Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frø

5 Gliocladium roseum præparaters aktivitet i Fusarium culmorum bioassay

5 Gliocladium roseum præparaters aktivitet i Fusarium culmorum bioassay
5.1 Materialer og metoder
5.2 Resultater
5.2.1 Effekter af lagertid, lagertemperatur og formulering for sphagnum/klid præparater
5.2.2 Effekter af lagertid, lagertemperatur og formulering for molerspræparater
5.2.3 Effekt af klæbemidler
5.2.4 Naturligt inficerede frø
5.2.5 Betydning af vækstemperatur for sygdomsudvikling og bekæmpelse
5.2.6 Dosis-respons for sygdomsindeks
5.2.7 Dosis-respons for planteetablering
5.3 Opsummering og diskussion

Patogenet Fusarium culmorum (W.G.SM.) Sacc. forårsager forskellige frøbårne og jordbårne sygdomme på kimplanter af byg og hvede herunder spiringsskader og fod- og rodråd (Mathre, 1982). Infektion som følge af udsædsbårent inokulum kan medføre at frøet ikke spirer eller at fremspirede planter dør eller hæmmes (Mathre, 1982). Patogenet er udbredt over det meste af verden og forekommer i alle områder hvor der dyrkes korn. Inokulum af F. culmorum i form af mycelium er lokaliseret i frøkappe og inderavner, hvilket gør patogenet sårbart overfor frøbejdsning med såvel kemiske som biologiske midler.

Plante bioassay

For biologiske præparater, der skal anvendes til bejdsning af korn, er der naturligvis ingen tvivl om, at en endelig evaluering af præparaternes effektivitet og stabilitet skal foretages under markforhold. Da markforsøg er både arbejdskrævende og forholdsvis dyre at udføre, og da der i Danmark kun kan anlægges forsøg med korn to gange årligt, er der behov for hurtige og billige laboratoriemetoder til udvikling, evaluering, optimering og justering af formuleringer af antagonisten. I den forbindelse er helplante assay (plante bioassay) at foretrække, idet man herved får mulighed for at undersøge vekselvirkning mellem plante, antagonist og patogen under kontrollerede miljøforhold, og derved også har mulighed for at studere betydningen af biotiske og abiotiske faktorer i systemet. Vækstfaktorer kan holdes konstante, således at en basal viden kan opnåes om antagonistens bekæmpelsespotentiale under påvirkningen af enkeltfaktorer som temperatur, vandindhold i vækstmediet, pH osv. Betydningen af faktorer som eksempelvis applikationsmetode, formulering og dosering af antagonisten med hensyn til bekæmpelse og plantevækst kan også undersøges. Værdien af bioassay er naturligvis helt afhængig af, hvor god overensstemmelse der er mellem resultater opnået i det kontrollerede væksthus, og resultater opnået under naturlige forhold i marken.

Udvælgelse af IK726

G. roseum isolat IK726 er udvalgt på baggrund af screening af 340 isolater fra økologisk og konventionelt dyrket agerjord for antagonisme overfor F. culmorum og Bipolaris sorokiniana (Knudsen, 1994). Første screening udførtes i små potter med sand, hvor frø blev inokuleret med sporesuspensioner dels af patogenet og dels af den potentielle antagonist og derefter inkuberet ved 15°C i 19 dage. Isolater der udviste >50% bekæmpelse blev yderligere testet på frø naturligt inficeret med F. culmorum eller B. sorokiniana, først i sand og siden efterfulgt af screening i markjord. Efter denne hierarkisk procedure var adskillige lovende isolater tilbage, hvoraf 3 blev afprøvet i markforsøg. To isolater gav under markforhold god bekæmpelse af F. culmorum og B. sorokiniana, hvoraf det bedste isolat, G. roseum (IK726), var på højde med kemisk bejdsning. Dette isolat blev derfor udvalgt til videre undersøgelser (Knudsen et al., 1995). Den ovenstående succesfulde screeningsproces viser, at bioassay bygget op omkring kunstig frøsmitte efterfulgt af bejdsning med antagonisten giver et rimeligt udtryk for, hvad der kan forventes i marken, ihvertfald for isolater af G. roseum. Undersøgelser under dette projekt har siden samstemmende vist, at der er en overordentlig høj korrelation mellem resultater fra markforsøg og resultater fra plante- bioassay med hensyn til bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning med IK726 (se kap. 9, fig 9.1).

Formål

Formålet med nærværende forsøg er at undersøge bekæmpelsen af F. culmorum ved bejdsebehandlinger med G. roseum (IK726) i plante-bioassay herunder specielt at undersøge (1) bekæmpelse af F. culmorum i relation til produktion, formulering og lagring af IK726 præparater, (2) bekæmpelse af F. culmorum i relation til kombination af IK726 med klæbemidler, (3) sideeffekter på planteetablering ved bejdsning med IK726 og (4) at fastlægge dosis-respons kurver for bejdsning med IK726.

5.1. Materialer og metoder

Patogen og smitteprocedure

I de udførte bioassay er der primært benyttet frø af byg, der er inokuleret med sporer af F. culmorum, isolat No. 5. Effekten af IK726 overfor naturlig frøsmitte er undersøgt ved hjælp af et parti naturligt inficeret frø af bygsorten "Bamse". Infektion af "Bamse"med F. culmorum blev efter inkubation af kerner på fugtigt filtrerpapir under nær-UV lys (blottertest) opgjort til 30%, og det gennemsnitlige sygdomsindeks ved udsåning af frø i sandtest er opgjort til 1.2. Skalaen for opgørelse af sygdomsindekset er beskrevet nedenfor.

F. culmorum inokulum

Inokulum af F. culmorum til frøsmitte blev opformeret på PDA. Til hvert bioassay er der benyttet en stamkultur af No. 5, der opbevares på PDA i 10% glycerol ved -80°C. Stamisolatet inkuberes 1 uge på PDA og overpodes til PDA for yderligere 1 uges inkubation. Sporer høstes ved at tilføre plader 20 ml H₂O, forsigtigt at skrabe mycelium inklusive sporer af agaren og derefter filtrere gennem 2 lag gaze. I det vandige filtrat indstilles sporekoncentrationen til 1.5 x 10⁶ sporer/ml vand ved hjælp af tællekammer.

Overfladesterilisering

Inden frø af sorterne "Alis Abed" eller "Paloma" inokuleres med F. culmorum bliver de overfladesteriliset ved dypning i i 70% ethanol, 10 min. i NaOCl (2,5%) efterfulgt af 3 x 1 minuts skylning i sterilt vand (Knudsen, 1994). Frøene tørrer 12-18 timer ved stuetemperatur i sterilbænk før smitning med patogenet. Frø smittes ved omrystning (30 min, 150 rpm) i F. culmorum sporesuspensionen i forholdet 1:2 (w/v) og herefter tørrer frøene 24 t i sterilbænk. Smittede frø opbevares ved 4°C.

Biologisk bejdsning

Bejdsning af såvel smittede som usmittede frø foretages ved omrystning af frø i en sporesuspension af antagonisten (1:2 w/v). Kontrolbehandlinger er på tilsvarende vis behandlet med vand. Suspensioner af friskhøstede konidier af IK726 fremstilles ud fra opformering i rystekultur på PDB+PEG₂₀₀ og konidierne separeres fra fermentorbiomassen som beskrevet i afsnit 2.1. Til fremstilling af suspensioner ud fra tørrede præparater anvendes to metoder. Præparatet afvejes i et rørglas tilsættes 10 ml H₂O og rystes 1 minut på whirlmixer og (1) anvendes direkte efter indstilling til ønskede g præparat/ml (w/v) eller (2) filtreres gennem polyestervæv (38µm), der tilbageholder grove bærematerialer som sphagnum og klid, hvorefter sporekoncentrationen kan indstilles ved fortynding.

Klæbemidler

Tre klæbemidlers indflydelse på bekæmpelsen af F. culmorum er undersøgt. Teprosyn F2157 (Phosyn plc, York, UK), Pelgel® (The Nitragin Co., Milwaukee, WI, USA) og Sepiret® (SEPIRET Seed Film-coating, Seppic, Paris, Frankrig) er tilsat bejdsesuspensioner i koncentrationer fra 1% til 15% (w/v).

Opsætning af bioassay

Opsætning og udførelse af bioassay er modificeret efter Knudsen et al. (1995). Potter (4.5 x 4.5 cm) fyldes med sand opvædet med vand (3:1 v/v). Der udsåes 3 frø per potte. Hver gentagelse består af 6 sådanne potter med fælles underskål, og hver behandling har 4 gentagelser, der er randomiseret i 4 blokke (kasser). Hver kasse monteres med et trådnet- stativ og overtrækkes med en plastpose, hvilket sikrer høj luftfugtighed og god plads til planternes vækst. Standardbetingelserne for inkubering er 19 døgn ved 15°C og en lyscyklus på 12 t lys efterfulgt af 12 t mørke. Efter 13 døgns inkubation vandes hver gentagelse med 50 ml Hornum-gødningsblanding (5 ml/l). Ved undersøgelser af temperaturens indflydelse på antagonistens bekæmpelseseffekt blev planter endvidere dyrket ved: 10°C med en lyscyklus på 12 t lys og 12 t mørke over en periode på 24 døgn og i 14 døgn med følgende temperatur -og lyscyklus; 16 t lys ved 20°C efterfulgt af 8 t i mørke ved 15°C.

Opgørelse af bioassay

Planterne frigøres forsigtigt for sand, vaskes og klassificeres efter symptomer på koleoptile, rødder og frø. Bedømmelsesskalaen for angreb af F. culmorum går fra 0-4, hvor 0=raske planter med hvide rødder, 1= Svag brunfarvning i pletter på rødder eller koleoptile, 2= Kraftig brunfarvning rundt om stængel/koleoptile eller af rodsystemet, 3 = Meget kraftig brunfarvning af stængel/koleoptile og rødder (evt. svækket plante), og 4 = Frøet uspiret og rødfarvet eller planten død/døende efter fremspiring. For hver gentagelse (6 x 3 planter) udregnes et gennemsnit af karaktererne, der betegnes sygdomsindeks (SI). Uspirede frø uden symptomer medtages ikke i beregningen af SI. Fremspiring beregnes som procent spirede planter af alle såede frø. Tørvægt af ovenjordiske plantedele bestemmes i udvalgte plante-bioassay efter 2 døgns tørring ved 60°C og angives i mg/plante.

Dosering af IK726

Antallet af levedygtige IK726 konidier pr. frø ved udsåning bestemmes efter afvaskning og pladespredning. Frø smittet med F. culmorum og bejdset med IK726 kan ikke anvendes til bestemmelsen, idet konidier fra begge svampe derved afvaskes og spirer på PDA, hvilket gør bestemmelse af cfu/frø usikker. I stedet anvendes overfladesteriliserede frø, der er bejdset med IK726 svarende til de behandlinger med Fusarium smittede frø, der indgår i de specifikke bioassay. Der udtages 20 bejdsede frø, der mixes med 20 glaskugler og 3 ml sterilt H₂O og rystes på whirlmixer i 1 minut. På PDA pladespredes 3 x 100µl for hver af 3 relevante fortyndinger, der er estimeret ud fra sporetællinger i tællekammer. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur og aflæses efter 2,3 og 4 døgn. Herudfra estimeres antal cfu/frø.

Statistik

'Variansanalyser er udført i SAS ved hjælp af procedurerne Proc Glm og Proc Corr. For balancerede blokforsøg med to eller tre klassevariable er forsøgene desuden analyseret for eventuelle vekselvirkninger. Behandlingsgennemsnit sammenlignes ved hjælp af Duncan's multiple range test eller LSD_0.95-værdier.

I nedenstående tekst og tabeller refereres der ofte til præparatnumre som eksempelvis L3 og P4. For standardformuleringer er yderliger detaljer vedrørende specifikke præparaters produktion og formulering beskrevet I kapitel 2 (tabel 2.1 & tabel 2.9).

Optimeret formulering

Derudover er effekter af optimeret formulering undersøgt for enkelte præparater (Tabel 5.7-5.9 og 5.13). Metoder til optimering af formuleringer er ikke beskrevet i rapporten, men blot angivet som optimeret formulering Type A, B, C.

5.2 Resultater

5.2.1. Effekt af lagertid, lagertemperatur og formulering for sphagnum/klid præparater

I tabellerne 5.1 - 5.10 ses resultater fra en række række bioassay, der er udført med henblik på at undersøge hvordan lagertid og lagertemperatur samt formulering påvirker bekæmpelseseffektiviteten af G. roseum sphagnum/klid præparater. Der er bejdset med konidier, der er vasket ud af sphagnum/klid præparater undtagen for forsøget, der er refereret i tabel 5.3. I tabel 5-7-5.9 testes optimerede formuleringer, mens øvrige tabeller i afsnit 5.2.1 viser resultater fra tests af standardformuleringer.

Langtidslagring ved 4°C

I tabel 5.1 og 5.2 er bekæmpelseseffekten undersøgt ved bejdsning med konidier fra sphagnum/klid præparater lagret ved 4°C. De to præparater af IK726 (L4 og L5) er produceret ved fast fermentering efter samme procedure. Uanset præparatoprindelse har bekæmpelseseffekten været stabil og større end 80% efter lagringsperioder på henholdsvis 3 og 5 måneder (tabel 5.1) og 9 og 11 måneder (Tabel 5.2). Bejdsning med høj dosis af lagrede konidier har desuden givet en lige så effektiv bekæmpelse som tilsvarende bejdsning med friskhøstede konidier.

Lagring ved 15° og 20°C

Bekæmpelseseffekten af sphagnum/klid præparater med stigende lagringstid er også undersøgt for lagertemperaturer på 15° og 20°C og bekæmpelseseffektiviteten er sammenlignet med præparater lagret ved 4°C samt med effekten af friskhøstede konidier.

Ved lagring af præparatet L3 i 4 uger ved 15°C var bekæmpelses-effekten ikke signifikant forskellig fra effekten af samme præparat lagret ved 4°C eller fra bejdsning med friske konidier af IK726 (Tabel 5.3).

Tabel 5.1. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med konidier fra sphagnum/klid præparater af G. roseum (IK726). Præparaterne L4 og L5 er lagret henholdsvis 5 og 3 måneder ved 4°C.

Table 5.1. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation of G. roseum (IK726). Preparations of L4 and L5 were stored, respectively, for 5 and 3 months at 4°C.

1) Bejdsningssuspensionen er indstillet til 1 x 10⁶ sporer af IK726/ml
2) Gennemsnitsværdier for SI og spiring efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Tabel 5.2. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med konidier fra sphagnum/klid præparater af G. roseum (IK726). Præparaterne L4 og L5 er lagret henholdsvis 11 og 9 måneder.

Table 5.2. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation of G. roseum (IK726). Preparations of L4 and L5 were stored, respectively, for 5 and 3 months at 4°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁷ konidier/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Tabel 5.3. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparatet (L3) af G. roseum (IK726) lagret 4 uger ved 4°og 15°C.

Table 5.3. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L3) of G. roseum (IK726) stored 4 weeks at 4° and 15°C.

1) Bejdsningssuspensionen er indstillet til 1 x 10⁷ konidier af IK726/ml
2) SI- værdier og spiringsprocent efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Sphagnum/klid præparatet L4 er testet efter henholdsvis 2 ugers lagring (Tabel 5.4) og 8 ugers lagring (Tabel 5.5) ved 4°C og 20°C. Bekæmpelseseffektiviteten af konidier lagret ved 20°C ved anvendelse af 1 x 10⁷ sporer/ml i bejdsesuspensionen har været fuldt på højde med effekten af både friske konidier og konidier lagret ved 4°C i samme koncentration. Derimod har bekæmpelseseffekten ved lav koncentration (1 x 10⁶) været signifikant lavere, men det skal samtidigt bemærkes, at der blev estimeret et lavere antal cfu/frø.

Tabel 5. 4. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med konidier fra G. roseum sphagnum/klid præparatet (L4) lagret 2 uger ved 4° og 20°C .

Table 5.4. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L4) of G. roseum (IK726) stored for 2 weeks at 4° and 20°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁶ konidier/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Tabel 5.5. Bekæmpelse af F. culmorum i bioassay ved bejdsning af byg med to sphagnum/klid præparatet (L4) af G. roseum (IK726) lagret 8 uger ved 4° og 20°C.

Table 5.5. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L4) of G. roseum (IK726) stored for 8 weeks at 4° and 20°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁶ konider/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

I tabel 5.6 ses resultater fra bioassay med konidier fra sphagnum/klid præparatet L12, der er fremstillet på samme måde som L4 og lagret ved 4° og 20°C. Efter 10 ugers lagring er bekæmpelseseffekten ved høj dosering signifikant dårligere for konidier lagret ved 20°C end for konidier fra samme batch lagret ved 4°C.

Tabel 5.6. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning med sphagnum/klid formulering (L12) af G. roseum lagret 10 uger ved 4° og 20° C.

Table 5.6. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L4) of G. roseum (IK726) stored for 10 weeks at 4° and 20°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁷ sporer/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

I tabel 5.7 ses det endvidere, at konidier fra standardformuleringer af sphagnum/klid lagret 29 uger ved 20°C yderligere har mistet bekæmpelsespotentiale i forhold til friske og 4°C lagrede konidier. Der er dog stadigvæk ved høj koncentration (1 x 10⁷) en signifikant bekæmpelseeffekt (44% kontrol) i forhold til sygdomskontrollen.

For de ovennævnte forsøg gælder det generelt set, at reduktion i F. culmorum bekæmpelse har været fulgt i af en reduktion i det estimerede antal cfu pr. frø. Det bemærkes endvidere, at plantefremspiringen i de udførte bioassay generelt ikke er påvirket signifikant af bejdsning med forskellige konidietyper (friske, tørrede, lagrede etc.) eller præparater.

Optimeret formulering

For at forbedre bekæmpelseseffektiviteten af præparater, der er langtidslagret ved 20°C, er der arbejdet med forskellige former for optimeret formulering. I det følgende er disse formuleringer ikke yderligere beskrevet, men benævnes type A, B og Caf hensyn til eventuel patentering.

Af tabel 5.7 fremgår det, at en optimeret formuleringen (type A ) af sphagnum/klid præparatet L8 har influeret signifikant på bekæmpelsesaktiviteten. Konidier fra optimeret formulering lagret 29 uger ved 20°C har i modsætning til konidier, der er formuleret uden optimering, bekæmpet F. culmorum lige så effektivt som konidier lagret ved 4°C. Desuden viser estimaterne for antallet af cfu pr. frø, at samme dosering af lagrede konidier og friske konidier på frø giver samme grad af bekæmpelse.

Tabel 5.7. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparater af G. roseum (IK726) formuleret med eller uden optimering (type A) og lagret 29 uger ved 4°C og 20°C.

Table 5.7. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran formulation (L8) of G. roseum (IK726) formulated with or without optimization (type A) and stored for 29 weeks at 4° and 20°C.

1) Bejdsningssuspensionen er indstillet til 1 x 10⁷ konidier af IK726/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

I tabel 5.8 ses resultater fra bioassay, hvor konidier med optimeret formulering (type B) er testet. Efter 14 ugers lagring ved 20°C er bekæmpelsesgraden stabiliseret på samme niveau som for friske konidier og konidier lagret ved 4°C (tabel 5.8). Konidier fra ikke optimeret sphagnum/klid præparat lagret ved 20°C udviser derimod signifikant reduceret evne til at bekæmpe F. culmorum

Tabel 5.8. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparater (P4) af G. roseum (IK726), der er formuleret med eller uden optimering (type B) og lagret 14 uger ved 4°C og 20°C.

Table 5.8. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran preparation (P4) of G. roseum (IK726) formulated with or without optimization (type B) and stored for 14 weeks at 4°C and 20°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁷ sporer/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Af tabel 5.9 fremgår det, at optimeret formulering (type B) ikke har kunnet opretholde en uændret bekæmpelseseffektivitet efter 30 ugers lagring ved 20°C. Den procentvise bekæmpelse af F. culmorum er på kun 51% på trods at et forholdsvis højt antal estimerede cfu per frø ved såning.

Produktionstid

Produktionstidens indflydelse på bekæmpelsesaktiviteten af konidier fra sphagnum/klid præparater er undersøgt efter 8 ugers lagring ved 20°C. Som det fremgår af tabel 5.10, er der ingen signifikant indflydelse på bekæmpelsen uanset om produktionstiden er 14 eller 20 dage. Bekæmpelsen har dog været markant dårligere end for friske sporer, men hertil skal bemærkes, at den estimerede koncentration af cfu/frø er betydeligt lavere for de lagrede konidier nemlig 3-4 x 10³ cfu per frø mod 1.4 x 10⁴ cfu per frø for friske konidier.

Tabel 5.9. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparater (P4) af G. roseum (IK726), der er formuleret med eller uden optimering (type B) og lagret 30 uger ved 4°C og 20°C.

Table 5.9. Biological control of F.culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from a peat/bran preparation (P4) of G. roseum (IK726) formulated with or without optimization (type B) and stored for 30 weeks at 4° and 20°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁷ sporer/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.
3) Konidier fra sphagnum/klidpræparatet P4 fremstillet ved fast fermentering i 14 døgn.

Tabel 5.10. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med sphagnum/klid præparater (P4) af G. roseum (IK726) med en produktionstid på 14 eller 20 dage. Præparaterne er lagret 8 uger ved 20°C.

Table 5.10. Biological control of F. culmorum in bioassay by coating seeds of barley with conidia from peat/bran formulations (P4) of G. roseum (IK726) with production time 14 days or 20 days and storage for 8 weeks at 20°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁷ sporer/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.
3) Konidier fra sphagnum/klidpræparatet P4 fremstillet ved fast fermentering i 14 eller 20 døgn.

5.2.2 Effekt af lagertid, lagertemperatur og formulering for molerspræparater

I tabellerne 5.11- 5.15 ses resultater fra bioassay, der er udført med henblik på at undersøge hvordan lagertid, lagertemperatur og formulering påvirker bekæmpelseseffektiviteten af IK726 formuleret i moler. I modsætning til forsøgene med sphagnum/klid præparater, er konidierne ikke vasket ud af molerspræparaterne. Frøene er således i de nedennævnte assays bejdset med suspensioner af molerspræparat. I tabel 5.13 testes optimerede formuleringer, mens øvrige tabeller i afsnit 5.5.2 viser resultater fra test af standardformuleringer.

Lagring ved 4° og 20° C

I tabel 5.11 ses resultater for bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning med molerspræparatet (L13) lagret ved henholdsvis 4°C og 20°C. For molerspræparater i høj dosering, svarende til 9 x 10³ cfu/frø, har bekæmpelsen været lige så effektiv som for friskhøstede konidier med 1 x 10⁴ cfu/frø. Der er endvidere ingen signifikant forskel på bekæmpelses-effektiviteten uanset om molerspræparatet er lagret ved 4°C eller ved 20°C.

Tabel 5.11. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med en molersformulering (L13) af G. roseum lagret 6 uger ved 4° og 20°C.

Table 5.11. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with a clay formulation (L13) of G. roseum stored 6 weeks at 4°and 20°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁷ sporer/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

I table 5.12 ses bekæmpelseseffekten af bejdsning med samme molerspræparater (L13) efter 20 ugers lagring. For præparat lagret ved 4°C er bekæmpelsen stabilt større end 90% ved alle doseringer. Derimod er bekæmpelseseffektiviteten af præparat lagret ved 20°C reduceret signifikant. Der er således kun opnået > 90% bekæmpelse for den højeste dosering af præparatet lagret ved 20°C.

Tabel 5.12. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med en molersformulering af G. roseum (IK726) lagret 20 uger ved 4° og 20° C.

Table 5.12. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with a clay formulation (L13) of G. roseum stored 20 weeks at 4°and 20°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁷ sporer/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Optimering

Bekæmpelseseffektiviteten af molerspræparater efter langtidslagring ved 20°C er som for sphagnum/klid præparater søgt forbedret gennem optimeret formulering. To typer af optimeret formulering (type A og type C) evalueret efter 42 ugers lagring ved 20°C. Optimering ved type A har resulteret i en signifikant højere bekæmpelsesprocent end optimeret formulering type C (Tabel 5.13). Den bedste bejdsebehandling har resulteret i en bekæmpelse af F. culmorum på 77%. Det skal dog bemærkes, at sygdomsindeks i den F. culmorum smittede kontrol er meget højt (SI=3.46) samt at den usmittede kontrol har et forholdsvis højt niveau af naturlig infektion (SI=0.75).

Molerstype

Effekten af molerstype ved formuleringen af IK726 er undersøgt for ovntørret moler (Gm-2, pH=4.5 ) og kalcineret moler (Km-w, pH=5.5) (Tabel 5.14). De to testede molerspræparater indeholder begge 2 x 10⁹ cfu per g. Der er ikke nogen signifikant forskel i de to formuleringer bekæmpelseseffektivitetet, når tilsvarende fortyndinger sammenlignes. Høj dosering af molerspræparat har endvidere givet samme procent bekæmpelse som standardbehandlingen med friskhøstede konidier. Det skal også bemærkes, at i dette forsøg har bejdsning med friske konidier kun resulteret i 74% bekæmpelse.

Tabel 5.13. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med

molerspræparatet (L15) af G. roseum (IK726) med optimeret formulerering type A eller type C, lagret 42 uger ved 20°C.

Table 5.13. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with a clay preparation (L15) of G. roseum (IK726) with optimized formulation type A or type C and stored for 42 weeks at 20°C.

1) Formulering med molersproduktet Gm-2 af sporer af IK726 fra fast fermentering på sphagnum/klid substrat.
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Tabel 5.14. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med to molersformuleringer af G. roseum (Gm-2 eller Km-w ) lagret 2 uger ved 4°C.

Table 5.14. Control of F. culmorum by coating seeds of barley with two clay formulations of G. roseum (Gm-2 or Km-w) stored for 2 weeks at 4°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁷ sporer/ml
2) SI- værdier spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.
3) Formulering med molersproduktet GM-2 og ⁴) KM-w af IK726 konidier fra flydende fermentering i PDB+PEG₂₀₀ (L16)

Moler og sphagnum/klid

I tabel 5.15 er bekæmpelseseffekten af et molerspræparat sammenlignet med effekten af konidier fra sphagnum/klid. Det ses, at der ikke er signifikant forskel på de to formuleringstyper med hensyn til bekæmpelse af F. culmorum.

Tabel 5.15. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med præparater af G. roseum (IK726) formuleret med moler eller sphagnum/klid og lagret ved 4°C.

Table 5.15. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with of G. roseum formulated with clay or peat/bran and stored at 4°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁷ sporer/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.
3) ³)Formulering med molersproduktet GM-2 af konidier af IK726 fra flydende fermentering i PDB+PEG₂₀₀

5.2.3 Effekt af klæbemidler

Klæbemidler er ofte en vigtig ingrediens ved såvel kemisk som biologisk frøbejdsning. For biologiske midler kan disse polymerer have to funktioner dels (1) fasthæftning af sporer og dels (2) levere næringsstoffer eller på anden måde forbedre forholdene for antagonisten og dermed medvirke til forbedret bekæmpelseseffektivitet. I den sammenhæng ønskes en selektiv virkning, da patogenet ikke må drage nytte af næring m.m. fra klæbemidlet.

Middel og koncentration

Tre klæbemidler Teprosyn, Sepiret og Pelgel er tilsat bejdsesuspensioner af friskhøstede IK726 konidier, der er produceret ud fra flydende fermentering på PDB eller på PDB+PEG₂₀₀. Klæbemidlernes indflydelse på bekæmpelsen af F. culmorum er sammenlignet (Tabel 5.16). Teprosyn tilsat i koncentrationerne 10% og 15% (w/v) har influeret negativt på bekæmpelsen, således at bekæmpelsesprocenten med klæbemidlet kun er 40-50% mod 98% uden tilsætning af klæbemiddel. Sepiret i samme høje koncentrationer har derimod givet samme bekæmpelse som ved bejdsning med konidier i vandig suspension. Det samme er tilfældet for Pelgel (2% ,w/v). På grund af den negative effekt af Teprosyn, er der i de følgende undersøgelser kun fokuseret på Pelgel og Sepiret.

I tabel 5.17 vises resultater for SI, plantefremspiring og tørvægt samt estimering af cfu af IK726 pr. frø for behandlinger med Pelgel og Sepiret i doseringer på 1% og 2½ %(w/v). Midlerne har ikke influeret signifikant på hverken SI eller planteetablering, men der er dog en tendens til at klæbemidlerne har øget tilhæftningen af konidier på frøene fra 2.5 x 10³ cfu/frø til 3.1-5.5 x 10³ cfu/frø afhængig af klæbemiddel doseringen.

Tabel 5.16. Bekæmpelse af F. culmorum ved bejdsning af byg med friskhøstede konidier af G. roseum (IK726) i kombination med klæbemidlerne Teprosyn, Sepiret og Pelgel.

Table 5.16. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726) in combination with the stickers Teprosyn, Sepiret and Pelgel.

1)G. roseum opformeret på PDB,
2) G. roseum opformeret på PDB+PEG₂₀₀
3) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Tabel 5.17. Bekæmpelse af F. culmorum efter bejdsning af byg med konidier af G. roseum (IK726) fra et lagret sphagnum/klid præparat i kombination med klæbemidlerne Pelgel og Sepiret.

Table 5.17. Biological control of F. culmorum by coating seeds of barley with conidia of G. roseum (IK726) from a stored peat/bran preparation in combination with the stickers Sepiret and Pelgel.

1) SI- værdier, spiringsprocenter og tørvægts-værdier efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Som følge af at klæbemidler i sig selv kan influere negativt på bekæmpelsen af F. culmorum, er der udført forsøg, der har til formål at afsløre eventuelle positive eller negative additive effekter af klæbemidler samt 2 og 3-faktor vekselvirkninger med F. culmorum (patogen) og G. roseum (antagonist). Klæbemidlerne (Pelgel og Sepiret (1%, w/w)), er undersøgt for variablerne SI, plantefremspiring og plantetørvægt.

Pelgel

Variansanalyserne for to forsøg med Pelgel (Tabel 5.18) viser som forventet stærkt signifikante hovedfaktorvirkninger af antagonist og patogen samt vekselvirkning mellem disse for både SI og plantetørvægt. I eksperiment 2, er der desuden signifikans på 5%-niveauet for tilsætning Pelgel, som følge af et gennemsnitlig højere sygdomsindeks for bejdsebehandlinger hvor Pelgel indgår (SI=1.28) end for behandlinger uden tilsætning af Pelgel (SI=1.15) (Tabel 5. 19). I begge forsøg er der desuden signifikant vekselvirkning mellem Pelgel og patogen for både SI og tørvægt. Det kommer til udtryk som henholdsvis stigende SI og faldende plantetørvægt når F. culmorum smittede frø bejdses med Pelgel, mens den modsatte tendens gør sig gældende når frø uden F. culmorum bejdses med Pelgel (Tabel 5.19).

Tabel 5.18. P-værdier for variansanalyse af variablerne sygdomsindeks (SI) og tørvægt per plante for faktorerne patogen (F. culmorum), antagonist (G. roseum) og klæbemiddel (Pelgel) og deres vekselvirkninger.

Table 5.18. P-values for analysis of variance of the variables disease index (SI) plant dry weight for the factors pathogen (F. culmorum), antagonist (G. roseum) and sticker (Pelgel) and their interactions in two experiments.

*** =signifikans på <0.1%-niveauet,
** =signifikans på 1%-niveauet og
* = signifikans på 5%-niveauet.

Tabel 5.19. Effekten af frøbejdsning med G. roseum (IK726) og klæbe-midlet Pelgel på sygdomsindeks (SI) og plantetørvægt. Frøene er inokuleret med F. culmorum eller med vand (Exp. 2).

Table 5.19. Effect of coating seeds of barley with G. roseum (IK726) and the sticker Pelgel on disease index (SI) and shoot dry weight. Seeds were either inoculated with F. culmorum or with water, (Exp. 2)

*** =signifikans på <0.1%-niveauet,
** =signifikans på 1%-niveauet og
* = signifikans på 5%-niveauet.

Sepiret

For Sepiret er der også udført to forsøg efter samme forsøgsplan som for Pelgel. Det vil blandt andet sige med anvendelse af samme præparat af IK726 (L15, opt. C, lagret ved 20°C) og samme frøparti ("Paloma") ± F. culmorum smitte. Der ses igen stærkt signifikante hovedeffekter af patogen og antagonist og generelt også vekselvirkning mellem patogen og antagonist for både SI og plantetørvægt (Tabel 5.20). Derimod er der ingen signifikant effekt af Sepiret-bejdsning hverken for SI eller plantetørvægt. I eksp. 3. er der dog konstateret signifikant vekselvirkning mellem patogen og klæbemiddel, der kan erkendes ved en stigning i plantetørvægten for behandlinger af F. culmorum smittede frø efter bejdsning med Sepiret, mens der for Sepiret bejdsning i usmittede behandlinger er tendens til et fald i plantetørvægten (Tabel 5.21).

Spiring

Variansanalyser af begge klæbemidlernes effekt på plantefremspiring (resultater ikke vist) har vist, at der ikke er signifikante additive effekter af hverken Pelgel eller Sepiret og at ingen af klæbemidlerne indgår i signifikante vekselvirkning med patogen og antagonist.

Tabel 5.20. P-værdier for variansanalyse af variablerne sygdomsindeks (SI) og tørvægt per plante for faktorerne patogen (F. culmorum), antagonist (G. roseum) og klæbemiddel (Sepiret) og deres vekselvirkninger.

Table 5.20. P-values for analysis of variance of the variables disease index (SI) plant dry weight for the factors pathogen (F. culmorum), antagonist (G. roseum) and sticker (Sepiret) and their interactions in two experiments.

*** =signifikans på <0.1%-niveauet,
** =signifikans på 1%-niveauet og
* = signifikans på 5%-niveauet.

Tabel 5.21. Effekter af frøbejdsning med G. roseum (IK726) og klæbe-midlet Sepiret på sygdomsindeks (SI), plantetal og tørvægt pr plante. Frøene er inokuleret med F. culmorum eller med vand.

Table 5.21. Effect of coating seeds of barley with G. roseum (IK726) and the sticker Sepiret on disease index (SI), seedling stand and shoot dry weight. Seeds were either inoculated with F. culmorum or with water.

*** =signifikans på <0.1%-niveauet,
** =signifikans på 1%-niveauet og
* =signifikans på 5%-niveauet.

5.2.4 Bioassay med naturligt inficerede frø

I tabellerne 5.22 og 5.23 ses resultater fra bioassay, der er udført med henblik på at undersøge om naturlig frøbåren smitte med F. culmorum kan bekæmpes ved bejdsning med diverse formuleringer af IK726.

For de bioassay der hidtil er omtalt, er undersøgelserne baseret på, at frøene er kunstigt smittet med patogenet. Det skyldes primært, at det er vanskeligt at fremskaffe store partier af byg, der har en høj grad af naturlig F. culmorum uden samtidig at være inficeret med andre patogener. Det er derfor vigtigt at undersøge, om der er overensstemmelse mellem sygdomsbekæmpelse opnået i testsystemet med kunstig frøsmitte og den bekæmpelseseffekt der opnåes ved anvendelse af naturlig inficeret frø.

Bekæmpelsen af naturligt frøbårent inokulum af F. culmorum er undersøgt ved bejdsning med friske og lagrede konidier af IK726. Af tabel 5.22 fremgår det, at konidier fra sphagnum/klid inokulum lagret 4 uger ved 4°C bekæmper en kombination af naturligt frøbårent inokulum og kunstigt tilført inokulum meget effektivt (91% bekæmpelse) og at bekæmpelsen er fuldt på højde med effekten af friske konidier.

I tabel 5.23 ses resultater for bygsorten "Bamse", der er naturligt inficeret med F. culmorum (30% i blottertest). Bejdsning med konidier fra et sphagnum/klid præparat af IK726 lagret 3 uger ved 15°C giver en effektiv bekæmpelse af den naturlige frøsmitte, der ikke er signifikant forskellig fra bekæmpelseseffekten opnået med friskhøstede konidier af IK726.

Tabel 5.22. Bekæmpelse af en kombination af naturlig frøsmitte og inokulering med F. culmorum¹) i bioassay ved bejdsning af byg med friskhøstede konidier af G. roseum (IK726) og konidier fra et sphagnum/klid præparat lagret 4 uger ved 4°C.

Table 5.22. Effect of coating seeds naturally infected and inoculated with F. culmorum with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726) and conidia from a peat/bran formulation stored for 4 weeks at 4°C.

1) Frø af bygsorten "Alexis" naturligt inficeret med F. culmorum (30% infektion) er yderligere inokuleret med en sporesuspension F. culmorum (se afsnit.5.1)
2) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁶ konidie
3) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

Tabel 5.23. Bekæmpelse af F. culmorum i naturligt inficerede frø af bygsorten "Bamse" ved bejdsning med konidier af G. roseum (IK726). Der er anvendt bejdsesuspensioner af friskhøstede konidier og konidier fra et sphagnum/klid præparat (L4) lagret 3 uger ved 15°C.

Table 5.23. Effect of coating seeds naturally infected with F. culmorum with freshly harvested conidia of G. roseum (IK726) and conidia from a peat/ bran formulation (L4) stored for 3 weeks at 15°C.

1) Bejdsningssuspensionen af G. roseum er indstillet til 1 x 10⁶ konidier/ml
2) SI- værdier og spiringsprocenter efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncan's multiple range test.

5.2.5 Betydning af væksttemperatur for sygdomsudvikling og bekæmpelse

Vækstbetingelserne for korndyrkning i praksis vil under markforhold være stærkt varierende såvel indenfor en bestemt vækstsæson som mellem vækstsæsoner. Eksempelvis har jordbundstemperaturen under fremspiring stor indflydelse på, hvor hurtigt og hvor godt planterne etableres efter såning. Ved anvendelse af IK726 som biologisk bejdsemiddel til landbrugsafgrøder, må IK726 derfor være i stand til at udvise antagonisme overfor målpatogenet indenfor det temperatur- område, hvor patogenet kan inficere og sygdomsudvikling finder sted.

I figur 5.1 ses resultater fra tre bioassay, der er udført med henblik på at undersøge bekæmpelsen af F. culmorum ved bejdsning med G. roseum (IK726) ved stigende væksttemperatur. F. culmorum smittede frø er behandlet dels med vand og dels med konidier af IK726 Behandlede frø er herefter inkuberet i sand ved henholdsvis 10°C, 15°C og 20°C. Med stigende inkubationstemperatur udvikler Fusarium sig hurtigere og kraftigere og forårsager slutteligt et større sygdomsangreb. Således er sygdomsindekset kun 0.54 efter 28 døgn ved 10°C, men SI stiger kraftigt til 2.87 efter 19 døgn ved 15°C og til 2.99 efter 14 døgn ved 20°C. Bejdsning med IK726 har reduceret angrebet af F. culmorum signifikant ved alle temperaturer og bekæmpelseseffektiviteten er høj ved både lav og høj temperatur, idet bekæmpelsegraden er 83% ved 10°C , 95% ved 15° og 91% ved 20°C.

 (4 Kb)

5.2.6 Dosis-respons for sygdomsindeks

Udarbejdelse af dosis-respons kurver, der sammenholder doseringen af G. roseum (IK726) konidier på frøene med bekæmpelsen af F. culmorum, er nødvendig (1) dels for kunne fastlægge den effektive dosering og dels (2) for at undersøge stabiliteten i bekæmpelsen fra forsøg til forsøg.

Friske sporer

I figur 5.2 ses en doseringskurve for bejdsning med friskhøstede konidier af IK726, der er produceret ved flydende fermentering på PDB+PEG₂₀₀. Den procentvise bekæmpelse af F. culmorum er afbilledet som funktion af dosis af IK726 (cfu pr. frø). Data stammer fra 8 uafhængige bioassay der i figuren er afbilledet med forskellige signaturer. Det ses, at der er en signifikant (p<0.001) høj positiv korrelation mellem log₁₀ cfu/frø og bekæmpelsesprocenten (R=0.95). Ud fra den estimerede rette linie med formlen: Bekæmpelse (%) = 21 x log₁₀ (cfu/frø) + 9, kan det beregnes, at 80% bekæmpelse opnåes med 2.5 x 10³ cfu/frø.

Tørrede sporer

I figur 5.3 ses en tilsvarende doseringskurve for bejdsning med standardformulerede konidier af IK726, der er produceret på sphagnum/klid og lagret ved 4°C. Data stammer fra 13 uafhængige bioassay, der i figuren er afbilledet med forskellige signaturer. Det ses, at der også for lagrede konidier er en signifikant (p<0.001) positiv korrelation mellem log₁₀ cfu/frø og bekæmpelsesprocenten (R=0.73), dog ikke så høj som for friskhøstede konidier. Ud fra den estimerede rette linie med formlen: Bekæmpelse(%) = 27 x log₁₀ (cfu/frø) -19, kan det beregnes, at 80% bekæmpelse opnåes med 4.6 x 10³ cfu/frø.

 (3 Kb)

 (3 Kb)

5.2.7 Dosis-respons for planteetablering

En forudsætning for at IK726 med succes kan anvendes til frøbehandling er, at den effektive dosis ikke influerer negativt på plantespiring og -vækst. I tabel 5.24 og figur 5.4 ses resultater fra to bioassay, der er udført med henblik på at undersøge om stigende dosering af IK726 konidier på frø influerer på frøspiring og plantetørvægt. Bygfrø er inokuleret med vand eller med F. culmorum og både smittede og usmittede frø er bejdsede med stigende dosering af IK726 konidier (0, 10⁴, 10⁵, 10⁷ og 10⁸ konidier/ml). I eksperiment 1 er doseringen 10⁸ estimeret til 4 x 10⁴ cfu/frø og samme dosering er i eksperiment 2 estimeret til 1 x 10⁴ cfu/frø.

Frøsmitte med patogenet F. culmorum influerer signifikant på såvel spiring som tørvægt/plante (Tabel 5.24), idet spiring og især tørvægt reduceres når patogenet er tilstede (Fig. 5.4). Stigende dosis af IK726 konidier på frøene har ikke influeret signifikant på hverken spiring eller tørvægt /plante. Der er heller ikke fundet signifikant vekselvirkning mellem patogen og dosering af IK726 for de to testede variabler. Dog er der i begge eksperimenter tæt på at være signifikant vekselvirkning mellem antagonist og patogen på 5 %-niveaut for variablen tørvægt/plante (p=0.067). Det skyldes formodentlig, at tørvægten i F. culmorum inficerede behandlinger øges med stigende dosering af IK726, mens stigende doseringen af IK726 ikke påvirker tørvægten i usmittede behandlinger.

Tabel 5.24. P-værdierne for variansanalyse af variablerne spiring og tørvægt for faktorene F. culmorum smitte (F) og dosis af G. roseum (D) samt deres vekselvirknng (Fx D).

Table 5.24. P-values for analysis of variance of the variables seedling stand and seedling dry weight for the factors F. culmorum inokulation (F), dosage of G. roseum (D) and and their interaction (FxD).

1) Signifikans på : <0.1%-niveauet= *** , på 1%-niveauet=** , og på 5%-niveauet=*.

 (13 Kb)

Figur 5.4. Effekten af en stigende koncentration af G. roseum (konidier/ml) ved bejdsning af bygfrø med hensyn til plantefremspiring (1a og 2a) og tørvægt per plante (1b og 2b) for henholdsvis usmittede frø (vand) og frø smittet med Fusarium culmorum. De to eksperimenter er udført i vækstkammer.

Figure 5.4. Effect of coating seeds of barley with increased koncentration of Gliocladium roseum (conidia/ml) on seedling stand (1a & 2a) and seedling dry weight (1b & 2b),respectively, for seeds inoculated with Fusarium culmorum and for non-inoculated seeds (water) .

5.3. Opsummering og diskussion

En væsentlig forudsætning for at et biologiske bekæmpelsesmiddel kan anvendes med succes i jordbrugserhvervet er at den biologiske bekæmpelseseffekt er høj og reproducerbar når præparatet anvendes i praksis. Kvaliteten af IK726 præparater målt som bekæmpelseseffekti-vitet overfor F. culmorum og B. sorokiniana er derfor evalueret i en række kontrollerede klimakammerforsøg med bygplanter. Bekæmpelses-effekten er i forsøgene relateret til præparaternes formulering, lagertem-peratur og lagertid. Vigtige resultater er opsummeret og diskuteret nedenfor.

Lagring og formulering

For lagring ved 4°C har såvel standard som optimerede formuleringer af sphagnum/klid og molerspræparater udvist stabil og effektiv bekæmpelse af F. culmorum uanset om præparaterne er lagret få uger eller op til 11 måneder. For lagring ved 20°C er formuleringen af IK726 meget afgørende for opretholdelsen af en høj bekæmpelseseffekt. For standardformuleringer af sphagnum/klid er bekæmpelseseffektivitet stabil og høj de første 2 måneder efter lagring. Herefter falder effektiviteten signifikant med stigende lagertid. Der er dog stadigvæk efter 55 ugers lagring ved 20°C en lav men signifikant bekæmpelse i forhold til sygdomskontrollen.

Optimeret formulering

Med optimeret formulering er det derimod muligt at opretholde en høj og stabil bekæmpelseseffektivitet efter lagring ved 20°C i adskillige måneder. Det gælder både for sphagnum/klid og molerspræparater (Tabel 5.7, 5.8 og 5.13). Optimerede præparater af Type Alagret ved 20°C har således i en testperiode på 42 uger udvist høj bekæmpelses-effektivitet overfor F. culmorum. Optimeret præparat (Type A) lagret 29 uger ved 20°C har desuden udvist en bekæmpelseseffektivitet, der er helt på niveau med effekten af tilsvarende præparat lagret ved 4°C. Tre typer af optimeret formulering, nemlig Type A, B og C, er evalueret i bioassay. Efter langtidslagring af sådanne præparater ved 20°C har Type A formuleringen været mest effektiv i bekæmpelsen af F. culmorum.

Naturligt inficeret frø

I klimakammerforsøg med F. culmorum er der hovedsagelig benytte frø, der er kunstigt inokuleret med patogenet. Det skyldes primært, at der med denne metode reproducerbart opnåes et meget højt sygdomsangreb. Der er dog udført tests med frø naturligt inficeret med F. culmorum. Disse viser samstemmende, at effektiviteten af såvel friske som lagrede konidier af IK726 overfor naturlig frøsmitte er fuldt på højde med effektiviteten målt i assays med kunstig frøsmitte. Forsøg med bekæm-pelse af Bipolaris sorokiniana (se Kap. 6) har desuden yderligere bekræftet, at lagrede præparater af IK726 er i stand til at bekæmpe ino-kulum af patogener, der som F. culmorum og B. sorokiniana er lokalise-ret i frøets perikarp og inderavner. Den anvendte metoden med F. culmorum inokulering må derfor betragtes som værende velegnet til evaluering af IK726 præparaters bekæmpelseseffektivitet.

Klæbemidler

Klæbemidler er ofte en vigtig ingrediens ved såvel kemisk som biologisk frøbejdsning. For biologiske bejdsemidler kan disse polymerer have to hovedfunktioner: (1) forøge fasthæftningen af sporer og evt andet materiale der ønskes tilført og/eller (2) levere næringsstoffer, influere på pH eller på anden måde forbedre forholdene for antagonisten således at bekæmpelses-effektiviteten forøges og stabiliseres. I den sammenhæng ønskes en selektiv virkning, da patogenet ikke må drage nytte af næring mm. fra klæbemidlet (Harman et al., 1981; Nelson et al.,1988; Taylor & Harman, 1990; Wu, 1982). Ved tilsætning af Pelgel og Sepiret (1-2½% w/v) til konidiesuspensioner af IK726, er der en klar tendens til at antal cfu pr frø øges ved sammenligning med vandig suspension. I de udførte forsøg har klæbemidlerne dog ikke generelt resulteret i en bedre bekæmpelse af F. culmorum end opnået med IK726-bejdsning uden klæbemiddel. Ved bejdsning af mere glatte frøtyper som eksempelvis ært, vil tilsætning af klæbemidler til bejdsesuspensionen dog formodentlig have større betydning for, om konidierne tilhæftes og bliver siddende på frøene.

Valg af klæbemiddel

Valg af klæbemiddel kan være en afgørende faktor for bekæmpelses-effektiviteten som vist for bekæmpelse af Rhizotonia solani med Trichoderma harzianum (Wu, 1982). Det gælder også i nogen grad for IK726, idet tilsætning af klæbemidlet Teprosyn i doseringer på 10 og 15 % (w/v) gav en signifikant lavere bekæmpelse end ved tilsætning af Sepiret i samme doseringer (Tabel 5.16 ). I de udførte bioassay har bejdsning af F. culmorum smittede frø med Pelgel (± IK726) generelt giver lidt højere sygdomsindeks end når der alene er bejdset med vand (± IK726). Det kan skyldes, at patogenet udnytter Pelgel som nærings-kilde. Knudsen (1994) har da også vist, at Pelgel stimulerer vækst af både G. roseum og F. culmorum in vitro. Under markforhold har bejdsning med Pelgel dog ikke influeret signifikant på sygdomsniveauet af F. culmorum (se Kap 9, tabel 9.2). Pelgel er da også generelt et meget anvendt klæbemiddel til biologisk bejdsning (Taylor et al., 1991). Sepiret har ikke påvirket sygdomsudviklingen af F. culmorum hverken i bioassays (Tabel 5.21) eller i markforsøg (se Kap. 9, tabel 9.3). Ved sammen-ligning af Sepiret og Pelgel i markforsøg har der ikke været forskel på de to klæbemidler bekæmpelseseffektivitet overfor F. culmorum og begge midler synes således at være velegnede til biologisk bejdsning af korn med IK726. Kompatibilitet med klæbemidler kan vise sig at være en vigtig egenskab, såfremt IK726 integreres med nye eller eksisterende frøbehandlingsmetoder.

Dosis-respons for F.culmorum bekæmpelse

Ved praktisk anvendelse af IK726 til frøbejdsning er det nødvendigt at

have nøje kendskab til den dosis af antagonisten, der resulterer i en effektiv bekæmpelse af patogenet. Der er således udarbejdet dosis-respons kurver for sammenhængen mellem antal spiredygtige IK726 konidier på frøene og den procentvise bekæmpelse af F. culmorum. For konidier lagret ved 4°C er der en stærk lineær sammenhæng (r=0.73) mellem dosis (cfu/frø) og bekæmpelseseffektiviteten overfor F. culmorum, og det er estimeret, at ca. 5 x 10³ cfu/frø er tilstrækkelig for en effektiv bekæmpelse (>80%). For friskhøstede konidier er der ligeledes en stærk positiv lineær sammenhæng mellem dosis og bekæmpelse af F. culmorum (r=0.95) og den effektive dosis er af samme størrelsesorden. Det viser at bekæmpelseseffekten er reproducerbar for begge konidietyper og at effektiviteten af lagrede konidier generelt er lige så høj som for friskhøstede konidier ved tests i bioassays. Med hensyn til biologisk bekæmpelse af B. sorokiniana, har en dosering på 1 x 10⁴ cfu/frø af såvel friske som lagrede konidier af IK726 generelt givet en effektiv bekæmpelse (>80%). En dosering på ³10⁴ cfu/frø bør derfor være tilstrækkelig til at sikre en effektive beskyttelse mod begge frøbårne patogener.

Dosis-respons for planteetablering

Ved undersøgelser af direkte effekter af IK726 på plantevæksten, er der

for doseringer fra 10¹ til 4 x 10⁴ cfu/frø ikke fundet signifikante effekter på hverken plantefremspiring eller plantetørvægt. Det er således muligt at øge doseringen af IK726 på frø væsentligt, eksempelvis i forbindelse med bekæmpelse af andre patogener, uden at influere negativt på plante-etableringen.