Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frø

4 Undersøgelse af formulerede Gliocladium roseum konidiers spiringsaktivitet

4 Undersøgelse af formulerede Gliocladium roseum konidiers spiringsaktivitet
4.1 Materialer og metoder
4.2 Resultater
4.3 Diskussion

En væsentlig forudsætning for succesfuld anvendelse af biologiske bejdsemidler til effektiv bekæmpelse af patogener der angriber frøet er, at den aktive organisme i produktet aktiveres ved såning, og derefter er i stand til at kolonisere frøet. Generelt er de første 12-48 timer efter frøspiring meget kritisk for plantens videre udvikling. Infektionsmønstret for F. culmorum er således, at der dels kan ske angreb før frøet spirer og dels kan ske ret sent i spiringsprocessen, alt efter hvor patogenet er lokaliseret. For de ikke systemisk frøbårne patogener, der angriber extraembryonalt under spiringsprocessen, og for jordbårne patogener er især de tidligste fysiologiske ændringer induceret af frøets spiring, afgørende for om infektion af frøet lykkes eller mislykkes. Dette er specielt vigtigt for Pythium arter der forårsager "seed rotting" (Harman & Nelson, 1994). Propagules af Pythium spp. begynder at spire 0-4 timer efter såning og i løbet af 4-24 timer efter såning er frøkappen inficeret med Pythium (Taylor et al., 1991). Derimod begynder sporer eller mycelium af antagonistiske svampe generelt først at spire på frøets overflade 5-12 timer efter såning. Frøets kim er inficeret med Pythium spp. 24-40 timer efter såning. Det må dog understreges at spirings- og infektionshastigheder for patogene svampe arter varierer, og at Pythium spp. hører til de hurtigste. De repræsentative data, der er samlet af Harman & Nelson (1994) viser dog, at et frø er i farezonen umiddelbart efter såning og at antagonisten, der skal beskytte det, må reagere meget hurtigt for at "vinde slaget" mod patogenet.

Formål

Formålet med nærværende forsøg er at undersøge hvorledes produktion, nedtørring, formulering og lagring af G. roseum (IK726) influerer på konidiernes spiringsaktivitet in vitro og at sammenligne med Trichoderma harzianum, der er almindeligt anvendt til biologisk bekæmpelse.

4.1 Materialer og metoder

Der fremstilles G. roseum konidiesuspensioner, dels af friske konidier høstet fra PDB+PEG₂₀₀, og dels af lagrede konidier fra nedtørrede præparater, ved filtrering gennem polyestervæv, som beskrevet i afsnit 3.2.1. Sporesuspensioner af Trichoderma harzianum isolatet T3 (Wolffhechel, 1989) fremstilles ved høst fra PDA plader inkuberet 14 døgn ved stuetemperatur. Ved hjælp af en glasforstøver udsprøjtes konidiesuspensioner á 10⁶ sporer/ml på vandagar (1,5%). Der fremstilles 3 plader pr behandling. Pladerne inkuberes i mørke ved 20°C.

Forspiring

Det undersøges om præinkubering i sterilt vand influerer på spiringsprocent og spiringshastighed af lagrede konidier (L4, lagret 8 mdr. ved 4°C). Konidiesuspensioner fremstilles og henstår derefter 0, 1 eller 2 timer i vandig suspension (forspiring), inden udsprøjtning på vandagar.

Sucrose

Det undersøges om tilsætning af en carbonhydratkilde kan inducere flere konidier til at spire eller influere på spiringshastigheden. Suspensioner af konidier fra sphagnum/klid inokulum lagret 6 måneder ved 20°C tilsættes sucrose i forholdet 0.1% (w/v) og 1% (w/v). Suspensionerne inklusive en kontrol (vand) henstår 1 time inden udsprøjtning på vandagar.

Opgørelse af spiring

Konidiespiring opgøres efter 2-24 timers inkubation ved hjælp af lysmikroskopi. Fra hver skål udvælges en agarblok tilfældigt, hvorpå 100 konidier fra tilfældigt udvalgte synsfelter bedømmes med hensyn til spiring. En konidie regnes som spiret hvis spirehyfen er ½ gange den korteste diameter af konidien. Spiring angives enten som procent spirede konidier på et givent tidspunkt eller ved spiringshastigheden (raten). Alle konidier, der er i stand til at spire på agar, formodes endvidere at være spiret efter 24 timer inkubation (slutspiring) se figur 7.1. Spiringsraten til et givent tidspunkt (t) = ((Antal spirede konidier til tidspunktet (t) / slutspiringen) x 100).

4.2 Resultater

De viste resultater i figur 4.1 og tabel 4.1 og 4.2 omhandler udelukkende

spiring af konidier fra standardformuleringer af IK726, mens der i tabel 4.3 indgår en behandling med optimeret formulering (Type A). Optimering beskrives ikke i detaljer af hensyn til igangværende nyheds- og patenteringsundersøgelser.

Spiring i time- course

I figur 4.1. ses resultater af time-course forsøg for spiring af friskhøstede konidier og konidier fra sphagnum/klid inokulum lagret henholdsvis 5 uger (Figur 4.1 a) og 7 uger (Figur 4.1 b) ved 4°og 20°C. Det ses at 70-90% af de friske konidier er spirede allerede efter 12 timer, og at der ikke spirer yderligere konidier efterfølgende. Endvidere er 20-50% af de friske konidier spiret allerede efter 4 timer.

For konidier lagret ved 4°C er kun 50% af konidierne spiredygtige og for præparatet lagret ved 20°C er < 40% af konidierne i stand til at spire på vandagar indenfor 24 timer. Udover reduktion i spiredygtighed ved nedtørring og lagring ses også reduceret spiringshastighed. Et mål for hastigheden er den tid det tager for 50% af de spiredygtige konidier at spire. I eksperiment 1 (Figur 4.1 a) er det <3 t, 4½ og 5½ time for henholdsvis friske konidier, konidier lagret ved 4° og konidier lagret ved 20° C og i eksperiment 2 (Figur 4.1 b) er parametrene for spiringshastighed henholdsvis 6, 7½ og 9½ time for de ovennævnte konidietyper.

Forspiring i vand

Opgørelse af spiring efter 6 timers inkubation viser, at 1 til 2 timers præinkubering resulterer i en signifikant høje spiringsprocent i forhold til konidier uden forspiring (t=0) (Tabel 4.1). Præinkubering i vand influerer dog ikke signifikant på slutspiringen (24 t), idet 46-48% af konidiene er spiret uafhængig af forspiringsbehandling. Til sammenligning er 75% af de friske konidier spirede. Derimod er spiringsratent=₆ for lagrede konidier med 1 eller 2 timers forspiring af samme størrelsesorden (61-70%) som for friske konidier (70%)

Forspiring i sucrose

Som det fremgår af tabel 4.2 har forspiring af lagrede konidier i sucrose ikke fremmet hverken spiringsrate eller slutspiring af konidier, der har været lagret 24 uger ved 20°C.

Tabel 4.1. Effekten af forspiringtid (timer) i vand for lagrede konidier af G. roseum (IK726).

Table 4.1. The effect of preincubation (hours) in water of stored conidia of G. roseum (IK726).

1) Spiringsraten= (spirede konidier til tidspunktet t=6 t/slutspiringen, t=24 t) x 100).
2) Værdier for behandlingsgennemsnit indenfor en kolonne efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncans multiple range test.

Tabel 4.2. Spiring af G. roseum konidier lagret 24 uger ved 20°C. Konidierne er forspiret 1 time med stigende tilsætning af sucrose.

Table 4.2. Germination of G. roseum conidia stored for 24 weeks at 20°C in relation to 1 hours preincubation with increasing concentration of sucrose

1) Værdier for behandlingsgennemsnit indenfor en kolonneefterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige i henhold til Duncans multiple range test.

Formulering

Da shelf-life af konidier lagret ved 20°C i i standardformuleringer er utilfredsstillende, er det undersøgt hvordan optimeret formulering af et sphagnum/klid præparat influerer på spiringsaktiviteten på vandagar.

Som det fremgår af Tabel 4.3 er der ingen signifikant forskel i spiring efter 6 timer. Derimod er der efter 12 t signifikant forskel på spiring af konidier alt efter om disse er lagret ved 4° eller 20°C og med eller uden optimeret formulering. For lagring med optimeret formulering ved 20°C er ca. 27% af konidierne spiret, hvilket ikke er signifikant forskelligt fra spiring af konidier lagret ved 4°C, men derimod mere end dobbelt så høj som for konidier fra standardformuleringen lagret ved 20°C.

Slutspiringen ved optimeret formulering er dog signifikant lavere end for konidier lagret ved 4°C, men spiringsraten (12 t) er på højde med raten for lagring ved 4°C. Ved en sammenligning af spiringsraterne for IK726 generelt og friske T.harzianum sporer ses det endvidere, at selv de dårligst spirende konidier af IK726 spirer langt hurtigere end Trichoderma sporene, idet <1% af disse er spiret i løbet af 12 timers inkubation ved 20°C.

Tabel 4.3. Spiring på vandagar af G. roseum konidier lagret 18 uger og frisk høstede konidier af G. roseum og T. harzianum.

Table 4.3. Germination of G. roseum conidia stored for 18 weeks and freshly harvested conidia of G. roseum and T. harzianum on water agar.

1) Standardformulering af sphagnum/klid præparat.
2) I parentes er spiringsraten (%) angivet til t=6 og t=12 (Antal spirede konidier til tidspunktet (t) / slutspiringen)) x 100).
3) Optimeret formuleringen (Type A) af sphagnum/klid præparat.

4.3 Diskussion

Spiringsprocent

Ved nedtørring af G. roseum (IK726) konidier sker der en signifikant reduktion af spiringsprocenten ved sammenligning med friske konidier, hvor mere end 90% af konidierne som oftest er spiredygtige. Konidiers manglende tolerance overfor nedtørring er ikke specielt knyttet til G. roseum, idet lav nedtørringstolerance forekommer hos mange svampe-arter, hvor konidier udgør den aktive ingrediens i mikrobiologiske be-kæmpelsesmidler, eksempelvis Trichoderma spp. (Harman et al., 1991).

Ud fra undersøgelserne af IK726's konidiespiring på vandagar, er det ikke muligt at afgøre, om uspirede konidier er døde og/eller om de befinder sig i en hviletilstand. En række forspiringsbehandlinger i form af præ-inkubering i vand eller sucroseopløsninger blev afprøvet, for at undersøge om flere konidier kunne induceres til at spire. Ingen af de afprøvede behandlinger gav dog en forøget konidiespiring.

Spirehastighed

Nedtørring af G. roseum konidier resulterer i en signifikant reduktion i spiringshastigheden ved sammenligning med frisk høstede konidier, men både friske og tørrede konidier påbegynder spiring indenfor 4 timers inkubation på vandagar. Desuden reduceres spiringshastigheden af tørrede konidier med stigende lagertemperatur, men spiringshastigheden kan dog forøges signifikant ved hjælp af 1 times forspiring i vandig suspension. Spiringshastighederne for friske konidier af IK726 er af samme størrelsesorden som fundet for andre isolater af G. roseum. Sutton et al. (1997) fandt således en spiringsprocent på 70-90% for friske G. roseum konidier inkuberet 4-12 timer på bladstykker på agar ved høj luftfugtighed og 21-23°C.

Optimering

Reduktion i konidiernes levedygtighed og vitalitet som følge af lagring ved 20°C er en alvorlig hindring for at opnå et præparat, der kan markedsføres kommercielt. Det er dog muligt at stabilisere såvel spiringsprocent som spirehastighed af konidier lagret ved 20°C på et niveau, der nærmer sig niveauet for konidier lagret ved 4 °C (Tabel 4.3). Stabiliseringen er et resultat af optimeret formulering (Type A) af sphagnum/klid inokulum.

Det faktum, at konidier af IK726 har evnen til hurtig spiring kan vise sig at være en vigtig faktor for anvendelse af IK726 til frøbejdsning. Konidier af IK726, inklusive de nedtørrede konidier, spirer langt hurtigere end eksempelvis friske konidier af T. harzianum (T3). At T. harzianum spirer forholdsvis langsomt understreges også af vandagar spiringsundersøgelser udført af Lifshitz et al. (1986). Ved 19°C var ingen konidier spiret efter 10 timer og efter 26 timer var kun 26% spiret. Ved 26°C var 14% derimod spiret efter 10 timer og alle spiredygtige konidier (98%) var spiret efter 18 timer. Sammenligningen med T. harzianum er interessant, fordi denne antagonist indgår i flere af de kommercielle produkter, der anbefales til biologisk bejdsning mod f.eks. patogenet Pythium, der som nævnt indledningsvis er et meget hurtigt spirende patogen. Den relativt hurtige spiring af G. roseum konidier i forhold til andre mikrosvampe anvendt til biologisk bekæmpelse understøttes endvidere af Sutton & Peng (1993), der har vist, at konidier af G. roseum spirer signifikant hurtigere på bladskiver inkuberet på agar ved 10°C-20°C end konidier af T. viride og Penicillium sp.