Udvikling af et biologisk bejdsemiddel til frø

3 Undersøgelser af formulerede Gliocladium roseum præparaters shelf-life

3 Undersøgelse af formulerede Gliocladium roseum præparaters shelf-life
3.1 Materialer og metoder
3.2 Resultater
3.2.1 Substrat og standardformulering
3.2.2 Optimeret produktion og formulering
3.3 Diskussion og konklusion

Et biologisk bekæmpelsesmiddel, der kan lagres i en lang periode uden reduktion i produktets levedygtighed, har helt afgørende en større chance for at blive kommercielt rentabelt end et produkt med kort levetid.

Shelf-life

Biologiske produkters evne til stabilt at overleve lagrings -og distributions perioder benævnes som oftest 'shelf-life'. Ifølge Powell (1993) er det ideelt, hvis biologiske bekæmpelsesmidler har et shelf life på 2 år i et temperaturinterval fra -5° til 30°C. Vigtigheden af stabilt shelf-life understreges af erfaringer med "Dagger", der er baseret på bakterien Pseudomonas fluorecens og udviklet til bekæmpelse af rodbrand i bomuld. Dette produkt måtte trækkes ud af markedet netop på grund af utilstrækkelig shelf-life (Powell & Jutsum, 1993).

Levende organismer i form af svampe og bakterier, der udgør den aktive bestanddel i biologiske bekæmpelsesmidler, er meget følsomme overfor faktorer som temperatur og fugtighed; dels under produktions- og formuleringsprocessen og dels i lagrings - og distribueringsperioden (Connick et al., 1996; Moore et al., 1996).

Svampe, herunder også G. roseum, kan i årevis overleve i kultur-samlinger (isolatsamlinger) ved brug af f.eks nedfrysningsteknikker og overpodninger, såfremt det blot drejer sig om at holde liv i et bestemt isolat (Stanburry et al., 1995). For et produkt, hvor eksempelvis sporer skal udgøre den aktive bestanddel, er det derimod afgørende at bevare såvel høj kvantitet som kvalitet af produktet. Det bør sikres ved, at sporenes spiring forbliver høj samtidig med at deres vitalitet i form af bekæmpelseseffekt overfor patogener er intakt.

G. roseum

Der findes ikke i litteraturen tilgængelige undersøgelser over den kvantitative overlevelse af formulerede sporer for G. roseum. Sutton et al. (1997) anfører dog i en oversigtsartikel omhandlende G. roseum, at de er i stand til at lagre konidier, produceret på hvedekerner, uden signifikant tab af overlevelse i mere end 1 år, ved 3-5°C, og i op til 3 måneder ved 20-23°C. Dette er i tråd med erfaringer fra andre svampe anvendt til biologisk bekæmpelse af skadegørere, hvor overlevelse i tørre formuleringer (pulver, piller og granulater) generelt er stabil flere måneder ved 4°C, mens overlevelsen ved 20-25°C ofte reduceres signifikant i løbet af ganske få uger eller måneder (Dandurand & Knudsen, 1993; Moore et al.,1995).

Formål

Formålet med nærværende undersøgelser er at evaluere overlevelsen af Gliocladium roseum (IK726) i tørrede præparater. Herunder specielt at teste effekten af faktorerne (1) lagertid, (2) lagertemperatur indenfor temperaturområdet 4°C til 20°C, (3) produktionsforhold og formulering - herunder specielt optimeret formulering type A-D samt (4) eventuelle vekselvirkninger mellem disse faktorer.

3.1 Materialer og metoder

Overlevelsen af tørrede præparater af IK726 er undersøgt for lagerperioder, der løber over 45 uger (ca. 10 måneder) og op til 80 uger (ca. 20 måneder). Præparaterne er lagret ved en eller flere af følgende temperaturer: 4°, 10°, 15° og 20°C. Effekter af substratvalg og standard produktionsmetoder er undersøgt i en række lagerforsøg, hvor generelle forhold vedrørende produktion og formulering af præparater er detaljeret beskrevet i afsnit 2.1 (tabel 2.1) og afsnit 2.2. (tabel 2.9). Derudover er effekter af optimeret formulering undersøgt for en række præparater (Figur 3.6-3.10). Disse formuleringsmetoder er ikke beskrevet i rappor-ten, men blot angivet som optimeret formulering Type A, B, C og D. Optimering af produktionsmetoder (Figur 3.5, 3.7 og 3.8) er på samme måde angivet som Produktion 1, 2, 3 og 4. Det skyldes, at forhold vedrørende nyhedsværdi og patentering endnu ikke er afklaret, hvorfor metoder, der med stor sandsynlighed er patenterbare, beskyttes.

Prøveudtagning og test af overlevelse

For eksperimenter svarende til Figur 3.1-3.6 er der udtaget én prøver pr. behandling pr. testtidspunkt, mens der for eksperimenter svarende til Figur 3.7-3.10 er udtaget 2 prøver pr. testtidpunkt. Hver prøve består af ca. 0.05 g inokulum der udtages og afvejes sterilt. Prøven tilsættes 10 ml sterilt vand og whirlmixes 1 minut. Herefter fremstilles fortyndings-rækker og passende fortyndinger pladespredes på PDA. Metoden er beskrevet i detaljer i afsnit 2.1. Ud fra de aktuelle vejetal bestemmes antal cfu pr. g inokulum af IK726.

3.2 Resultater

I figurerne 3.1 til 3.10 ses en række overlevelseskurver for G. roseum (IK726), der illustrerer overlevelsen over tid som funktion af substrat, produktionsmetode, formulering og lagertemperatur. I alle figurer er overlevelsen angivet som logaritmen (log₁₀ ) til bestemmelsen af cfu pr. g præparat af IK726.

3.2.1 Substrat og standardformulering

En række lagringsforsøg er udført med henblik på at undersøge, hvordan valg af substrat til opformering af IK726 påvirker overlevelsen af tørrede præparater lagret ved 4°C. Substrater er testet dels enkeltvis og dels i specifikke kombinationer. Af overlevelseskurverne fremgår det, at overlevelsen er stabil i minimum 52 ugers ved 4°C og helt uafhængig af om substratet består af majsmel eller havregryn (Figur 3.1), sphagnum/klid (Figur 3.2-3.6), sphagnum/klid/majsmel (Figur 3.2) eller klid (Figur 3.3).

Lagertemperaturer fra 4°C til 20°C

I figurene 3.3 og 3.4 ses indflydelsen af stigende lagertemperatur på overlevelsen af IK726 i standardformuleringer af henholdsvis klid og sphagnum/klid inokulum. Ved en lagertemperatur på 10°C har overlevelsen som ved 4°C været stabil i over 1 år (Figur 3.4). Hæves temperaturen derimod til 15°C falder overlevelsen af IK726 typisk med en faktor 10⁴ over en 52 ugers lagerperiode for såvel klid som sphagnum/klid inokulum (Figur 3.3 og 3.4) og ved en lagertemperatur på 20°C reduceres overlevelsen i sphagnum/klid præparater endnu hurtigere (Figur 3.4)

 (3 Kb)

 (3 Kb)

 (3 Kb)

 (3 Kb)

3.2.2. Optimeret produktion og formulering

Som det fremgår af de foregående overlevelseskurver, er overlevelsen af IK726 ved 20°C ustabil og forholdsvis kortvarig når der anvendes standard produktions -og formuleringsmetoder. I det følgende beskrives resultater fra en række forsøg, hvor dels produktionsmetoden og dels formuleringen af antagonisten er optimeret. Procedurerne er ikke yderliger beskrevet og angives kun med typebetegnelse (Type A-D og Produktion 1-6) af hensyn til senere patenteringsmuligheder.

Effekten af produktionsmetode (Produktion 1 og 2) på overlevelsen af IK726 i sphagnum/klid er undersøgt ved 4°, 15° og 20°C. Som det fremgår af figur 3.5 er det et langt svagere fald i overlevelses af IK726 fra Produktion 1 lagret ved 15° og 20°C end for Produktion 2 lagret under tilsvarende forhold.

I figur 3.6 ses kurver for overlevelse i sphagnum/klid inokulum ved 4°C og 20°C. Som det fremgår af figuren, har optimeret formulering (Type A) over en periode på ca. 50 uger stabiliseret overlevelsesevnen af IK726 lagret ved 20°C på et niveau, der svarer til overlevelsen for lagring af præparat ved 4°C. For standardformuleringen af IK726 lagret ved 20°C, indtræffer der et fald i overlevelsen allerede efter ca.10 uger (Figur 3.6).

Produktionsmetodens (Produktion 3-6) indflydelse på overlevelsen af G. roseum efter lagring ved 20°C er undersøgt for to typer af formulering, nemlig Type B (Figur 3.7) og Type C (Figur 3.8). For Type C formuleringen er overlevelsen af IK726 over en periode på 40 uger påvirket af produktionsmetoden. Således falder overlevelsen kun med faktor 10 for produktion 6, mens der ses et fald på ca. faktor 1000 over den samme periode for produktion 3 og 4 (Figur 3.8). Ved anvendelse af optimeret formulering (Type B) sker der en signifikant stabilisering af overlevelsesevnen efter lagring ved 20°C for alle fire produktions-metoder, dog mest udtalt for produktion 3 (Figur 3.7)

 (3 Kb)

 (4 Kb)

 (3 Kb)

 (3 Kb)

 (3 Kb)

Molerspræparater

Betydningen af optimeret formulering er også undersøgt for molerspræparater (Figur 3.9 og 3.10). Ved anvendelse af optimeret formulering (Type C) af Ik726, er overlevelsesevnen ved 20° C blevet kraftigt stabiliseret, idet overlevelsen kun er reduceret med en faktor 10 efter 45 ugers lagring (Figur 3.9). Overlevelsen af et molers-præparat fremstillet på samme tidspunkt, men med standardformulering er derimod faldet til 0 efter kun 30 ugers lagring ved 20°C.

Kurverne i figur 3.10 viser resultaterne for overlevelse af IK726 i molerspræparater ved 20°C som funktion af produktionsmetoderne flydende og fast fermentering i kombination med tre formuleringstyper (standard, Type A og Type C). Optimeret formulering Type A resulterer i en meget stabil overlevelse for begge produktionsmetoder, idet 40-50% af konidierne er levende efter 11-12 måneders lagring ved 20°C. For Type C formuleringen er lagringsstabiliteten afhængig af produktions-metoden, idet overlevelsen i præparat produceret ved fast fermentering falder signifikant mindre (15% levende efter 11 måneder) end i præparatet produceret ved flydende fermentering (ca. 1% levende efter 11 måneder). I forsøget indgår desuden en standardformulering af IK726 opformeret ved fast fermentering. Denne behandling resulterer i det hurtigste og kraftigste fald i overlevelsesevnen ved sammenligning med de øvrige testede behandlinger (Figur 3.10).

 (5 Kb)

3.3 Diskussion og konklusion

I denne del af projektet er shelf-life for udvalgte præparater evalueret. Herunder indflydelsen af metoder til produktion og formulering af Gliocladium roseum (IK726) for lagerperioder op til 80 uger og ved lagertemperaturer fra 4°C til 20°C.

Lagring ved 4° og 10°C

Lagring af præparater af IK726 ved 4°-10°C kan tilsyneladende ske uden særlige krav til præparatets produktion og formulering. Shelf-life af IK726 har således været stabil i minimum 1 år ved 4°C helt uafhængig af om substratet består af majsmel eller havregryn (Tabel 3.1), sphagnum/ klid (Tabel 3.2-3.6), sphagnum/klid/majsmel (Tabel 3.2) eller klid (Tabel 3.3). En lignende stabil overlevelsesevne er fundet for konidier af G. roseum opformeret på hvedekerner, der kan overleve stabilt i mere end et år ved en lagertemperatur på 4°C (Sutton et al.,1997). Derimod fandt Peng et al. (1992) at shelf-life af G. roseum i en talkum/majsmel formulering blev reduceret med en faktor 2 efter 8 ugers lagring og at andelen af levende konidier efter 20 uger var faldet med en faktor 10, selvom præparatet blev lagret ved 4°C.

Lagring ved 20°C

Overlevelsesevnen for IK726 lagret ved 20°C er ustabil og forholdsvis kortvarig ved anvendelse af de standard produktions- og formulerings-metoder, der er fuldt tilstrækkelige for opretholdelse af højt shelf-life ved 4°C. For denne type præparater falder overlevelsen generelt markant efter 12-20 uger lagring ved 20°C. Sutton et al. (1997) har fundet en lignende sammenhæng mellem overlevelsesevne og lagring ved høj temperatur, idet konidier af et selekteret G. roseum isolat produceret på hvedekerner maksimalt kunne lagres i op til 3 måneder ved 20-23°C uden signifikant reduktion i konidiernes overlevelse.

Optimeret formulering

I bestræbelserne på at stabilisere shelf-life ved 20°C er der i projektperioden udviklet flere typer af optimeret formulering (Type A-D), der i varierende grad signifikant forbedrer shelf-life. Eksempelvis er det med Type A formuleringen muligt ved lagertemperaturen 20°C, at stabilisere shelf-life i en 11-12 måneders periode (Fig 3.6 og 3.10).

Produktionsmetode

Produktionsmetoden har påvirket lagerstabiliteten ved 20°C for præparattyper med optimeret formulering, nemlig Type A-C (Fig 3.7, 3.8 og 3.10). Præparat formuleret ud fra konidier fra fast fermentering giver eksempelvis et svagere fald i shelf-life over en 40 ugers periode end præparat formuleret med konidier fra flydende fermentering (Figur 3.10). Connick et al. (1996) fandt at granulater af Colletotrichum truncatum formuleret med konidier fra flydende fermentering havde kortere shelf-life ved 25°C end granulater formuleret med konidier fra fast fermentering (Bacto Emerson Yp Ss agar). Moñoz et al. (1995) har vist, at T. harzianum konidier fra fast fermentering har bedre overlevelse efter lagring ved høje temperaturer end konidier fra flydende fermentering. Undersøgelser tyder således samstemmende på, at sporer fra fast fermentering generelt er mere robuste end sporer fra flydende fermentering, idet de bedre tåler lagring ved høje temperaturer.

Konklusion

Ud fra et kommercielt set realistisk krav om at biologiske bekæmpelsesmidler bør kunne opbevares i minimum et år ved stuetemperatur uden væsentlige tab af shelf-life synes mulighederne for praktisk anvendelse af G. roseum (IK726) at være gode. Lagring af præparater af IK726 ved 4°-10°C kan ske uden særlige krav til præparatets produktion og formulering, idet shelf-life for alle testede præparattyper har været stabil i mere end et år. Stabilisering af shelf-life ved 20°C er vanskeligere. Men ved hjælp af optimerede produktions- og formuleringsmetoder, kan overlevelsesevnen i IK726 præparater opretholdes på et stabilt højt niveau i op til et år ved 20°C. Mulighederne for kommerciel udnyttelse af IK726 er derfor gode.