry 20, 145-150. Nigam, P. & Singh, D. (1994). Solid-state (substrate) fermentation systems and their application in biotechnology. J. Basic Microbiol. 34, 405-423. Peng, G., & Sutton, J.C. (1991). Evaluation of microorganisms for biocontrol of Botrytis cinerea in strawberry. Can. J. Plant Pathol., 13, 247-257. Peng, G., Sutton, J.C. & Kevan, P.G. (1992). Effectiveness of honey bees for applying the biocontrol agent Gliocladium roseum to strawberry flowers to suppress Botrytis cinerea. Can. J. Plant Pathol., 14, 117-129. Powell, K.A. (1993). The commercial exploitation of microorganisms in agriculture. In: "Exploitation of Microorganisms". ( D.G. Jones ed.). Chapman & Hall, London. 441-459. Powell, K.A. & Jutsum, A.R. (1993). Technical and commercial aspects of biocontrol products. Pestic. Sci. 37, 315-321. Pugh, G.J.F. & Dickinson, C.H. (1965). Studies on fungi in coastal soils. VI. Gliocladium roseum Bainer. Trans. Br. mycol. Soc., 48, 279-285. Renwick, A, Campbell, R. & Coe, S. (1991). Assesment of in vivo screening systems for potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis. Plant Pathology 40, 524-532. Rhodes, D.J. & Powell, K.A. (1994). Biological seed treatment - The development proces. In: Seed Treatment: Progress and Prospects. BCPC Monograph No 57. Ed. T. Martin. Side 303-310. Shah-Smith, D.A. & Burns, R.G. (1996). Biological control of damping-off of sugar beet by Pseudomonas putida applied to seed pellets. Plant Pathology 45, 572-582. Sivan, A. & Harman, G.E. (1991). Improved rhizosphere competence in a protoplast fusion progeny of Trichoderma harzianum. J. Gen. Microbiol. 137, 23-29. Stanbury, P.F., Whitaker, A. & Hall, S.J. (1995). The isolation, preservation and improvement of industrially important micro-organisms. In: Principles of fermentation technology. Pergamon. 35-49. Stenton, H. (1958). Colonization of roots of Pisum sativum L. by fungi. Trans. Br. mycol. Soc., 41, 74-80. Stowell, L.J. (1991). Submerged fermentation of biological herbicides. In: Microbial Control of Weeds. Ed. D.O. TeBrest. Chapman and Hall, New York. Side 225-261. Sutton, J.C. & Peng, D.L. (1993). Biocontrol of Botrytis cinerea in strawberry leaves. Phytopathology 83, 615-621. Sutton, J.C., Peng, D.L., Yu, H., Zhang, P & Valdebenito-Sanhueza. (1997). Gliocladium roseum a versatile adversary of Botrytis cinerea in crops. Plant Disease 81, 316-328. Taylor, A.G. & Harman, G.E. (1990). Concepts and technology of selected seed treatments. Annu. Rev. Phytopathol. 28, 321-339. Taylor, A.G., Min, T.-G., Harman, G.E. & Jin, X. (1991). Liquid coating formulation for the application of biological seed treatment of Trichoderma harzianum. Biological control, 1, 16-22. Thirup, C. (1996). Et biologisk bejdsemiddel til vårbyg baseret på Gliocladium roseum. Institut for Plantebiologi, Den Kgl Veternær- og Landbohøjskole. Bachelorprojekt, 53 sider. Tyner, L.E. & McKinnon, B.A. (1964). Fungi of barley seeds and their associative effects. Phytopathology 54, 506-508. Vakiili, N.G. (1992) Biological seed treatment of corn with mycopathogenic fungi. J. Phytopathology, 134, 313-323. Walter, J.F. & Lumsden, R.D. (1997). Gliocladium and biological control of damping-off complex. In: Ecology Interactions and Biological Control. Eds. D.A. Andow, D.W. Ragsdale & F. Nyvall. WestviewPress 1997. side 254-267. Wu, W. (1982). Seed treatment by applying Trichoderma spp. to increase the emergence of soybeans.Seed Sci. & Technology 10, 557-563. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||